6.生物技術與工程1234561.(12分)(2025·云南模擬)玉米是一種優(yōu)良作物,但普通玉米缺乏動物生長發(fā)育所必需的賴氨酸,科研工作者利用轉基因技術將馬鈴薯中高賴氨酸蛋白基因(SBgLR)轉入玉米細胞獲得高賴氨酸玉米新品種。該過程所用基因、Ti質粒的部分結構、限制酶的識別序列及切割位點如圖所示?；卮鹣铝袉栴}。注:LB、RB分別為T-DNA的左邊界、右邊界。

123456(1)PCR擴增SBgLR基因時,引物的作用是

;

第二輪擴增結束時,PCR反應體系中存在

種雙鏈DNA。

(2)為獲得能正確表達SBgLR基因的重組質粒,應使用

兩種限制酶切割圖中質粒。切割目的基因和質粒時均選用兩種限制酶,這樣設計的優(yōu)點是___________________________________________________。使DNA聚合酶從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

4MunⅠ和XmaⅠ

避免目的基因和質粒的反向連接;防止目的基因和質粒的自身環(huán)化

(3)SBgLR基因中無上述限制酶識別序列,研究人員利用SBgLR基因的mRNA進行逆轉錄得到了cDNA,已知mRNA的序列為5'-UCUGUUGAAUAU…(中間序列)…GCAUCAUCCAGG-3'。利用PCR技術對cDNA進行擴增,為便于將擴增后的基因和載體連接構建重組質粒,請寫出PCR擴增時A端和B端所需DNA引物的前12個堿基序列

、

。

5'-CAATTGTCTGTT-3'5'-CCCGGGCCTGGA-3'123456(4)研究者采用RT-PCR技術對高賴氨酸玉米新品種轉錄情況進行鑒定,首先分別提取高賴氨酸玉米新品種和野生型玉米的全部RNA作為模板,經(jīng)逆轉錄獲得cDNA,再以cDNA作為模板進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如下圖所示,1號泳道加入的樣品是基因表達載體中SBgLR基因的PCR產(chǎn)物,則高賴氨酸玉米新品種和野生型玉米的RT-PCR擴增產(chǎn)物分別加入的是

泳道。Marker:已知分子量的DNA片段

3、2123456解析

(1)PCR擴增目的基因時,引物的作用是使DNA聚合酶從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。PCR擴增利用的是DNA半保留復制的特點,因此第二輪擴增結束時,PCR反應體系中存在4種雙鏈DNA。(2)不能選擇EcoRⅠ酶切割質粒,因為該酶的識別序列在啟動子中;也不能選擇NheⅠ酶切割質粒,因為該酶的識別序列在質粒上有兩個部位,因此需選擇MunⅠ、XmaⅠ切割質粒。切割目的基因和質粒時均選用了兩種限制酶,這樣操作的優(yōu)點是一方面可以避免目的基因和質粒的反向連接,另一方面還可防止目的基因和質粒的自身環(huán)化。123456(3)已知mRNA的序列為5'-UCUGUUGAAUAU…(中間序列)…GCAUCAUCCAGG-3',逆轉錄得到cDNA序列為5'-CCTGGATGATGC…(中間序列)…ATATTCAACAGA-3',利用PCR技術對cDNA進行擴增,PCR過程需要兩種引物,能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補配對結合,并在A端、B端分別加入MunⅠ、XmaⅠ識別序列,故PCR擴增時所需引物的前12個堿基序列為5'-CAATTGTCTGTT-3'、5'-CCCGGGCCTGGA-3'。(4)結合題意并分析電泳結果可知,1號泳道加入的樣品是基因表達載體中SBgLR基因的PCR產(chǎn)物,比較可得3號泳道為高賴氨酸玉米新品種的RT-PCR擴增產(chǎn)物,野生型玉米中不含SBgLR基因,因此在電泳過程中未顯示條帶,對應2號泳道。1234562.(11分)(2025·黑龍江模擬)諾如病毒(HuNoV)為單鏈RNA病毒,是導致人急性胃腸炎的最常見的病原體之一,其衣殼蛋白vpl蛋白具免疫原性,且可自組裝成空心的病毒樣顆粒(VLP)?？蒲腥藛T利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備VLP,即以桿狀病毒為載體,通過特異性感染昆蟲細胞生產(chǎn)VLP基因工程疫苗,部分技術路線如圖1所示。回答下列問題。圖1123456(1)為了后續(xù)實驗中方便蛋白的純化,需將vpl基因與小段His標簽基因序列相連,形成融合基因(圖2),并與轉移載體質粒連接,構建出重組轉移載體?，F(xiàn)欲通過PCR判定融合基因已準確連接,應選擇圖2中的引物組合是

。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結果符合預期,通常還圖2(引物)1和3僅能檢測DNA分子的大小,無法確定其堿基序列需進行序列測定,原因是瓊脂糖凝膠電泳技術

。

123456(2)昆蟲HF細胞能高效表達外源基因,是與載體上的

(結構)有關。從結構上看,外源基因能和病毒DNA拼接的原因是

。

構建重組桿狀病毒要在昆蟲細胞系中共轉染,其原因是

。

啟動子都有規(guī)則的雙螺旋結構病毒只能寄生在活細胞中123456(3)當目的基因兩側的小段序列與表達載體上某序列相同或相似時,可通過同源切割后進行片段互換實現(xiàn)同源重組。將含有vpl基因的重組轉移載體質粒與攜帶桿狀病毒基因組的BAC線性DNA共轉染到昆蟲SF9細胞中,通過一步轉染即可實現(xiàn)重組桿狀病毒的高效生成。已知ORF是病毒在昆蟲細胞中復制的必備元件,△ORF是部分片段缺失的ORF(能在大腸桿菌中復制,不能在昆蟲細胞中復制)。推測圖1所示制備過程中,SF9細胞中只產(chǎn)生重組桿狀病毒的必要條件是

。(多選)

A.甲為△ORF,乙為ORF B.BAC線性DNA為線狀而非環(huán)狀C.BAC線性DNA含抗生素抗性基因

D.BAC線性DNA含桿狀病毒基因組AD(4)為擴大疫苗產(chǎn)量,昆蟲HF細胞應選擇

(填“貼壁”或“懸浮”)生長型細胞。與大腸桿菌為受體細胞相比,用昆蟲細胞作為受體細胞生產(chǎn)VLP可更好的保留vpl蛋白的抗原性,其原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。懸浮

昆蟲細胞屬于真核細胞表達系統(tǒng),能對肽鏈進行正確的加工(盤曲折疊、組裝、修飾),保證了表達蛋白的活性(答案合理即可)123456123456解析

(1)PCR技術要求引物與模板鏈的3'端互補配對,且DNA聚合酶從引物的3'端開始延伸子鏈。啟動子是一段位于基因編碼鏈的5'端上游的DNA序列,轉錄時RNA聚合酶識別并結合啟動子后,沿基因的模板鏈從3'→5'方向轉錄出mRNA,也即RNA聚合酶從編碼鏈的5'端開始延伸子鏈。由圖2可知,vpl基因模板鏈的3'端在右側,因此vpl基因反轉180°后才能與啟動子準確連接,同時vpl基因和His基因的模板鏈位于一條鏈上,如下圖。要判定vpl基因與His基因連接成的融合基因已準確連接,需要選擇能擴增出融合基因的引物組合。因此,引物1和引物3可以分別與融合基因中vpl基因的3'端和His基因的3'端互補配對,從而擴增出準確連接的融合基因。123456若His基因反轉180°后進行連接,如下圖,則引物2和4能判定vpl基因與His基因連接成的融合基因存在,但該融合基因不能被啟動子正確啟動和表達。123456(2)基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因和標記基因。啟動子位于目的基因的首端,終止子位于目的基因的尾端,昆蟲高效表達外源基因與載體上的強啟動子有關;外源基因和病毒DNA都具有規(guī)則的雙螺旋結構,可以拼接;病毒只能寄生在活細胞中,因此構建重組病毒要在昆蟲細胞系中共轉染。123456(3)結合圖示分析,外源基因與病毒DNA通過同源重組實現(xiàn)拼接,需要將Lef-2和甲、乙基因互換,然后再將乙、vpl、Lef-2及桿狀病毒基因組連接到一起。SF9細胞中能合成重組桿狀病毒而不能合成野生型桿狀病毒,說明野生型桿狀病毒具備的是△ORF,在進行共轉染同源重組時,BAC線性DNA上的甲替換了重組轉移載體質粒上的乙,使重組桿狀病毒能在昆蟲細胞中復制,說明乙為ORF,因此SF9細胞中只能合成重組桿狀病毒而不能合成野生型桿狀病毒,A項符合題意。線性DNA通過同源重組形成環(huán)狀重組病毒,不是SF9細胞中能合成重組桿狀病毒而不能合成野生型桿狀病毒的原因,B項不符合題意?？股乜剐曰蜃鳛闃擞浕?用于篩選重組質粒,與病毒生成無關,C項不符合題意。BAC線性DNA含桿狀病毒基因組,才能提供病毒復制和包裝所需的遺傳物質,從而使得SF9細胞中能合成重組桿狀病毒,D項符合題意。123456(4)為擴大疫苗產(chǎn)量,昆蟲HF細胞應選擇懸浮生長型細胞,原因是懸浮型生長的細胞可以更好地與營養(yǎng)物質、氧氣等接觸,有利于細胞的增殖以及快速高效表達。大腸桿菌缺乏真核細胞修飾加工系統(tǒng),可能導致蛋白質錯誤折疊或抗原性喪失。與大腸桿菌為受體細胞相比,昆蟲細胞屬于真核細胞表達系統(tǒng),能對肽鏈進行正確的加工(盤曲折疊、組裝、修飾),保證了表達蛋白的活性,因此用昆蟲細胞作為受體細胞生產(chǎn)VLP可更好的保留vpl蛋白的抗原性。1234563.(11分)(2025·山西呂梁二模)大豆是我國重要的油料作物和植物蛋白的主要來源,但鹽脅迫會嚴重影響大豆植株的生長。研究人員欲將酵母菌細胞中的耐鹽基因ENA1導入大豆體內(nèi)以提高其耐鹽性,如圖為構建的基因表達載體的部分結構?；卮鹣铝袉栴}。注:LB為T-DNA的左側,RB為T-DNA的右側,P35S為啟動子,T35S和Nos均為終止子,Bar基因為抗草甘膦(除草劑)基因。123456(1)利用PCR方法從酵母菌基因組中擴增ENA1基因時需根據(jù)

設計引物,PCR反應體系中除加入ENA1基因、4種脫氧核苷酸等物質外,還需加入________________________________酶。

(2)為了檢測目的基因是否正向插入,可選用圖中的引物

對其進行擴增,并對擴增產(chǎn)物進行電泳,若結果為

(填“獲得擴增產(chǎn)物”或“未獲得擴增產(chǎn)物”),則說明ENA1基因正向插入。

ENA1基因兩側的堿基序列

耐高溫的DNA聚合(或TaqDNA聚合)1、4

獲得擴增產(chǎn)物123456(3)將目的基因導入植物細胞常采用的方法為

,得到轉基因大豆植株后,研究人員對轉基因大豆T2~T4代進行了PCR及電泳,實驗結果如下圖所示(1kb=1000bp):

農(nóng)桿菌轉化法123456圖中1組為標準對照組,2組為加水對照組,3組為加入野生型大豆DNA的PCR產(chǎn)物組,則4~7組為加入

組,已知ENA1基因擴增條帶大小為550bp,Bar基因擴

增條帶大小為441bp,則圖

表示擴增的基因為ENA1,連續(xù)三代PCR檢測結果說明________________________________________________________________________________________。(4)Bar基因為抗草甘膦基因,大豆在生長過程常噴灑草甘膦進行除草,推測該實驗在轉入ENA1基因的同時還轉入Bar基因,目的是排除

。從分子水平檢測轉基因大豆體內(nèi)目的基因是否完成了表達,可采用

方法。

轉基因大豆DNA的PCR產(chǎn)物ABar和ENA1基因已經(jīng)分別轉入受體大豆中,且在轉基因大豆不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳草甘膦對植物生長的影響抗原—抗體雜交123456解析

(1)利用PCR方法從酵母菌基因組中擴增ENA1基因時需根據(jù)ENA1基因兩側的堿基序列設計引物,PCR反應體系中除加入ENA1基因、4種脫氧核苷酸等物質外,還需加入耐高溫的DNA聚合酶或TaqDNA聚合酶。(2)為了檢測目的基因是否正向插入,可選用圖中的引物1和引物4對其進行擴增,并對擴增產(chǎn)物進行電泳,若結果為獲得擴增產(chǎn)物,則說明ENA1基因正向插入。123456(3)將目的基因導入植物細胞常采用的方法為農(nóng)桿菌轉化法。圖中1組為標準對照組,2組為加水對照組,3組為加入野生型大豆DNA的PCR產(chǎn)物組,則4~7組為加入轉基因大豆DNA的PCR產(chǎn)物組,已知ENA1基因擴增條帶大小為550

bp,Bar基因擴增條帶大小為441

bp,則圖A表示擴增的基因為ENA1。連續(xù)三代PCR檢測結果說明Bar和ENA1基因已經(jīng)分別轉入受體大豆中,且在轉基因大豆不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳。(4)Bar基因為抗草甘膦基因,大豆在生長過程常噴灑草甘膦進行除草,推測該實驗在轉入ENA1基因的同時還轉入Bar基因,目的是使轉基因植物能夠抗草甘膦,從而排除草甘膦對植物生長的影響。從分子水平檢測轉基因大豆體內(nèi)目的基因是否完成了表達,可采用抗原—抗體雜交方法。1234564.(12分)(2025·海南?？谀M)乳腺炎是畜牧業(yè)中的常見疾病,給全球乳制品行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。研究人員利用基因編輯工具結合Cre/loxP系統(tǒng),將炎癥調(diào)節(jié)序列(IRS)靶向整合到山羊溶菌酶(LYZ)基因的啟動子區(qū)域,成功培育出具有增強乳腺炎抗性的奶山羊,其操作過程如下圖,回答下列問題。圖1

山羊胎兒成纖維細胞

圖2

基因編輯奶山羊培育過程圖

123456注:①loxP是具有特異性序列的小DNA片段,自身不表達,也不影響其他基因表達。②P1為啟動子;EGFP為綠色熒光蛋白基因;PuroR為嘌呤霉素篩選基因;T1為終止子;TSS是轉錄起始位點。(1)啟動子位于基因的上游,緊挨著轉錄起始位點,其作用是

。

(2)Cre/loxP系統(tǒng)主要由Cre酶和loxP位點兩部分組成。Cre酶可以識別并結合到loxP序列的特定區(qū)域,并斷開特定部位兩個核苷酸之間的

鍵,然后將切口重新連接以敲除兩個同向loxP間的DNA序列。從作用效果來看,Cre酶相當于基因工程中的基本工具中的

。

RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動基因轉錄出mRNA

磷酸二酯限制酶和DNA連接酶123456(3)從生物安全的角度分析,最終利用Cre酶敲除外源EGFP和PuroR基因的意義是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)PCR技術可從分子水平檢測EGFP和PuroR基因是否被成功敲除。請簡要的寫出實驗思路:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

從生物安全性角度,切除FGFP和PuroR基因可避免其表達產(chǎn)物引發(fā)動物機體的免疫排斥反應;能防止基因漂移,避免這些外源基因傳播到其他生物體內(nèi),防范對生態(tài)系統(tǒng)及生物多樣性的潛在威脅

提取基因編輯后奶山羊細胞的基因組DNA;根據(jù)GFP和PuroR基因序列設計特異性引物以提取的DNA為模板進行PCR擴增;然后將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(5)圖2中涉及的生物技術有

(答2點)。在胚胎移植前,需要對代孕母羊進行同期發(fā)情處理,其目的是___________________________________________________________________________________________________________________________。體細胞核移植技術、胚胎移植技術使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致,供體的胚胎移入受體后有相同或相似的生存條件123456123456解析

(1)啟動子位于基因的上游,緊挨著轉錄起始位點,是RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動基因轉錄出mRNA。(2)Cre酶可以識別并結合到loxP序列的特定區(qū)域,并斷開特定部位兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵,與基因工程中限制酶的作用相似;將切口重新連接以敲除兩個同向loxP間的DNA序列,連接DNA片段,與DNA連接酶功能相似,因此從作用效果來看,Cre酶相當于基因工程中的基本工具中的限制酶和DNA連接酶。(3)EGFP為綠色熒光蛋白基因,PuroR為嘌呤霉素篩選基因,從生物安全性角度,切除FGFP和PuroR基因可避免其表達產(chǎn)物引發(fā)動物機體的免疫排斥反應;能防止基因漂移,避免這些外源基因傳播到其他生物體內(nèi),防范對生態(tài)系統(tǒng)及生物多樣性的潛在威脅。123456(4)若想用PCR技術從分子水平檢測EGFP和PuroR基因是否被成功敲除,可提取基因編輯后奶山羊細胞的基因組DNA;根據(jù)EGFP和PuroR基因序列設計特異性引物以提取的DNA為模板進行PCR擴增;然后將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。(5)圖2中涉及的生物技術有動物細胞核移植技術、動物細胞培養(yǎng)、早期胚胎發(fā)育、胚胎移植等技術。在胚胎移植前,需要對代孕母羊進行同期發(fā)情處理,使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致,供體的胚胎移入受體后有相同或相似的生存條件。1234565.(12分)(2025·廣東二模)抗原檢測技術在病毒感染篩查、病毒類型判斷等多個方面均有應用,但傳統(tǒng)檢測技術成本較高。為降低成本,需開發(fā)新型抗原檢測技術。我國科研人員以人畜共患的口蹄疫病毒FMDV為材料,將抗FMDV納米抗體Nb205和抗雞醛化紅細胞(cRBC)納米抗體NbRBC48的基因片段連接,構建雙特異納米抗體Nb205-48,利用Nb205-48建立可用于FMDV抗原檢測的血凝方法。123456(1)科研人員采用重疊延伸PCR技術構建Nb205和NbRBC48融合基因,具體路線如圖。本實驗中l(wèi)inker為含6個氨基酸序列的連接肽,部分PCR引物見下表。123456引物名稱引物序列(5'→3')P1CATATGGATGATGATGATGATGAG(有下劃線的為NdeⅠ限制酶切割位點)P2GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGTP3AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCP4GCGGCCGCTGAGGAGACGGT(有下劃線的為NotⅠ限制酶切割位點)123456①兩個不同的基因得以融合的結構基礎是

。

②重疊延伸PCR技術是先分別PCR獲得目的鏈1和目的鏈2,然后使用引物

進行PCR獲得融合基因。引物P2中決定linker的堿基序列是5'-

-3'。

③在構建基因表達載體時,需用限制酶

對質粒和Nb205-linker-NbRBC48融合基因進行酶切。

DNA分子具有雙螺旋結構

P1和P4

GACCCCAGCTCCAAAGCTNdeⅠ、NotⅠ

123456(2)科研人員將重組質粒導入大腸桿菌表達并純化獲得雙特異納米抗體Nb205-48,并對融合雙抗的敏感性進行了檢測,結果見圖。結果表明________________________________________________________________________,說明融合雙抗構建成功。

(3)在對融合雙抗Nb205-48進行推廣前,還需進行的研究有___________________________________________________________________________________________________________________________。Nb205-48可同時與FMDV及cRBC反應,且反應性能與Nb205和NbRBC48無明顯差異與傳統(tǒng)檢測方法進行靈敏度或準確性或效率比較(檢測方法的穩(wěn)定性;與其他病毒有無交叉反應等)123456解析

(1)①基因是有遺傳效應的DNA片段,兩個不同的基因得以融合的結構基礎是具有相似的DNA結構,即DNA分子具有雙螺旋結構。②結合圖示可知,先分別用(P1、P2)與(P3、P4)擴增得到目的鏈1和目的鏈2,再僅使用P1、P4進行第二輪PCR即能獲得融合基因;引物需要與模板的3'端結合,據(jù)圖可知,引物P2中決定linker的堿基序列是5'-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3',這段序列編碼了連接肽的氨基酸序列,確保兩個基因片段能夠正確連接。③在構建基因表達載體時,需要使用限制酶對質粒和融合基因進行酶切,以便將融合基因插入質粒中。根據(jù)引物P1和P4的序列,P1中含有NdeⅠ限制酶切割位點(CATATG),P4中含有NotⅠ限制酶切割位點(GCGGCCGC)。因此,需要使用NdeⅠ和NotⅠ這兩種限制酶對質粒和融合基因進行酶切,確保融合基因能夠正確插入質粒中。123456(2)分析題圖,與緩沖液相比,Nb205-48組別的FMDV和cRBC含量均顯著升高,說明Nb205-48可同時與FMDV及cRBC反應,且反應性能與Nb205和NbRBC48無明顯差異,這一結果驗證了雙特異納米抗體的功能,表明其能夠用于FMDV抗原的檢測。(3)在對融合雙抗Nb205-48進行推廣前,還需進行的研究有靈敏度、準確性(進一步驗證融合雙抗是否只與FMDV抗原結合,而不與其他病毒或物質發(fā)生交叉反應)、效率比較(檢測方法的穩(wěn)定性;與其他病毒有無交叉反應等)。1234566.(10分)(2025·云南玉溪模擬)百合極易受到尖孢鐮刀菌引起的枯萎病的影響。研究人員發(fā)現(xiàn)野生百合品種——岷江百合含有一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L使其對尖孢鐮刀菌展現(xiàn)出強大的抗性,該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結構如圖甲所示。圖乙是一種Ti質粒的結構示意圖,其中基因gu