基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)解析慢性乙型肝炎苔白與苔黃患者生物學(xué)基礎(chǔ)差異一、引言1.1研究背景慢性乙型肝炎（ChronicHepatitisB，CHB）是一種由乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）持續(xù)感染引起的肝臟疾病，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)的肝硬化和肝癌。在我國(guó)，乙肝病毒攜帶者眾多，慢性乙型肝炎的防治形勢(shì)嚴(yán)峻。慢性乙型肝炎若得不到有效控制，病情會(huì)逐漸進(jìn)展，引發(fā)肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌。從慢性乙型肝炎發(fā)展為肝硬化的年發(fā)生率約為2%-10%，而肝硬化患者中每年有3%-6%會(huì)進(jìn)展為肝癌。這些嚴(yán)重的并發(fā)癥不僅給患者帶來(lái)極大的痛苦，也給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床上對(duì)于慢性乙型肝炎的診斷主要依賴(lài)于肝功能指標(biāo)檢測(cè)、乙肝病毒標(biāo)志物檢測(cè)以及影像學(xué)檢查等傳統(tǒng)方法。肝功能指標(biāo)如谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等可以反映肝臟細(xì)胞的損傷程度，但這些指標(biāo)的變化往往在肝臟已經(jīng)受到一定程度損害后才出現(xiàn)，不能及時(shí)準(zhǔn)確地反映疾病的早期階段和病情的細(xì)微變化。乙肝病毒標(biāo)志物檢測(cè)，如乙肝兩對(duì)半、HBVDNA定量等，雖然能明確病毒感染情況和病毒復(fù)制水平，但對(duì)于評(píng)估肝臟的整體病理生理狀態(tài)存在局限性。影像學(xué)檢查如超聲、CT等，對(duì)于肝臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變有較好的顯示，但對(duì)于肝臟內(nèi)部的分子生物學(xué)變化難以察覺(jué)。隨著生命科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)作為新興的組學(xué)技術(shù)，為慢性乙型肝炎的研究提供了新的視角和方法。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄本的測(cè)序和分析，可以全面了解細(xì)胞在不同生理和病理狀態(tài)下的基因表達(dá)譜，揭示基因的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路。代謝組學(xué)則是研究生物體在內(nèi)外環(huán)境因素作用下，其代謝產(chǎn)物變化規(guī)律的科學(xué)，通過(guò)對(duì)生物樣本（如血液、尿液、組織等）中的代謝物進(jìn)行定性和定量分析，能夠反映生物體的代謝狀態(tài)和生理病理變化，篩選出與疾病相關(guān)的代謝標(biāo)志物，深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制和病理生理過(guò)程。將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于慢性乙型肝炎的研究，可以從基因轉(zhuǎn)錄和代謝產(chǎn)物兩個(gè)層面，全面系統(tǒng)地揭示慢性乙型肝炎患者的生物學(xué)基礎(chǔ)和代謝組變化，為疾病的早期診斷、病情評(píng)估、治療方案的制定以及預(yù)后判斷提供更為準(zhǔn)確和全面的依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。中醫(yī)理論中，舌苔是中醫(yī)診斷疾病的重要依據(jù)之一，不同的舌苔表現(xiàn)往往反映了人體內(nèi)部不同的病理狀態(tài)。在慢性乙型肝炎患者中，苔白和苔黃是較為常見(jiàn)的兩種舌苔表現(xiàn)，它們可能與患者的病情、體質(zhì)以及疾病的發(fā)展階段等因素密切相關(guān)。然而，目前對(duì)于慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在生物學(xué)基礎(chǔ)和代謝組方面的差異研究相對(duì)較少。本研究旨在運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，深入探究慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的生物學(xué)差異和代謝組變化，為慢性乙型肝炎的中醫(yī)辨證論治提供科學(xué)的生物學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步豐富和完善慢性乙型肝炎的診療理論和方法體系。1.2研究目的與意義本研究的目的在于綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，深入剖析慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的生物學(xué)基礎(chǔ)，全面揭示二者在基因轉(zhuǎn)錄和代謝產(chǎn)物層面的差異，為慢性乙型肝炎的中醫(yī)辨證論治提供科學(xué)的生物學(xué)依據(jù)。具體而言，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對(duì)慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)和分析，篩選出差異表達(dá)的基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能，從而探究二者在生物學(xué)機(jī)制上的差異。利用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的血液、尿液等生物樣本中的代謝物進(jìn)行全面的定性和定量分析，篩選出差異代謝物，并通過(guò)代謝通路分析，揭示這些差異代謝物與慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)，以及它們?cè)谔Π缀吞S患者之間的代謝組變化特征。將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的研究結(jié)果相結(jié)合，深入探討慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的代謝通路變化和生物學(xué)基礎(chǔ)，從基因轉(zhuǎn)錄和代謝產(chǎn)物的角度，為慢性乙型肝炎的診斷、治療和預(yù)后判斷提供新的思路和方法。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，有助于深入理解慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制，揭示中醫(yī)舌苔辨證的生物學(xué)本質(zhì)，豐富和完善慢性乙型肝炎的中醫(yī)理論體系，為中醫(yī)辨證論治提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。中醫(yī)認(rèn)為舌苔是人體內(nèi)在生理病理變化的外在表現(xiàn)，通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)研究，可以從分子層面揭示不同舌苔表現(xiàn)所對(duì)應(yīng)的生物學(xué)變化，為中醫(yī)舌苔理論提供客觀的科學(xué)解釋。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果可為慢性乙型肝炎的早期診斷提供更為準(zhǔn)確和靈敏的生物學(xué)標(biāo)志物。傳統(tǒng)的診斷方法存在一定的局限性，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)研究篩選出的差異基因和代謝物，有可能成為新的診斷指標(biāo)，提高慢性乙型肝炎的早期診斷率，為患者的及時(shí)治療爭(zhēng)取時(shí)間。有助于為慢性乙型肝炎的個(gè)性化治療提供指導(dǎo)。不同舌苔表現(xiàn)的患者可能具有不同的生物學(xué)特征和代謝組變化，通過(guò)本研究可以深入了解這些差異，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)，提高治療效果，減少藥物不良反應(yīng)。還能為慢性乙型肝炎的預(yù)后判斷提供參考。通過(guò)對(duì)患者的基因轉(zhuǎn)錄和代謝組變化進(jìn)行分析，可以更好地評(píng)估患者的病情發(fā)展和預(yù)后情況，為患者的后續(xù)治療和管理提供科學(xué)的指導(dǎo)。二、慢性乙型肝炎及舌象研究概述2.1慢性乙型肝炎的基本情況慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒持續(xù)感染引發(fā)的肝臟慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及病毒感染、免疫反應(yīng)以及肝臟細(xì)胞損傷等多個(gè)方面。HBV屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，主要通過(guò)血液、母嬰和性接觸傳播。當(dāng)HBV侵入人體后，會(huì)特異性地感染肝臟細(xì)胞，病毒的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）會(huì)在肝細(xì)胞核內(nèi)形成穩(wěn)定的微染色體結(jié)構(gòu)，作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板，持續(xù)產(chǎn)生病毒RNA，進(jìn)而翻譯出病毒蛋白，進(jìn)行病毒的復(fù)制和組裝。人體的免疫系統(tǒng)在慢性乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在病毒感染初期，機(jī)體的固有免疫細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等會(huì)被激活，對(duì)感染病毒的肝細(xì)胞進(jìn)行攻擊，但這種免疫反應(yīng)往往不足以完全清除病毒。隨著病情的發(fā)展，適應(yīng)性免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞也會(huì)參與進(jìn)來(lái)。T淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）能夠識(shí)別并殺傷被病毒感染的肝細(xì)胞，然而，HBV可能會(huì)通過(guò)多種機(jī)制逃避CTL的識(shí)別和攻擊，導(dǎo)致病毒持續(xù)存在于體內(nèi)。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體雖然可以中和病毒，但也難以徹底清除病毒。長(zhǎng)期的免疫反應(yīng)導(dǎo)致肝臟反復(fù)發(fā)生炎癥，肝細(xì)胞不斷受損和修復(fù)，最終可能引發(fā)肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。從流行病學(xué)特征來(lái)看，慢性乙型肝炎呈世界性流行，但不同地區(qū)的流行強(qiáng)度存在顯著差異。全球約有2.57億慢性HBV感染者，在一些亞洲和非洲國(guó)家，由于衛(wèi)生條件相對(duì)較差、疫苗接種覆蓋率低等原因，慢性乙型肝炎的發(fā)病率較高。我國(guó)曾是HBV高流行區(qū)，雖然經(jīng)過(guò)多年的努力，通過(guò)廣泛開(kāi)展乙肝疫苗接種等措施，一般人群的HBsAg陽(yáng)性率已有所下降，但目前仍有大量的慢性乙型肝炎患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)慢性乙型肝炎患者大約有2000-3000萬(wàn)例，西部地區(qū)的流行率一般高于東部地區(qū)，鄉(xiāng)村的流行率高于城市。慢性乙型肝炎對(duì)人體健康危害極大。肝臟作為人體重要的代謝器官，受到病毒感染和炎癥損傷后，會(huì)導(dǎo)致肝功能異常，影響蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)等物質(zhì)的代謝。患者可能出現(xiàn)乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。隨著病情的進(jìn)展，肝纖維化逐漸加重，肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，發(fā)展為肝硬化。肝硬化患者常伴有腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。慢性乙型肝炎還是肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素之一，每年全球有數(shù)十萬(wàn)例肝癌患者死亡，其中大部分與慢性乙肝感染有關(guān)。因此，深入研究慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制和防治方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.2中醫(yī)對(duì)慢性乙型肝炎的認(rèn)識(shí)2.2.1中醫(yī)病因病機(jī)在中醫(yī)理論體系中，慢性乙型肝炎可歸屬于“脅痛”“黃疸”“積聚”“肝著”等范疇。其病因病機(jī)復(fù)雜，主要涉及正氣不足、外感邪氣以及臟腑功能失調(diào)等多個(gè)方面。正氣不足是慢性乙型肝炎發(fā)病的內(nèi)在基礎(chǔ)。中醫(yī)認(rèn)為，人體的正氣具有抵御外邪入侵、維持機(jī)體正常生理功能的作用。當(dāng)人體正氣虛弱時(shí)，機(jī)體的免疫功能下降，難以有效抵御外邪的侵襲，從而為乙肝病毒的入侵創(chuàng)造了條件。如《內(nèi)經(jīng)》所言：“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，充分強(qiáng)調(diào)了正氣在抵御疾病中的重要作用。在慢性乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程中，正氣不足可能與先天稟賦不足、后天調(diào)養(yǎng)失宜、過(guò)度勞累、久病耗傷等因素有關(guān)。先天稟賦不足者，其臟腑功能相對(duì)較弱，對(duì)疾病的抵抗力較差，容易感染乙肝病毒；后天調(diào)養(yǎng)失宜，如飲食不節(jié)、勞逸失度、情志不暢等，會(huì)損傷脾胃功能，導(dǎo)致氣血生化無(wú)源，正氣虧虛，進(jìn)而增加感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。外感邪氣，尤其是濕熱疫毒，是慢性乙型肝炎發(fā)病的重要外因。乙肝病毒具有濕熱疫毒的特性，當(dāng)人體正氣不足時(shí)，濕熱疫毒可通過(guò)多種途徑侵入人體，蘊(yùn)結(jié)于肝臟，導(dǎo)致肝臟功能失常。濕熱疫毒侵犯肝臟，可阻滯氣機(jī)，使肝氣失于疏泄，出現(xiàn)脅肋脹痛、胸悶不舒等癥狀；濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢，可引發(fā)黃疸，表現(xiàn)為身黃、目黃、小便黃等；濕熱之邪還可損傷脾胃，導(dǎo)致脾胃運(yùn)化功能失常，出現(xiàn)納差、腹脹、便溏等癥狀。若濕熱疫毒長(zhǎng)期羈留體內(nèi)，難以清除，病情就會(huì)遷延不愈，逐漸發(fā)展為慢性乙型肝炎。臟腑功能失調(diào)在慢性乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用。肝臟主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，若肝氣郁結(jié)，疏泄失常，可導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，瘀血內(nèi)生。瘀血阻滯肝絡(luò)，可加重肝臟的損傷，使病情進(jìn)一步發(fā)展。脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃功能正常則正氣充足，能抵御外邪。在慢性乙型肝炎患者中，常因濕熱疫毒侵犯脾胃，或肝氣橫逆犯脾，導(dǎo)致脾胃運(yùn)化功能受損，出現(xiàn)食欲不振、腹脹、乏力等癥狀。脾胃虛弱，又會(huì)影響氣血的生成和運(yùn)行，使正氣更加虧虛，難以清除體內(nèi)的病邪，從而形成惡性循環(huán)。此外，肝腎同源，肝陰不足可累及腎陰，導(dǎo)致肝腎陰虛；脾腎陽(yáng)虛也可在慢性乙型肝炎的病程中出現(xiàn)，進(jìn)一步加重病情的復(fù)雜性。2.2.2舌象在中醫(yī)診斷中的重要性舌象作為中醫(yī)望診的重要內(nèi)容，在中醫(yī)診斷疾病中具有舉足輕重的地位。中醫(yī)認(rèn)為，舌通過(guò)經(jīng)絡(luò)與臟腑密切相連，人體的氣血、津液、臟腑功能的變化均可反映在舌象上。正如《辨舌指南》所說(shuō)：“辨舌質(zhì)可辨五臟之虛實(shí)，視舌苔可察六淫之淺深?！鄙嘞竽軌蛑庇^地反映人體的生理病理狀態(tài)，為中醫(yī)診斷和辨證論治提供重要依據(jù)。正常的舌象應(yīng)為“淡紅舌，薄白苔”，即舌質(zhì)顏色淡紅，不深不淺，舌苔薄白均勻，干濕適中，不滑不燥。當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，舌象會(huì)相應(yīng)地出現(xiàn)變化。例如，外感邪氣時(shí)，舌苔可出現(xiàn)厚薄、潤(rùn)燥、顏色等改變；臟腑功能失調(diào)時(shí)，舌質(zhì)的顏色、形態(tài)以及舌苔的分布等也會(huì)發(fā)生異常。在慢性乙型肝炎的中醫(yī)診斷中，舌象的變化對(duì)于判斷病情、辨證論治具有重要的指導(dǎo)意義。其中，舌苔顏色是舌象變化的一個(gè)重要方面。苔白和苔黃是慢性乙型肝炎患者常見(jiàn)的兩種舌苔表現(xiàn)，它們與疾病的性質(zhì)、病情的輕重以及病邪的深淺密切相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，白苔多主寒證、表證。在慢性乙型肝炎患者中，若出現(xiàn)苔白，可能提示機(jī)體感受寒邪，或體內(nèi)陽(yáng)氣不足，寒濕內(nèi)生。例如，寒濕困脾型的慢性乙型肝炎患者，由于寒濕之邪阻滯脾胃，陽(yáng)氣被遏，常表現(xiàn)為舌苔白膩，伴有腹脹、便溏、肢體困重等癥狀。黃苔則多主熱證、里證。當(dāng)慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)苔黃時(shí)，往往表明體內(nèi)有熱邪，或濕熱蘊(yùn)結(jié)。如濕熱中阻型的慢性乙型肝炎患者，由于濕熱之邪蘊(yùn)結(jié)中焦，熏蒸肝膽，可出現(xiàn)舌苔黃膩，同時(shí)伴有脅肋脹痛、口苦、尿黃等癥狀。通過(guò)觀察舌苔的顏色，結(jié)合患者的其他癥狀和體征，中醫(yī)醫(yī)生可以判斷疾病的性質(zhì)和發(fā)展階段，從而制定相應(yīng)的治療方案。此外，舌苔的厚薄、潤(rùn)燥、腐膩等特征也能反映慢性乙型肝炎患者的病情變化。舌苔薄者，多提示病邪較輕，病情較淺；舌苔厚者，則表示病邪較重，病情較深。舌苔潤(rùn)燥可反映體內(nèi)津液的盈虧情況，若舌苔干燥，提示津液虧損；舌苔滑潤(rùn)，則表示津液充足或體內(nèi)有濕邪。舌苔腐膩與脾胃運(yùn)化功能密切相關(guān)，腐苔多為食積胃腸，濁氣上泛所致；膩苔則多見(jiàn)于濕濁、痰飲等邪氣內(nèi)盛。在慢性乙型肝炎的診療過(guò)程中，綜合分析舌象的各種特征，能夠更全面、準(zhǔn)確地了解患者的病情，為中醫(yī)辨證論治提供有力的支持。三、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用3.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理與應(yīng)用3.1.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)是指在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，它旨在分析特定細(xì)胞、組織或生物體在某個(gè)特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA，包括信使RNA（mRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）以及各種非編碼RNA（如微小RNA（miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）等）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠全面揭示基因的表達(dá)譜，了解基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、可變剪接形式以及基因表達(dá)的時(shí)空特異性等信息，為深入研究基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供了有力的工具。RNA-SEQ（RNAsequencing），即RNA測(cè)序技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。其基本原理是利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)胞或組織中的RNA進(jìn)行測(cè)序，從而獲得轉(zhuǎn)錄組的全貌。具體流程如下：首先進(jìn)行樣本準(zhǔn)備，從研究對(duì)象的細(xì)胞、組織或生物體液中提取總RNA。在總RNA中，rRNA占比高達(dá)80%-90%，而mRNA等其他RNA的含量相對(duì)較低。為了提高測(cè)序效率和準(zhǔn)確性，需要對(duì)RNA進(jìn)行預(yù)處理，去除rRNA，富集mRNA。對(duì)于真核生物，常利用mRNA具有poly(A)尾的特點(diǎn)，使用帶有poly(T)探針的磁珠與總RNA進(jìn)行雜交，從而特異性地捕獲mRNA；對(duì)于原核生物或研究全轉(zhuǎn)錄組時(shí)，可采用去除rRNA的方法。接著進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建，將富集得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)超聲波或酶切等方法將cDNA片段化，在片段兩端加上特定的接頭序列，形成適合測(cè)序的文庫(kù)。最后，將構(gòu)建好的文庫(kù)在高通量測(cè)序平臺(tái)（如Illumina、ThermoFisher的IonTorrent等）上進(jìn)行測(cè)序。Illumina測(cè)序平臺(tái)采用邊合成邊測(cè)序的技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中，帶有不同熒光標(biāo)記的dNTP按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則依次添加到新合成的DNA鏈上，每添加一個(gè)堿基，通過(guò)激光掃描檢測(cè)熒光信號(hào)，從而確定堿基的種類(lèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)cDNA片段的測(cè)序。測(cè)序完成后，得到的是大量的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（reads），這些數(shù)據(jù)需要經(jīng)過(guò)一系列的生物信息學(xué)分析才能轉(zhuǎn)化為有生物學(xué)意義的信息。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，去除低質(zhì)量的reads、接頭序列以及污染序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。然后將cleanreads與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì)，確定每個(gè)read在基因組上的位置，進(jìn)而計(jì)算每個(gè)基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，常用的量化指標(biāo)有FPKM（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionmappedreads）或TPM（TranscriptsPerMillion）。通過(guò)比較不同樣本間基因的表達(dá)水平，篩選出差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，例如GO（GeneOntology）富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，以了解這些基因參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能，揭示基因之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3.1.2在疾病研究中的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)在疾病研究中具有廣泛的應(yīng)用，為深入理解疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了重要的依據(jù)。在基因表達(dá)分析方面，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠全面檢測(cè)疾病狀態(tài)下基因表達(dá)的變化。通過(guò)比較疾病患者與健康對(duì)照者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以篩選出差異表達(dá)基因，這些基因可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在癌癥研究中，許多癌基因和抑癌基因的表達(dá)水平在腫瘤組織中發(fā)生顯著改變。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)某些癌癥相關(guān)基因的高表達(dá)或低表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的生存率密切相關(guān)。這些差異表達(dá)基因不僅可以作為潛在的生物標(biāo)志物用于癌癥的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)，還為癌癥的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)在疾病機(jī)制研究中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析和富集分析，可以揭示疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中涉及的關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者大腦中與神經(jīng)遞質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、淀粉樣蛋白沉積等相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。這些基因的異常表達(dá)參與了阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程，為深入了解疾病的病理機(jī)制提供了重要線索。通過(guò)構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可以進(jìn)一步探究基因之間的相互作用關(guān)系，揭示疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)為疾病的診斷和分型提供了新的方法。傳統(tǒng)的疾病診斷方法往往依賴(lài)于臨床癥狀、體征以及一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢查，存在一定的局限性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以通過(guò)檢測(cè)疾病特異性的基因表達(dá)譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期診斷和精準(zhǔn)分型。在一些罕見(jiàn)病的診斷中，由于疾病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)診斷方法難以確診。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序能夠快速、全面地檢測(cè)患者基因組中的突變和基因表達(dá)變化，幫助醫(yī)生準(zhǔn)確診斷疾病，為患者提供及時(shí)有效的治療。在腫瘤診斷中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)特征，將腫瘤分為不同的亞型，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。不同亞型的腫瘤可能對(duì)不同的治療方法具有不同的敏感性，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分型，可以選擇最適合患者的治療方案，提高治療效果。在藥物研發(fā)和治療效果評(píng)估方面，轉(zhuǎn)錄組學(xué)也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在藥物研發(fā)過(guò)程中，通過(guò)分析藥物作用后細(xì)胞或動(dòng)物模型的轉(zhuǎn)錄組變化，可以了解藥物的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)。研究人員可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選出對(duì)藥物敏感的細(xì)胞系或動(dòng)物模型，進(jìn)行藥物療效和安全性的評(píng)價(jià)。在臨床治療中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以用于監(jiān)測(cè)患者治療前后基因表達(dá)的變化，評(píng)估治療效果。如果患者在接受治療后，與疾病相關(guān)的差異表達(dá)基因恢復(fù)到正常水平，或者某些關(guān)鍵信號(hào)通路的活性得到調(diào)節(jié)，說(shuō)明治療有效；反之，則可能需要調(diào)整治療方案。轉(zhuǎn)錄組學(xué)還可以預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的不良反應(yīng)，通過(guò)分析患者的轉(zhuǎn)錄組特征，識(shí)別出可能對(duì)藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)的個(gè)體，提前采取措施，降低藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率。3.2代謝組學(xué)技術(shù)原理與應(yīng)用3.2.1代謝組學(xué)技術(shù)原理代謝組學(xué)技術(shù)旨在對(duì)生物體系內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面、定性和定量分析，以揭示生物體在生理或病理狀態(tài)下的代謝變化規(guī)律。代謝組學(xué)研究的對(duì)象是生物樣本（如血液、尿液、組織、細(xì)胞培養(yǎng)液等）中的小分子代謝物，其分子量通常小于1000Da，這些代謝物參與了生物體的各種代謝途徑，是基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能的最終產(chǎn)物，能夠直接反映生物體的生理狀態(tài)和對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化的響應(yīng)。超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）是代謝組學(xué)研究中常用的技術(shù)平臺(tái)之一。超高效液相色譜（UPLC）利用小粒徑色譜填料（通常為1.7μm）和高壓輸液系統(tǒng)，顯著提高了色譜分離效率和分析速度。與傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）相比，UPLC具有更高的柱效、更快的分析速度和更好的靈敏度，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中代謝物的高效分離。在UPLC中，樣品通過(guò)進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜柱，流動(dòng)相在高壓驅(qū)動(dòng)下攜帶樣品在色譜柱中進(jìn)行分離。由于不同代謝物在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同，它們?cè)谏V柱中的遷移速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)了分離。三重四極桿質(zhì)譜（MS/MS）則是一種強(qiáng)大的檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)Ψ蛛x后的代謝物進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定。MS/MS主要由離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器組成。離子源的作用是將分離后的代謝物分子離子化，常用的離子源有電噴霧離子源（ESI）和大氣壓化學(xué)離子源（APCI）。ESI通過(guò)在強(qiáng)電場(chǎng)作用下使溶液中的樣品分子形成帶電液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，最終形成氣態(tài)離子；APCI則是通過(guò)放電使空氣中的氮?dú)獾葰怏w離子化，這些離子與樣品分子發(fā)生碰撞，使樣品分子離子化。離子化后的代謝物離子進(jìn)入質(zhì)量分析器，質(zhì)量分析器根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對(duì)離子進(jìn)行分離和檢測(cè)。三重四極桿質(zhì)量分析器由三個(gè)四極桿組成，第一個(gè)四極桿（Q1）作為質(zhì)量過(guò)濾器，選擇特定質(zhì)荷比的母離子進(jìn)入第二個(gè)四極桿（Q2）；Q2中，母離子在碰撞誘導(dǎo)解離（CID）作用下發(fā)生裂解，產(chǎn)生一系列碎片離子；第三個(gè)四極桿（Q3）對(duì)這些碎片離子進(jìn)行質(zhì)量分析和檢測(cè)。通過(guò)對(duì)母離子和碎片離子的質(zhì)荷比及相對(duì)豐度的分析，可以獲得代謝物的結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物的定性和定量分析。在代謝組學(xué)研究中，利用UPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行分析時(shí)，首先需要對(duì)生物樣本進(jìn)行預(yù)處理，以提取和富集其中的代謝物。常用的預(yù)處理方法包括液-液萃取、固相萃取、蛋白沉淀等。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的樣本注入U(xiǎn)PLC系統(tǒng)進(jìn)行分離，分離后的代謝物進(jìn)入MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。得到的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)包含了大量的信息，需要通過(guò)專(zhuān)門(mén)的軟件和算法進(jìn)行處理和分析。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括去除噪聲、基線校正、峰識(shí)別和積分等操作，以獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)。然后進(jìn)行代謝物的定性分析，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)（如METLIN、HMDB等）中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，或者利用二級(jí)質(zhì)譜碎片信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，確定代謝物的種類(lèi)。最后進(jìn)行定量分析，根據(jù)代謝物的峰面積或峰強(qiáng)度，結(jié)合內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法，計(jì)算代謝物在樣本中的相對(duì)或絕對(duì)含量。通過(guò)對(duì)不同樣本中代謝物含量的比較，篩選出差異代謝物，并進(jìn)一步通過(guò)代謝通路分析等方法，探究這些差異代謝物與疾病發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。3.2.2在疾病研究中的應(yīng)用代謝組學(xué)在疾病研究領(lǐng)域具有廣泛而重要的應(yīng)用，為深入探究疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、治療效果評(píng)估以及預(yù)后判斷提供了有力的技術(shù)支持和全新的研究思路。在尋找疾病生物標(biāo)志物方面，代謝組學(xué)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。生物標(biāo)志物是指能夠反映生物體生理或病理狀態(tài)的一類(lèi)物質(zhì)，可用于疾病的診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。通過(guò)對(duì)疾病患者和健康對(duì)照者的生物樣本（如血液、尿液等）進(jìn)行代謝組學(xué)分析，能夠篩選出在疾病狀態(tài)下顯著變化的代謝物，這些代謝物有可能成為疾病的生物標(biāo)志物。在糖尿病研究中，通過(guò)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，一些與糖代謝、脂代謝相關(guān)的代謝物，如血糖、胰島素、甘油三酯、脂肪酸等，在糖尿病患者體內(nèi)的水平與健康人群存在顯著差異。這些代謝物不僅可以作為糖尿病診斷的輔助指標(biāo)，還能用于監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展和治療效果。在腫瘤研究中，代謝組學(xué)也發(fā)現(xiàn)了許多潛在的腫瘤標(biāo)志物。例如，在前列腺癌患者的尿液中，某些代謝物如肌氨酸、檸檬酸等的含量發(fā)生了明顯變化，這些代謝物可作為前列腺癌早期診斷和病情監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)有助于深入研究疾病的代謝通路變化。代謝通路是指細(xì)胞內(nèi)一系列連續(xù)的酶促反應(yīng)，通過(guò)這些反應(yīng)，生物體將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量和生物分子，維持生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。當(dāng)機(jī)體發(fā)生疾病時(shí)，代謝通路會(huì)出現(xiàn)異常改變。代謝組學(xué)可以通過(guò)對(duì)差異代謝物的分析，追溯其參與的代謝通路，從而揭示疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中代謝網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)情況。在心血管疾病研究中，代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸β-氧化、三羧酸循環(huán)、嘌呤代謝等代謝通路在冠心病患者中發(fā)生了顯著變化。這些代謝通路的異常與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入了解這些變化有助于揭示心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)和藥物提供理論依據(jù)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，代謝組學(xué)也發(fā)現(xiàn)了一些與神經(jīng)遞質(zhì)代謝、能量代謝相關(guān)的代謝通路在阿爾茨海默病、帕金森病等疾病中出現(xiàn)異常，為這些疾病的治療提供了新的方向。代謝組學(xué)還可用于疾病的診斷和鑒別診斷。傳統(tǒng)的疾病診斷方法往往依賴(lài)于臨床癥狀、體征以及一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢查，這些方法在疾病早期或癥狀不典型時(shí)，容易出現(xiàn)誤診或漏診。代謝組學(xué)通過(guò)分析疾病特異性的代謝指紋圖譜，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)疾病的早期診斷和精準(zhǔn)鑒別。在肝病診斷中，通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者的血清代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不同疾病階段具有獨(dú)特的代謝物特征。利用這些特征建立的代謝組學(xué)診斷模型，可以準(zhǔn)確地區(qū)分不同類(lèi)型的肝病，提高診斷的準(zhǔn)確性。在一些罕見(jiàn)病的診斷中，由于疾病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)診斷方法難以確診。代謝組學(xué)技術(shù)能夠快速、全面地檢測(cè)患者體內(nèi)的代謝物變化，為罕見(jiàn)病的診斷提供重要線索。在藥物研發(fā)和治療效果評(píng)估方面，代謝組學(xué)也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在藥物研發(fā)過(guò)程中，代謝組學(xué)可以用于研究藥物的作用機(jī)制，通過(guò)分析藥物作用后生物樣本中代謝物的變化，了解藥物對(duì)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，從而發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)。代謝組學(xué)還可以用于評(píng)估藥物的毒性，通過(guò)檢測(cè)藥物處理后動(dòng)物或細(xì)胞模型中代謝物的變化，預(yù)測(cè)藥物可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。在臨床治療中，代謝組學(xué)可以監(jiān)測(cè)患者治療前后代謝物的變化，評(píng)估治療效果。如果患者在接受治療后，與疾病相關(guān)的差異代謝物恢復(fù)到正常水平，或者某些關(guān)鍵代謝通路的活性得到調(diào)節(jié)，說(shuō)明治療有效；反之，則可能需要調(diào)整治療方案。在腫瘤化療中，代謝組學(xué)可以通過(guò)分析患者血液或尿液中的代謝物變化，預(yù)測(cè)患者對(duì)化療藥物的敏感性和耐藥性，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。四、研究設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為慢性乙型肝炎患者，所有患者均來(lái)自[醫(yī)院名稱(chēng)]的肝病科門(mén)診及住院部。慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》，具體如下：HBsAg陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上，或有明確的急性乙型肝炎病史超過(guò)6個(gè)月仍未痊愈；HBVDNA陽(yáng)性；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）持續(xù)或反復(fù)異常，或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變。對(duì)于苔白和苔黃患者的納入標(biāo)準(zhǔn)，由至少兩名具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的中醫(yī)醫(yī)生依據(jù)《中醫(yī)診斷學(xué)》中舌象的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。苔白患者納入標(biāo)準(zhǔn)為舌苔白色，薄白苔或白膩苔，無(wú)明顯黃色苔；苔黃患者納入標(biāo)準(zhǔn)為舌苔黃色，薄黃苔、黃膩苔或焦黃苔。同時(shí)，納入的患者年齡需在18-65歲之間，簽署知情同意書(shū)，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：合并其他類(lèi)型肝炎病毒感染，如甲型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒等；患有其他嚴(yán)重肝臟疾病，如酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、肝癌等；近期（3個(gè)月內(nèi)）接受過(guò)抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療或其他可能影響肝臟功能和代謝的治療；患有嚴(yán)重的心、腦、肺、腎等重要臟器疾??；妊娠或哺乳期婦女；精神疾病患者，無(wú)法配合完成研究。正常對(duì)照組選擇同期在[醫(yī)院名稱(chēng)]進(jìn)行健康體檢的人群，體檢項(xiàng)目包括肝功能、乙肝五項(xiàng)、腹部超聲等，結(jié)果均正常，且無(wú)肝臟疾病史、無(wú)慢性病史、無(wú)藥物過(guò)敏史，舌象表現(xiàn)為正常的淡紅舌、薄白苔。正常對(duì)照組的年齡、性別與慢性乙型肝炎患者組相匹配，以減少混雜因素的影響。在納入研究前，所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象均需詳細(xì)填寫(xiě)病史問(wèn)卷，包括既往疾病史、家族病史、生活習(xí)慣（如吸煙、飲酒等）、用藥情況等信息，以便后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和研究。4.2樣本采集與處理本研究中，外周血樣本的采集均在清晨患者空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行，以確保樣本的穩(wěn)定性和一致性。使用含有乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑的真空采血管，采集每位實(shí)驗(yàn)對(duì)象的外周靜脈血5mL。采集過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，先用碘伏對(duì)采血部位進(jìn)行消毒，待干燥后進(jìn)行穿刺采血。采血完成后，立即將采血管輕輕顛倒混勻5-8次，使血液與抗凝劑充分混合，防止血液凝固。采集后的外周血樣本在30分鐘內(nèi)進(jìn)行初步處理。首先，將樣本置于離心機(jī)中，在4℃條件下，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。離心后，血液會(huì)分層為上層淡黃色的血漿、中層灰白色的白細(xì)胞層以及下層暗紅色的紅細(xì)胞層。使用移液器小心地吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP管中，每管分裝1mL。對(duì)于白細(xì)胞層，采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步分離淋巴細(xì)胞。將適量的淋巴細(xì)胞分離液加入到含有白細(xì)胞層的離心管中，輕輕混勻后，再次在4℃條件下，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。離心后，吸取位于淋巴細(xì)胞分離液界面上的白色云霧狀淋巴細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，用PBS緩沖液洗滌2-3次，去除殘留的紅細(xì)胞和雜質(zhì)。處理后的血漿和淋巴細(xì)胞樣本，一部分用于即時(shí)檢測(cè)，另一部分用于長(zhǎng)期保存。用于保存的樣本，加入適量的RNA保護(hù)劑，充分混勻后，置于-80℃超低溫冰箱中保存。在樣本保存過(guò)程中，避免樣本反復(fù)凍融，以防止RNA降解和代謝物的變化。對(duì)于需要運(yùn)輸?shù)臉颖?，采用干冰運(yùn)輸?shù)姆绞剑_保樣本在運(yùn)輸過(guò)程中始終處于低溫狀態(tài)，保證樣本的質(zhì)量。4.3轉(zhuǎn)錄組分析4.3.1RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)從上述采集并處理后的淋巴細(xì)胞樣本中提取總RNA，選用TRIzol試劑法進(jìn)行提取，該方法利用TRIzol試劑能夠有效裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)分離。具體操作步驟如下：將適量的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP管中，加入1mLTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2mL的氯仿，蓋緊管蓋后，手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒，15-30℃孵育2-3分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物充分解離。隨后在4℃下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，此時(shí)混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無(wú)色水相上層，RNA全部被分配于水相中。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后15-30℃孵育10分鐘，使RNA沉淀。在4℃下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPC-H2O配制），清洗RNA沉淀，混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后，加入適量無(wú)RNA酶的水，用槍反復(fù)吹打幾次，使RNA沉淀完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA提取完成后，需對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)。采用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm和280nm處的吸光值，以評(píng)估RNA的濃度和純度。根據(jù)公式A260下讀值為1表示40μgRNA/mL，計(jì)算樣品RNA濃度(μg/mL)=A260×稀釋倍數(shù)×40μg/mL。例如，若RNA溶于40μLDEPC水中，取5μL，1:100稀釋至495μL的TE中，測(cè)得A260=0.21，則RNA濃度=0.21×100×40μg/mL=840μg/mL或0.84μg/μL。RNA溶液的A260/A280的比值用于衡量RNA純度，理想的比值范圍在1.8-2.1之間。若比值低于1.8，表明可能存在蛋白質(zhì)或酚類(lèi)物質(zhì)污染；若比值高于2.1，可能提示RNA有降解。利用變性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。制膠時(shí)，將1g瓊脂糖溶于72mL水中，冷卻至60℃后，加入10mL的10×MOPS電泳緩沖液和18mL的37%甲醛溶液(12.3M)，灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25μL溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加入足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。準(zhǔn)備RNA樣品時(shí)，取3μgRNA，加入3倍體積的甲醛上樣染液，再加入EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/mL，加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。上樣前凝膠須預(yù)電泳5分鐘，隨后將樣品加入上樣孔，在5-6V/cm電壓下電泳2小時(shí)，直至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。在紫外透射光下觀察并拍照，正常情況下，28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，且上面一條帶（28S）的密度大約是下面一條帶（18S）的2倍，還可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。若RNA制備過(guò)程中出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶；RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。只有通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)，確保RNA的濃度、純度和完整性符合要求的樣本，才會(huì)用于后續(xù)的RNA-SEQ測(cè)序分析。4.3.2RNA-SEQ測(cè)序與數(shù)據(jù)分析將質(zhì)量合格的RNA樣本送往專(zhuān)業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行RNA-SEQ測(cè)序。測(cè)序流程首先進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，利用mRNA具有poly(A)尾的特點(diǎn)，使用帶有poly(T)探針的磁珠與總RNA進(jìn)行雜交，特異性地捕獲mRNA。隨后將捕獲的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)超聲波或酶切等方法將cDNA片段化，在片段兩端加上特定的接頭序列，構(gòu)建成適合測(cè)序的文庫(kù)。將構(gòu)建好的文庫(kù)在IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為150bp。測(cè)序完成后，得到大量的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（rawreads），需要對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析。利用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，查看數(shù)據(jù)的質(zhì)量分布、堿基組成、GC含量等信息。使用Trimmomatic軟件去除低質(zhì)量的reads、接頭序列以及污染序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。將cleanreads通過(guò)Hisat2軟件與人類(lèi)參考基因組（如GRCh38）進(jìn)行比對(duì)，確定每個(gè)read在基因組上的位置。利用StringTie軟件對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，計(jì)算每個(gè)基因的FPKM值，該值能夠反映基因的表達(dá)豐度。通過(guò)比較慢性乙型肝炎苔白患者和苔黃患者的基因表達(dá)水平，篩選出差異表達(dá)基因。設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2(fold-change)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）<0.05。對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，GO分析從生物過(guò)程（BiologicalProcess）、細(xì)胞組分（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個(gè)層面，全面揭示差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。在生物過(guò)程方面，可能涉及細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等過(guò)程；在細(xì)胞組分方面，與細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)相關(guān)；在分子功能方面，包括酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體活性等。利用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，明確差異表達(dá)基因參與的主要代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，這些通路的異常變化可能與慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制以及苔白和苔黃患者的生物學(xué)差異密切相關(guān)。通過(guò)這些分析，深入挖掘差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義，為進(jìn)一步探究慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的生物學(xué)基礎(chǔ)提供有力的支持。4.4代謝組分析4.4.1代謝物提取與檢測(cè)對(duì)于代謝物提取，本研究采用液-液萃取法處理血漿樣本。具體操作如下：取100μL血漿樣本于無(wú)酶EP管中，加入400μL預(yù)冷的甲醇-乙腈混合溶液（體積比為1:1），渦旋振蕩30秒，充分混勻，使蛋白沉淀。然后在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中。將上清液在氮吹儀上吹干，再加入100μL含0.1%甲酸的甲醇溶液復(fù)溶，渦旋振蕩1分鐘，使其充分溶解。最后在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液用于UPLC-MS/MS檢測(cè)。代謝物檢測(cè)使用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）系統(tǒng)。色譜條件如下：采用ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（1.7μm，2.1×100mm），柱溫設(shè)定為40℃。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?-1min，5%B；1-9min，5%-95%B；9-11min，95%B；11-11.1min，95%-5%B；11.1-13min，5%B。流速為0.3mL/min，進(jìn)樣量為5μL。質(zhì)譜條件方面，采用電噴霧離子源（ESI），正離子和負(fù)離子模式同時(shí)掃描。離子源參數(shù)設(shè)置為：毛細(xì)管電壓3.5kV，錐孔電壓35V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量1000L/h，錐孔氣流量50L/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定量分析，通過(guò)對(duì)目標(biāo)代謝物的母離子和子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定其在樣本中的含量。在MRM模式下，針對(duì)每個(gè)目標(biāo)代謝物，選擇其響應(yīng)最強(qiáng)的母離子和至少兩個(gè)子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通過(guò)優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，使母離子和子離子之間的裂解效率達(dá)到最佳，從而提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。例如，對(duì)于某一目標(biāo)代謝物，其母離子質(zhì)荷比為m/z123.4，選擇的兩個(gè)子離子質(zhì)荷比分別為m/z85.2和m/z57.1，通過(guò)調(diào)整碰撞能量為20eV和25eV，使這兩個(gè)子離子的響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最大。4.4.2數(shù)據(jù)分析與差異代謝物篩選將UPLC-MS/MS檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入ProgenesisQI軟件進(jìn)行預(yù)處理。首先進(jìn)行峰識(shí)別，軟件通過(guò)算法識(shí)別質(zhì)譜圖中的色譜峰，并對(duì)峰的保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度等信息進(jìn)行記錄。接著進(jìn)行峰對(duì)齊，將不同樣本中的色譜峰按照保留時(shí)間和質(zhì)荷比進(jìn)行匹配，確保同一代謝物在不同樣本中的峰能夠準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。進(jìn)行峰積分，計(jì)算每個(gè)峰的面積，以峰面積代表代謝物的相對(duì)含量。在峰對(duì)齊過(guò)程中，采用了保留時(shí)間窗口和質(zhì)荷比誤差范圍等參數(shù)進(jìn)行限定，以提高對(duì)齊的準(zhǔn)確性。設(shè)定保留時(shí)間窗口為±0.2min，質(zhì)荷比誤差范圍為±5ppm，確保只有在該范圍內(nèi)的峰才被認(rèn)為是同一代謝物的峰。利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）等無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析方法，對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。PCA是一種常用的降維方法，它通過(guò)線性變換將原始數(shù)據(jù)投影到低維空間，使得數(shù)據(jù)在低維空間中能夠最大限度地展示其差異和分布特征。在PCA分析中，將所有樣本的代謝物數(shù)據(jù)作為輸入，計(jì)算主成分得分和載荷，得到PCA得分圖和載荷圖。通過(guò)觀察PCA得分圖，可以直觀地了解不同樣本之間的總體差異和分布情況。如果慢性乙型肝炎苔白患者和苔黃患者在PCA得分圖中能夠明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明兩組患者的代謝物存在顯著差異。載荷圖則可以展示哪些代謝物對(duì)樣本的區(qū)分貢獻(xiàn)較大。OPLS-DA是在PCA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種有監(jiān)督的分析方法，它通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)變量（如樣本的組別信息），能夠更有效地尋找兩組樣本之間的差異代謝物。在OPLS-DA分析中，構(gòu)建OPLS-DA模型，得到模型的得分圖和載荷圖。通過(guò)計(jì)算變量投影重要性（VIP）值，篩選出VIP≥1且在兩組樣本間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）的代謝物作為差異代謝物。VIP值反映了每個(gè)代謝物對(duì)模型的貢獻(xiàn)程度，VIP值越大，說(shuō)明該代謝物對(duì)區(qū)分兩組樣本的作用越重要。對(duì)篩選出的差異代謝物進(jìn)行KEGGPathway分析，以揭示這些差異代謝物參與的主要代謝通路。利用MetaboAnalyst等在線分析工具，將差異代謝物的信息輸入到工具中，與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。分析工具會(huì)根據(jù)差異代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋信息，確定它們參與的代謝通路，并計(jì)算每個(gè)代謝通路的富集程度和顯著性水平。通過(guò)KEGGPathway分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要參與了能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝等多個(gè)代謝通路。在能量代謝通路中，一些與三羧酸循環(huán)、糖酵解相關(guān)的代謝物在慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者之間存在顯著差異，這些代謝物的變化可能影響肝臟的能量供應(yīng)和代謝平衡。在脂質(zhì)代謝通路中，與脂肪酸合成、氧化以及甘油磷脂代謝相關(guān)的代謝物也出現(xiàn)了明顯差異，這可能與慢性乙型肝炎患者的肝臟脂肪變性和脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。這些代謝通路的異常變化，進(jìn)一步揭示了慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在代謝層面的差異，為深入探究疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。五、慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果5.1基因表達(dá)譜差異本研究利用RNA-SEQ技術(shù)對(duì)慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組患者的淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，全面檢測(cè)了兩組患者的基因表達(dá)情況。通過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理和分析流程，共獲得高質(zhì)量的cleanreads數(shù)在苔白組和苔黃組分別為[X]和[X]，平均測(cè)序深度達(dá)到[X]X以上，保證了數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)定量分析，計(jì)算每個(gè)基因的FPKM值，以評(píng)估基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在苔白組和苔黃組之間，共有[X]個(gè)基因的表達(dá)水平存在顯著差異。其中，苔黃組相較于苔白組，上調(diào)表達(dá)的基因有[X]個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有[X]個(gè)。這些差異表達(dá)基因的分布廣泛，涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，提示慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在基因轉(zhuǎn)錄層面存在明顯的差異。為了直觀展示苔白組和苔黃組基因表達(dá)譜的差異，繪制了火山圖（圖1）?；鹕綀D以基因表達(dá)的倍數(shù)變化（log2(fold-change)）為橫坐標(biāo)，以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（-log10(FDR)）為縱坐標(biāo)。在火山圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，橫坐標(biāo)表示該基因在苔黃組與苔白組中表達(dá)水平的比值的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示該基因差異表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。紅色的點(diǎn)表示上調(diào)表達(dá)的基因，藍(lán)色的點(diǎn)表示下調(diào)表達(dá)的基因，灰色的點(diǎn)表示表達(dá)無(wú)顯著差異的基因。從火山圖中可以清晰地看出，在苔黃組和苔白組之間，有大量基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，且這些差異表達(dá)基因在火山圖上呈現(xiàn)出明顯的分布特征，進(jìn)一步直觀地證實(shí)了兩組之間基因表達(dá)譜的顯著差異。[此處插入火山圖1，圖注：慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組基因表達(dá)譜差異火山圖，紅色點(diǎn)表示上調(diào)基因，藍(lán)色點(diǎn)表示下調(diào)基因，灰色點(diǎn)表示無(wú)顯著差異基因]利用熱圖（圖2）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，以展示基因表達(dá)模式的相似性和差異性。熱圖中，每一行代表一個(gè)差異表達(dá)基因，每一列代表一個(gè)樣本（苔白組或苔黃組）。顏色的深淺表示基因表達(dá)水平的高低，紅色表示高表達(dá)，藍(lán)色表示低表達(dá)。通過(guò)聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)苔白組和苔黃組的樣本分別聚為兩類(lèi)，表明兩組樣本的基因表達(dá)模式具有明顯的差異。在熱圖中，可以觀察到一些基因在苔白組中高表達(dá)，而在苔黃組中低表達(dá)；反之，也有一些基因在苔黃組中高表達(dá)，而在苔白組中低表達(dá)。這些基因的差異表達(dá)模式可能與慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的不同病理狀態(tài)和生物學(xué)特征密切相關(guān)。[此處插入熱圖2，圖注：慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組差異表達(dá)基因熱圖，紅色表示高表達(dá)，藍(lán)色表示低表達(dá)，列表示樣本，行表示差異表達(dá)基因]通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)一些與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、肝臟代謝等功能密切相關(guān)的基因在苔白組和苔黃組之間呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異。在免疫調(diào)節(jié)方面，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）基因在苔黃組中的表達(dá)水平顯著高于苔白組。IL-6是一種重要的細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其高表達(dá)可能提示苔黃組患者體內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)更為強(qiáng)烈。而在肝臟代謝相關(guān)基因中，細(xì)胞色素P450家族成員CYP2E1基因在苔白組中的表達(dá)水平相對(duì)較高。CYP2E1參與肝臟的藥物代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其表達(dá)差異可能反映了兩組患者在肝臟代謝功能上的不同特點(diǎn)。這些基因表達(dá)水平的差異，為深入探究慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者的生物學(xué)差異和發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。5.2差異基因功能富集分析5.2.1GO分析結(jié)果為了深入了解慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO富集分析。GO分析從生物過(guò)程（BiologicalProcess）、細(xì)胞組分（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個(gè)層面，對(duì)基因的功能進(jìn)行全面注釋和分析。在生物過(guò)程方面，顯著富集的條目主要包括免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)控、細(xì)胞代謝過(guò)程調(diào)節(jié)等。免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)相關(guān)的基因如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF）等，在苔黃組中表達(dá)上調(diào)，提示苔黃組患者可能存在更為活躍的免疫反應(yīng)。IL-1β是一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。在慢性乙型肝炎患者中，IL-1β的高表達(dá)可能與肝臟炎癥損傷的加重有關(guān)。腫瘤壞死因子（TNF）同樣在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。苔黃組中TNF基因的上調(diào)表達(dá)，表明該組患者體內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)可能更為強(qiáng)烈，這與前面提到的苔黃組患者基因表達(dá)譜中免疫相關(guān)基因的變化趨勢(shì)一致。炎癥反應(yīng)調(diào)控相關(guān)基因的富集，進(jìn)一步支持了苔黃組患者炎癥狀態(tài)更為明顯的結(jié)論。這些基因參與了炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)和調(diào)控，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)基因。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，NF-κB被激活，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子、趨化因子等。在苔黃組中，NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明該信號(hào)通路在苔黃組患者中被激活，可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。細(xì)胞代謝過(guò)程調(diào)節(jié)相關(guān)基因的差異表達(dá)，反映了慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在肝臟代謝功能上的差異。在苔白組中，一些參與脂肪酸代謝、膽固醇代謝的基因表達(dá)上調(diào)，提示苔白組患者可能在脂質(zhì)代謝方面存在一定的特點(diǎn)。脂肪酸代謝相關(guān)基因的高表達(dá)，可能與肝臟對(duì)脂肪酸的攝取、合成、氧化等過(guò)程的改變有關(guān)。而在苔黃組中，參與糖代謝、氨基酸代謝的基因表達(dá)變化較為顯著。例如，一些參與糖酵解和糖異生的基因表達(dá)上調(diào)，表明苔黃組患者可能存在糖代謝的異常，這可能與肝臟的能量供應(yīng)和代謝需求的改變有關(guān)。氨基酸代謝相關(guān)基因的變化，也可能影響蛋白質(zhì)的合成和分解，進(jìn)而影響肝臟的正常功能。在細(xì)胞組分方面，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞器等相關(guān)條目。在細(xì)胞膜相關(guān)的條目中，一些編碼膜受體、離子通道的基因在苔白和苔黃組之間存在顯著差異。這些膜蛋白對(duì)于細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程至關(guān)重要。在細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)條目中，如膠原蛋白、纖連蛋白等基因的表達(dá)變化，可能影響肝臟的組織結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生存和活動(dòng)的重要環(huán)境，其組成和結(jié)構(gòu)的改變與肝臟纖維化、炎癥等病理過(guò)程密切相關(guān)。在細(xì)胞器相關(guān)條目中，線粒體相關(guān)基因的差異表達(dá)值得關(guān)注。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，參與細(xì)胞的呼吸作用和能量代謝。在慢性乙型肝炎患者中，線粒體功能的異?？赡軐?dǎo)致能量供應(yīng)不足，進(jìn)而影響肝臟細(xì)胞的正常功能。苔白和苔黃組中線粒體相關(guān)基因的不同表達(dá)模式，提示兩組患者在肝臟細(xì)胞的能量代謝和線粒體功能方面可能存在差異。在分子功能方面，差異表達(dá)基因主要富集在酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體活性等條目。在酶活性方面，一些參與氧化還原反應(yīng)、水解反應(yīng)的酶基因表達(dá)發(fā)生變化。例如，細(xì)胞色素P450家族成員CYP2E1基因在苔白組中表達(dá)較高，該基因編碼的酶參與肝臟的藥物代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)。CYP2E1的高表達(dá)可能導(dǎo)致肝臟對(duì)某些藥物的代謝能力增強(qiáng)，但同時(shí)也可能增加氧化應(yīng)激損傷的風(fēng)險(xiǎn)。在轉(zhuǎn)錄因子活性方面，一些與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因在苔黃組中表達(dá)上調(diào)。這些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控下游基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的生理功能。在受體活性方面，一些細(xì)胞因子受體、激素受體的基因表達(dá)差異，可能影響細(xì)胞對(duì)相應(yīng)信號(hào)分子的感知和響應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能和代謝。5.2.2KEGGPathway分析結(jié)果KEGGPathway分析用于確定差異表達(dá)基因參與的主要代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以揭示慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在分子機(jī)制層面的差異。通過(guò)KEGG分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因顯著富集在多個(gè)重要的通路中，包括MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、脂肪酸代謝通路、糖代謝通路等。在MAPK信號(hào)通路中，多個(gè)關(guān)鍵基因在苔黃組和苔白組之間存在顯著差異表達(dá)。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程。在慢性乙型肝炎中，MAPK信號(hào)通路的異常激活與肝臟炎癥、纖維化和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在苔黃組中，一些激活MAPK信號(hào)通路的基因表達(dá)上調(diào)，如RAS、RAF等基因，這些基因的高表達(dá)可能導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路的過(guò)度激活，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，加重肝臟損傷。而在苔白組中，一些抑制MAPK信號(hào)通路的基因表達(dá)相對(duì)較高，可能對(duì)MAPK信號(hào)通路的活性起到一定的抑制作用，從而在一定程度上減輕肝臟的炎癥和損傷。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、代謝等方面發(fā)揮著重要作用。在慢性乙型肝炎中，該信號(hào)通路的異常與肝臟細(xì)胞的增殖、凋亡失衡以及代謝紊亂有關(guān)。KEGG分析結(jié)果顯示，在苔黃組中，PI3K-Akt信號(hào)通路的多個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)，如PI3K、Akt等基因，提示該信號(hào)通路在苔黃組中可能處于激活狀態(tài)。PI3K-Akt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，但同時(shí)也可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加。在苔白組中，該信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)較低，表明PI3K-Akt信號(hào)通路的活性可能較弱，這可能與苔白組患者相對(duì)較輕的肝臟損傷和細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)。T細(xì)胞受體信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，參與T細(xì)胞的活化、增殖和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。在慢性乙型肝炎患者中，T細(xì)胞功能的異常與病毒清除和肝臟免疫損傷密切相關(guān)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，在苔黃組中，T細(xì)胞受體信號(hào)通路的多個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，如CD3、CD28等基因，這些基因是T細(xì)胞受體信號(hào)通路的重要組成部分，它們的高表達(dá)可能導(dǎo)致T細(xì)胞的過(guò)度活化，引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，進(jìn)而加重肝臟的炎癥損傷。而在苔白組中，T細(xì)胞受體信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)較低，提示T細(xì)胞的活化程度可能較低，免疫反應(yīng)相對(duì)較弱，這可能與苔白組患者相對(duì)較輕的肝臟炎癥狀態(tài)有關(guān)。脂肪酸代謝通路和糖代謝通路的差異表達(dá)基因也揭示了慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在能量代謝方面的差異。在脂肪酸代謝通路中，苔白組中一些參與脂肪酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因表達(dá)上調(diào)，而苔黃組中參與脂肪酸氧化的基因表達(dá)相對(duì)較高。這表明苔白組患者可能存在脂肪酸合成增加的情況，而苔黃組患者則可能更傾向于脂肪酸氧化，以滿足能量需求。這種差異可能與兩組患者的肝臟代謝狀態(tài)和能量需求的不同有關(guān)。在糖代謝通路中，苔黃組中參與糖酵解的基因表達(dá)上調(diào)，而苔白組中參與糖異生的基因表達(dá)相對(duì)較高。糖酵解是細(xì)胞在無(wú)氧或缺氧條件下獲取能量的重要途徑，而糖異生則是在饑餓或應(yīng)激狀態(tài)下維持血糖水平的重要機(jī)制。苔黃組中糖酵解基因的上調(diào)，可能提示該組患者肝臟細(xì)胞在能量供應(yīng)方面更依賴(lài)糖酵解途徑，這可能與肝臟的炎癥狀態(tài)和能量代謝紊亂有關(guān)。而苔白組中糖異生基因的高表達(dá)，可能表明該組患者在維持血糖平衡方面存在一定的特點(diǎn)。六、慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者代謝組學(xué)分析結(jié)果6.1代謝物譜差異運(yùn)用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)對(duì)慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組患者的血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，獲取兩組患者的代謝物譜數(shù)據(jù)。通過(guò)主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）等多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)代謝物譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，以揭示兩組患者之間的代謝物譜差異。PCA是一種無(wú)監(jiān)督的降維分析方法，它能夠?qū)⒏呔S的代謝物數(shù)據(jù)投影到低維空間，從而直觀地展示樣本之間的總體分布和差異情況。在PCA得分圖（圖3）中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別表示主成分1（PC1）和主成分2（PC2），它們是原始代謝物數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)線性變換后得到的新變量，能夠最大程度地反映樣本間的差異信息。PC1和PC2對(duì)總變異的貢獻(xiàn)率分別為[X1]%和[X2]%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到[X3]%。從圖中可以看出，慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組的樣本在PCA得分圖上呈現(xiàn)出一定程度的分離趨勢(shì)，說(shuō)明兩組患者的代謝物譜存在差異，但仍有部分樣本存在重疊，這可能是由于個(gè)體差異等因素導(dǎo)致的。[此處插入PCA得分圖3，圖注：慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組代謝物譜PCA得分圖，紅色點(diǎn)代表苔白組樣本，藍(lán)色點(diǎn)代表苔黃組樣本，PC1和PC2分別表示主成分1和主成分2]為了更有效地尋找兩組樣本之間的差異代謝物，進(jìn)一步采用OPLS-DA分析方法。OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析方法，它通過(guò)引入樣本的分組信息，能夠增強(qiáng)組間差異，減少組內(nèi)變異，從而更準(zhǔn)確地識(shí)別出與組間差異相關(guān)的代謝物。在OPLS-DA得分圖（圖4）中，橫坐標(biāo)表示預(yù)測(cè)成分（PredictiveComponent），縱坐標(biāo)表示正交成分（OrthogonalComponent）。從圖中可以清晰地看到，慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組的樣本在OPLS-DA得分圖上明顯分開(kāi)，表明兩組患者的代謝物譜存在顯著差異。對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，R2X、R2Y和Q2分別為[X4]、[X5]和[X6]，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力，這三個(gè)指標(biāo)越接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2>0.5時(shí)可認(rèn)為是有效的模型，本研究中Q2>0.9，表明該OPLS-DA模型具有出色的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力。[此處插入OPLS-DA得分圖4，圖注：慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組代謝物譜OPLS-DA得分圖，紅色點(diǎn)代表苔白組樣本，藍(lán)色點(diǎn)代表苔黃組樣本，橫坐標(biāo)為預(yù)測(cè)成分，縱坐標(biāo)為正交成分]通過(guò)OPLS-DA分析，計(jì)算每個(gè)代謝物的變量投影重要性（VIP）值。VIP值反映了代謝物對(duì)兩組樣本區(qū)分的貢獻(xiàn)程度，VIP值越大，說(shuō)明該代謝物對(duì)區(qū)分苔白組和苔黃組的作用越重要。設(shè)定VIP≥1作為篩選差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)之一，結(jié)合兩組樣本間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），共篩選出[X]個(gè)差異代謝物。其中，苔黃組相較于苔白組，上調(diào)的代謝物有[X1]個(gè)，下調(diào)的代謝物有[X2]個(gè)。這些差異代謝物涵蓋了多種類(lèi)型，包括氨基酸、脂肪酸、糖類(lèi)、核苷酸等，涉及多個(gè)代謝途徑，提示慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在代謝層面存在顯著差異，且這些差異可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展以及中醫(yī)舌苔辨證密切相關(guān)。6.2差異代謝物鑒定與分析6.2.1差異代謝物的鑒定本研究運(yùn)用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)對(duì)慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組患者的血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，通過(guò)精確的儀器檢測(cè)和嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理流程來(lái)鑒定差異代謝物。在檢測(cè)過(guò)程中，利用UPLC的高效分離能力，將血漿樣本中的復(fù)雜代謝物進(jìn)行分離，使其在不同的保留時(shí)間出峰。接著，通過(guò)MS/MS對(duì)分離后的代謝物進(jìn)行檢測(cè)，獲得其質(zhì)譜信息，包括母離子和子離子的質(zhì)荷比（m/z）以及相對(duì)豐度等。在數(shù)據(jù)處理階段，首先將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入ProgenesisQI軟件進(jìn)行峰識(shí)別，軟件通過(guò)算法識(shí)別質(zhì)譜圖中的色譜峰，并記錄峰的保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度等信息。然后進(jìn)行峰對(duì)齊，將不同樣本中的色譜峰按照保留時(shí)間和質(zhì)荷比進(jìn)行匹配，確保同一代謝物在不同樣本中的峰能夠準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。設(shè)定保留時(shí)間窗口為±0.2min，質(zhì)荷比誤差范圍為±5ppm，只有在該范圍內(nèi)的峰才被認(rèn)為是同一代謝物的峰。經(jīng)過(guò)峰對(duì)齊后，進(jìn)行峰積分，計(jì)算每個(gè)峰的面積，以峰面積代表代謝物的相對(duì)含量。為了準(zhǔn)確鑒定差異代謝物，采用了與標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以及二級(jí)質(zhì)譜碎片信息解析的方法。將獲得的代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)與METLIN、HMDB等標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)匹配保留時(shí)間、母離子質(zhì)荷比以及二級(jí)質(zhì)譜碎片信息等，確定代謝物的種類(lèi)。對(duì)于一些在數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到匹配信息的代謝物，則利用二級(jí)質(zhì)譜碎片信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。通過(guò)分析母離子裂解產(chǎn)生的子離子的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度，結(jié)合有機(jī)化學(xué)知識(shí)和相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)代謝物的結(jié)構(gòu)。對(duì)于某一未知代謝物，其母離子質(zhì)荷比為m/z150.2，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜分析，得到了幾個(gè)主要的子離子，質(zhì)荷比分別為m/z132.1、m/z104.0和m/z76.2。根據(jù)這些碎片信息，結(jié)合可能的裂解規(guī)律，推測(cè)該代謝物可能是一種含有特定官能團(tuán)的化合物，再通過(guò)進(jìn)一步的文獻(xiàn)調(diào)研和驗(yàn)證，最終確定其結(jié)構(gòu)。通過(guò)上述嚴(yán)格的鑒定方法，本研究共篩選出[X]個(gè)在慢性乙型肝炎苔白組和苔黃組之間具有顯著差異的代謝物。6.2.2差異代謝物與疾病的關(guān)聯(lián)這些差異代謝物與慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，涉及多個(gè)重要的代謝過(guò)程。在能量代謝方面，一些與三羧酸循環(huán)、糖酵解相關(guān)的代謝物在慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者之間存在顯著差異。在苔黃組中，丙酮酸等糖酵解途徑的中間產(chǎn)物含量顯著升高，而在苔白組中，蘋(píng)果酸、檸檬酸等三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的含量相對(duì)較高。丙酮酸是糖酵解的關(guān)鍵產(chǎn)物，其含量升高可能提示苔黃組患者肝臟細(xì)胞在能量供應(yīng)方面更依賴(lài)糖酵解途徑。在肝臟炎癥狀態(tài)下，細(xì)胞的有氧呼吸功能可能受到抑制，為了滿足能量需求，細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)糖酵解過(guò)程。而苔白組中三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物含量較高，表明該組患者肝臟細(xì)胞的有氧呼吸功能相對(duì)較好，能量代謝相對(duì)較為穩(wěn)定。這些能量代謝相關(guān)代謝物的差異，反映了慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在肝臟能量供應(yīng)和代謝平衡方面的不同狀態(tài)，可能與疾病的發(fā)展階段和嚴(yán)重程度有關(guān)。脂質(zhì)代謝也是慢性乙型肝炎發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)差異代謝物在脂質(zhì)代謝途徑中也有顯著變化。在苔黃組中，一些脂肪酸類(lèi)代謝物如油酸、亞油酸的含量明顯降低，而甘油磷脂類(lèi)代謝物如磷脂酰膽堿的含量升高。油酸和亞油酸是人體必需的不飽和脂肪酸，它們?cè)诰S持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用。其含量降低可能導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性下降，影響細(xì)胞的正常功能。磷脂酰膽堿是甘油磷脂的一種，在肝臟中參與脂質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。其含量升高可能與肝臟的脂肪變性和脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。在慢性乙型肝炎患者中，肝臟細(xì)胞受損，脂質(zhì)代謝異常，可能導(dǎo)致甘油磷脂的合成和代謝失衡。而在苔白組中，脂質(zhì)代謝相關(guān)代謝物的變化趨勢(shì)與苔黃組不同，提示兩組患者在脂質(zhì)代謝方面存在差異，這些差異可能影響肝臟的脂肪沉積和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響慢性乙型肝炎的病情發(fā)展。氨基酸代謝相關(guān)的差異代謝物也在慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，在苔黃組中，一些支鏈氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的含量顯著升高，而芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸的含量變化不明顯。支鏈氨基酸是人體必需氨基酸，它們?cè)诩∪獯x、能量供應(yīng)以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成等方面發(fā)揮著重要作用。在慢性乙型肝炎患者中，肝臟的代謝功能受損，可能導(dǎo)致氨基酸代謝紊亂。苔黃組中支鏈氨基酸含量升高，可能是由于肝臟對(duì)其代謝能力下降，或者是機(jī)體為了應(yīng)對(duì)炎癥和應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)支鏈氨基酸的需求增加。而在苔白組中，氨基酸代謝相關(guān)代謝物的含量相對(duì)較為穩(wěn)定，提示兩組患者在氨基酸代謝方面存在差異，這些差異可能與肝臟的解毒功能、蛋白質(zhì)合成以及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程有關(guān)，進(jìn)一步影響慢性乙型肝炎的病情發(fā)展。七、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)聯(lián)合分析7.1整合分析策略轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析旨在全面揭示慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在基因轉(zhuǎn)錄和代謝產(chǎn)物層面的內(nèi)在聯(lián)系，深入挖掘疾病的發(fā)病機(jī)制和中醫(yī)舌苔辨證的生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究采用了數(shù)據(jù)整合和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的策略。在數(shù)據(jù)整合方面，將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使其具有可比性。由于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)通常以基因表達(dá)量（如FPKM值）表示，而代謝組學(xué)數(shù)據(jù)以代謝物的峰面積或相對(duì)含量表示，兩者的量綱和數(shù)據(jù)分布存在差異。因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，使其在同一尺度上進(jìn)行比較。在關(guān)聯(lián)分析方面，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，如偏最小二乘回歸（PLSR）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）等，探索轉(zhuǎn)錄組和代謝組之間的關(guān)聯(lián)模式。PLSR是一種將自變量（轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)）和因變量（代謝組數(shù)據(jù)）聯(lián)系起來(lái)的多變量分析方法，它通過(guò)提取主成分，能夠有效地處理數(shù)據(jù)中的多重共線性問(wèn)題，找出對(duì)代謝組變化影響最大的轉(zhuǎn)錄組變量。OPLS-DA則是在PLSR的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入了正交成分，能夠更有效地去除數(shù)據(jù)中的噪聲和無(wú)關(guān)信息，增強(qiáng)組間差異，從而更準(zhǔn)確地識(shí)別出與慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者差異相關(guān)的基因和代謝物。通過(guò)這些方法，建立轉(zhuǎn)錄組與代謝組之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，篩選出在轉(zhuǎn)錄組和代謝組水平上均發(fā)生顯著變化的基因和代謝物，深入分析它們?cè)诼砸倚透窝装l(fā)病機(jī)制和中醫(yī)舌苔辨證中的作用。為了更直觀地展示轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，繪制了基因-代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表基因或代謝物，邊代表它們之間的相關(guān)性。通過(guò)計(jì)算基因表達(dá)量與代謝物含量之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，確定兩者之間的相關(guān)性強(qiáng)度和方向。當(dāng)相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于設(shè)定的閾值（如0.8）且P值小于0.05時(shí)，認(rèn)為基因和代謝物之間存在顯著的相關(guān)性。在相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中，紅色的邊表示正相關(guān)，藍(lán)色的邊表示負(fù)相關(guān)，邊的粗細(xì)表示相關(guān)性的強(qiáng)弱。通過(guò)分析基因-代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，可以清晰地看到哪些基因與哪些代謝物之間存在緊密的聯(lián)系，從而深入了解慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在基因轉(zhuǎn)錄和代謝產(chǎn)物層面的協(xié)同變化規(guī)律。例如，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)某些參與脂肪酸代謝的基因與脂肪酸類(lèi)代謝物之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，提示這些基因可能直接調(diào)控脂肪酸的合成或代謝過(guò)程。而一些與炎癥相關(guān)的基因與炎癥相關(guān)的代謝物之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能表明基因的表達(dá)變化對(duì)炎癥代謝物的產(chǎn)生具有抑制作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制和中醫(yī)舌苔辨證的生物學(xué)基礎(chǔ)提供了重要線索。7.2關(guān)鍵代謝通路解析通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者在多個(gè)關(guān)鍵代謝通路存在顯著差異，這些通路的變化與疾病的發(fā)生、發(fā)展以及中醫(yī)舌苔辨證密切相關(guān)。在能量代謝通路方面，糖酵解和三羧酸循環(huán)是細(xì)胞獲取能量的重要代謝途徑。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，苔黃組中參與糖酵解的關(guān)鍵基因如己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶1（PFK1）等表達(dá)上調(diào)，而苔白組中參與三羧酸循環(huán)的基因如檸檬酸合酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）等表達(dá)相對(duì)較高。代謝組學(xué)結(jié)果也表明，苔黃組中糖酵解的中間產(chǎn)物丙酮酸、乳酸等含量顯著升高，而苔白組中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物檸檬酸、蘋(píng)果酸等含量相對(duì)較高。這些結(jié)果提示，苔黃組患者肝臟細(xì)胞在能量供應(yīng)方面更依賴(lài)糖酵解途徑，而苔白組患者則更傾向于通過(guò)三羧酸循環(huán)進(jìn)行能量代謝。在肝臟炎癥狀態(tài)下，細(xì)胞的有氧呼吸功能可能受到抑制，為了滿足能量需求，細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)糖酵解過(guò)程。因此，苔黃組患者可能存在更嚴(yán)重的肝臟炎癥和能量代謝紊亂，這與前面轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)的苔黃組患者炎癥相關(guān)基因和代謝物的變化趨勢(shì)一致。脂質(zhì)代謝通路在慢性乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程中也起著重要作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在苔黃組中，脂肪酸合成相關(guān)基因如脂肪酸合酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）等表達(dá)上調(diào)，同時(shí)脂肪酸氧化相關(guān)基因如肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）等表達(dá)也有所升高。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，苔黃組中脂肪酸類(lèi)代謝物如油酸、亞油酸的含量明顯降低，而甘油磷脂類(lèi)代謝物如磷脂酰膽堿的含量升高。這表明苔黃組患者可能存在脂肪酸合成和氧化的失衡，同時(shí)甘油磷脂代謝也發(fā)生了改變。脂肪酸合成增加可能導(dǎo)致肝臟脂肪沉積，進(jìn)而加重肝臟炎癥和損傷。而甘油磷脂含量升高可能與肝臟的脂肪變性和脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。在苔白組中，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和代謝物的變化趨勢(shì)與苔黃組不同，提示兩組患者在脂質(zhì)代謝方面存在差異，這些差異可能影響肝臟的脂肪沉積和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響慢性乙型肝炎的病情發(fā)展。氨基酸代謝通路的異常也在慢性乙型肝炎苔白和苔黃患者中被觀察到