基于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境視角：四君子湯協(xié)同吉非替尼增效機制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，在男性群體中，肺癌發(fā)病率高居首位，在女性群體中，其發(fā)病率也位居第二，且肺癌死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一，占癌癥死亡患者總數(shù)的18%。2020年，中國新增肺癌病例數(shù)多達82萬例，國內(nèi)發(fā)病率和死亡率高居首位。盡管醫(yī)學技術(shù)不斷進步，肺癌的治療取得一定進展，但整體治療效果仍不盡人意，尋找更有效的治療策略迫在眉睫。吉非替尼作為第一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），在EGFR突變陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌治療中具有重要地位。臨床研究顯示，吉非替尼用于晚期非小細胞肺癌，總有效率達67.1%，中位無進展生存為12.3個月，中位總生存為20.1個月。對于EGFR突變陽性的肺癌患者，吉非替尼是口服藥物，使用相對方便，患者依從性較好。與傳統(tǒng)化療相比，吉非替尼的副作用相對較小，主要包括皮疹、腹瀉等，通常較易處理。吉非替尼可以快速起效，能較快地緩解患者的癥狀，如咳嗽、呼吸困難等。然而，吉非替尼的治療存在局限性，耐藥現(xiàn)象是其面臨的主要挑戰(zhàn)之一。隨著治療時間的延長，約50%-60%的患者會出現(xiàn)耐藥，其中T790M突變是最常見的耐藥機制，導致吉非替尼治療失敗，患者病情進展。耐藥的發(fā)生使得吉非替尼的療效大打折扣，限制了其在肺癌治療中的長期應用，如何克服吉非替尼耐藥，提高其治療效果成為亟待解決的問題。四君子湯源自《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草四味藥材組成，是中醫(yī)補氣健脾的經(jīng)典方劑。中醫(yī)理論認為“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”，惡性腫瘤的病因病機主要為正氣不足，邪氣內(nèi)干，治療多以扶正祛邪為主。四君子湯通過益氣健脾，可改善機體正氣不足的狀態(tài)，增強機體的抗病能力?，F(xiàn)代藥理研究表明，四君子湯具有多種藥理作用，在抗腫瘤方面表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。其能夠調(diào)節(jié)機體免疫功能，增強免疫細胞活性，提高機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力；還可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，阻滯腫瘤細胞周期，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。將四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用于肺癌治療具有重要的潛在價值。從中醫(yī)角度看，四君子湯的扶正作用可改善肺癌患者正氣虧虛的狀態(tài)，增強機體對吉非替尼的耐受性，減少治療過程中的不良反應，提高患者生活質(zhì)量；從現(xiàn)代醫(yī)學角度分析，四君子湯的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用可能與吉非替尼的作用機制互補，協(xié)同抑制腫瘤細胞生長，克服吉非替尼耐藥，提高治療效果。臨床研究也初步證實了兩者聯(lián)合應用的優(yōu)勢，如四君子湯聯(lián)合吉非替尼對非小細胞肺癌PC9細胞具有協(xié)同抑制作用，能降低細胞增殖的IC50值，通過促進細胞凋亡抑制細胞增殖，且聯(lián)合用藥能促進細胞的早期凋亡，處于G2/M期細胞的比例與單獨給藥時相比差異有統(tǒng)計學意義；在EGFR突變中晚期肺癌患者的治療中，四君子湯合沙參麥冬湯加減聯(lián)合靶向治療（吉非替尼）可以提高臨床療效，改善臨床癥狀，提升機體免疫功能，降低患者不良反應發(fā)生率。然而，目前關(guān)于四君子湯提高吉非替尼療效的研究仍存在不足，作用機制尚未完全明確。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境在腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥過程中發(fā)揮重要作用，探討四君子湯基于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境提高吉非替尼療效的機制，對于優(yōu)化肺癌治療方案，提高患者生存率和生活質(zhì)量具有重要的理論和實踐意義。本研究旨在深入探究四君子湯聯(lián)合吉非替尼治療肺癌的協(xié)同作用及其基于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的作用機制，為肺癌的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)，具有重要的研究價值和臨床應用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1吉非替尼治療肺癌的研究現(xiàn)狀吉非替尼作為第一代EGFR-TKI，在非小細胞肺癌治療領(lǐng)域取得顯著進展。其作用機制主要是通過與EGFR的ATP結(jié)合位點競爭性結(jié)合，阻斷酪氨酸激酶活性，進而阻斷參與腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的EGFR信號傳導通路，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導腫瘤細胞凋亡。多項臨床研究證實了吉非替尼對EGFR突變陽性非小細胞肺癌患者的療效。在IPASS研究中，對于EGFR突變陽性的非小細胞肺癌患者，吉非替尼一線治療的無進展生存期（PFS）顯著優(yōu)于化療，分別為9.5個月和6.3個月，客觀緩解率（ORR）也更高，達到71.2%，而化療組為47.3%。這一結(jié)果奠定了吉非替尼在EGFR突變陽性非小細胞肺癌一線治療中的地位。然而，耐藥問題嚴重限制了吉非替尼的長期療效。約50%-60%的患者在使用吉非替尼治療9-14個月后會出現(xiàn)耐藥，其中T790M突變是最主要的耐藥機制，約占50%-60%。當發(fā)生T790M突變后，突變的氨基酸殘基會阻礙吉非替尼與EGFR的結(jié)合，導致藥物無法有效抑制EGFR激酶活性，從而使腫瘤細胞重新獲得增殖和生存的能力，疾病出現(xiàn)進展。除T790M突變外，還存在其他耐藥機制，如MET基因擴增、HER2擴增、PI3KCA突變等，這些耐藥機制的復雜性增加了克服吉非替尼耐藥的難度。針對吉非替尼耐藥的研究，目前主要集中在開發(fā)新一代的EGFR-TKI，如第三代EGFR-TKI奧希替尼，其對T790M突變具有特異性抑制作用，可有效克服吉非替尼耐藥，在臨床研究中顯示出良好的療效和安全性。但奧希替尼也并非萬能，部分患者使用后仍會出現(xiàn)耐藥，且存在價格昂貴等問題，限制了其廣泛應用。此外，聯(lián)合治療策略也成為研究熱點，如吉非替尼聯(lián)合化療、抗血管生成藥物等，試圖通過不同作用機制的藥物協(xié)同作用，提高治療效果，克服耐藥。1.2.2四君子湯抗腫瘤的研究現(xiàn)狀四君子湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，在抗腫瘤方面的研究日益受到關(guān)注。從中醫(yī)理論角度，四君子湯通過益氣健脾，扶助人體正氣，調(diào)節(jié)機體陰陽平衡，增強機體的抗病能力，達到“扶正祛邪”的目的?，F(xiàn)代藥理研究揭示了四君子湯多途徑、多靶點的抗腫瘤作用機制。在調(diào)節(jié)機體免疫功能方面，四君子湯可增強免疫細胞活性。研究表明，四君子湯能夠提高荷瘤小鼠外周血中白細胞數(shù)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，增強NK細胞活性，使化療時荷瘤小鼠的免疫功能維持在正常水平。蔡駿等對59例胃癌手術(shù)患者的研究發(fā)現(xiàn)，治療組術(shù)后給予四君子湯配合腸內(nèi)營養(yǎng)支持，較對照組僅給予腸外營養(yǎng)支持，T細胞亞群及營養(yǎng)指標水平都有不同程度的提高，說明四君子湯輔助的腸內(nèi)營養(yǎng)能進一步改善和優(yōu)化胃癌術(shù)后機體的細胞免疫功能及營養(yǎng)狀況。在誘導腫瘤細胞凋亡方面，多項研究證實四君子湯具有此作用。趙愛光等采用人胃癌細胞SGC-7901裸小鼠皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)四君子湯對裸鼠移植人胃癌細胞瘤抑瘤率為34.33%，TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)AI為（16.24±3.21）；在透射電鏡下，治療組見較多凋亡細胞和凋亡小體，對照組凋亡細胞和凋亡小體極少，提示腫瘤細胞凋亡可能是四君子湯抗癌作用機制之一。在抑制腫瘤細胞增殖方面，王玉榮等給荷瘤小鼠飼服純扶正中藥四君子湯加味的煎劑，觀察對小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用，結(jié)果加味四君子湯對昆明種小鼠移植性小鼠肉瘤S180抑瘤率達40.6%，單純四君子湯抑瘤率達35.6%，用流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，加味四君子湯可將腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1期，繼而導致受阻滯的腫瘤細胞發(fā)生凋亡。此外，四君子湯還具有抑制腫瘤血管生成、改善腫瘤惡病質(zhì)、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等作用，從多個環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤功效。1.2.3四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用的研究現(xiàn)狀目前，四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用于肺癌治療的研究逐漸增多，初步顯示出協(xié)同增效的優(yōu)勢。王致紅等研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯聯(lián)合吉非替尼對非小細胞肺癌PC9細胞具有協(xié)同抑制作用，能降低細胞增殖的IC50值，由（0.75±0.26）μg/L降至（0.10±0.02）μg/L，與吉非替尼組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，聯(lián)合用藥能夠通過促進細胞凋亡抑制細胞增殖，且聯(lián)合用藥能促進細胞的早期凋亡，處于G2/M期細胞的比例與單獨給藥時相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。張厚云等在EGFR突變中晚期肺癌患者的治療中，對比了四君子湯合沙參麥冬湯加減聯(lián)合靶向治療（吉非替尼）與單純吉非替尼靶向治療的效果，結(jié)果顯示觀察組客觀有效率為66.7%，高于對照組的40.0%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療后，觀察組和對照組KPS評分改善總有效率分別為60.0%、33.3%，觀察組高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療后，兩組患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均較治療前明顯升高，CD8+水平較治療前下降，且觀察組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平顯著高于對照組，CD8+水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。觀察組胃腸道反應、皮疹、肝/腎損傷發(fā)生率分別為36.7%、30.0%、23.3%，對照組胃腸道反應、皮疹、肝/腎損傷發(fā)生率分別為63.3%、56.7%、50.0%，觀察組低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這些研究表明，四君子湯聯(lián)合吉非替尼不僅能提高治療效果，還能改善患者的免疫功能，降低不良反應發(fā)生率。然而，當前關(guān)于四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用的研究仍存在一些不足。在作用機制方面，雖然已初步觀察到聯(lián)合用藥在細胞凋亡、細胞周期阻滯等方面的協(xié)同作用，但具體的分子機制尚未完全明確，尤其是四君子湯如何通過調(diào)節(jié)機體整體狀態(tài)，增強吉非替尼的療效，以及兩者聯(lián)合對腫瘤微環(huán)境的影響等方面，仍有待深入研究。在臨床研究方面，樣本量相對較小，研究設計的嚴謹性和規(guī)范性有待提高，缺乏大規(guī)模、多中心、隨機對照的臨床試驗來進一步驗證其療效和安全性。此外，四君子湯的藥物組成相對固定，不同藥材的產(chǎn)地、炮制方法等可能會影響其藥效，如何優(yōu)化四君子湯的配方和用藥方案，以實現(xiàn)與吉非替尼的最佳聯(lián)合治療效果，也是未來研究需要解決的問題。1.3研究目的與創(chuàng)新點1.3.1研究目的本研究旨在深入探討四君子湯提高吉非替尼療效的作用及基于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的潛在機制，具體目標如下：明確四君子湯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，驗證兩者聯(lián)合應用在體外實驗中的協(xié)同增效作用。通過細胞實驗，觀察單獨使用四君子湯、吉非替尼以及兩者聯(lián)合使用時，肺癌細胞各項生物學行為的變化，如使用CellTiter-Glo法檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力等，為后續(xù)機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。揭示四君子湯基于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境提高吉非替尼療效的分子機制。從轉(zhuǎn)移前微環(huán)境相關(guān)因素入手，研究四君子湯如何調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞、骨髓來源抑制細胞等免疫細胞的功能和表型，以及對細胞因子、趨化因子等微環(huán)境成分的影響，探討其與吉非替尼協(xié)同作用的分子通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路的變化，為肺癌治療提供新的理論依據(jù)。通過動物實驗進一步驗證四君子湯聯(lián)合吉非替尼在體內(nèi)的治療效果和作用機制。建立肺癌動物模型，分別給予不同處理組相應藥物干預，觀察腫瘤生長情況、轉(zhuǎn)移發(fā)生率等指標，同時對腫瘤組織和轉(zhuǎn)移灶進行病理分析、免疫組化檢測等，綜合評估聯(lián)合用藥的體內(nèi)療效，為臨床應用提供實驗支持。1.3.2創(chuàng)新點本研究的創(chuàng)新點在于從轉(zhuǎn)移前微環(huán)境這一全新角度探討四君子湯提高吉非替尼療效的機制。以往關(guān)于四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用的研究主要集中在細胞凋亡、細胞周期阻滯等方面，對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的關(guān)注較少。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥過程中起著關(guān)鍵作用，其組成復雜，包括多種免疫細胞、細胞外基質(zhì)、細胞因子等。本研究率先探究四君子湯對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，以及這種調(diào)節(jié)如何影響吉非替尼的療效，有望揭示兩者聯(lián)合治療肺癌的新機制，為肺癌治療提供新的思路和靶點。同時，將中醫(yī)經(jīng)典方劑四君子湯與現(xiàn)代靶向藥物吉非替尼相結(jié)合，體現(xiàn)了中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌的特色和優(yōu)勢，為肺癌的綜合治療提供了新的模式，具有重要的理論和實踐意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1轉(zhuǎn)移前微環(huán)境概述2.1.1概念與形成機制轉(zhuǎn)移前微環(huán)境（Premetastaticniche，PMN）是指在腫瘤細胞尚未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移之前，原發(fā)腫瘤通過一系列復雜的生物學過程，誘導遠處待轉(zhuǎn)移器官所形成的一種特殊微環(huán)境。這一概念的提出，打破了以往認為腫瘤轉(zhuǎn)移是隨機發(fā)生的傳統(tǒng)觀念，揭示了腫瘤轉(zhuǎn)移具有器官特異性的特點，即特定類型的腫瘤細胞傾向于轉(zhuǎn)移到特定的組織器官。其形成機制涉及多個復雜環(huán)節(jié)，原發(fā)腫瘤細胞在生長過程中會分泌大量腫瘤衍生因子（Tumor-derivedfactors，TDFs），如血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、血小板衍生生長因子（Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforminggrowthfactor-β，TGF-β）等。這些因子進入血液循環(huán)，到達遠處器官，與靶器官的細胞表面受體結(jié)合，激活相應信號通路，從而引發(fā)靶器官微環(huán)境的改變。VEGF可促進靶器官血管通透性增加，使血漿蛋白滲出，形成富含纖維蛋白的基質(zhì)，為后續(xù)細胞的募集和黏附提供基礎(chǔ)。同時，TGF-β能誘導靶器官內(nèi)的成纖維細胞、脂肪細胞等間質(zhì)細胞發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)化為癌相關(guān)成纖維細胞（Cancer-associatedfibroblasts，CAFs），這些CAFs分泌多種細胞因子和趨化因子，進一步調(diào)節(jié)微環(huán)境。腫瘤外泌體（Tumor-derivedexosomes，TDEs）在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體是一種由細胞分泌的納米級膜泡，攜帶多種生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等。腫瘤細胞分泌的外泌體可被靶器官細胞攝取，將其所攜帶的生物分子傳遞給靶細胞，改變靶細胞的功能和基因表達。有研究表明，腫瘤外泌體中的miR-122-5p可被肝臟細胞攝取，通過抑制肝臟細胞中SOCS3基因表達，激活JAK-STAT3信號通路，促進肝臟轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。骨髓源性細胞（Bonemarrow-derivedcells，BMDCs）的募集是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的重要步驟。在腫瘤衍生因子和趨化因子的作用下，骨髓中的造血干細胞、祖細胞等被動員，進入血液循環(huán)，并遷移到靶器官。其中，骨髓來源抑制細胞（Myeloid-derivedsuppressorcells，MDSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（Tumor-associatedmacrophages，TAMs）等在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中大量聚集。MDSCs具有強大的免疫抑制功能，可通過多種機制抑制T細胞、NK細胞等免疫細胞的活性，為腫瘤細胞的免疫逃逸創(chuàng)造條件；TAMs可分泌多種細胞因子和生長因子，如IL-10、TGF-β、VEGF等，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和血管生成。2.1.2組成與特征轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的組成復雜，包含多種細胞成分和分子成分。細胞成分主要有骨髓來源抑制細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、癌相關(guān)成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、間充質(zhì)干細胞等。骨髓來源抑制細胞是一群異質(zhì)性的髓系細胞，在腫瘤微環(huán)境中大量擴增，通過抑制免疫細胞功能、促進血管生成等機制，為腫瘤轉(zhuǎn)移提供有利條件。腫瘤相關(guān)巨噬細胞根據(jù)其功能和表型可分為M1型和M2型，在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中，M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞占主導地位，具有免疫抑制、促進腫瘤細胞遷移和侵襲等作用。癌相關(guān)成纖維細胞是腫瘤間質(zhì)中的主要細胞成分，可分泌細胞外基質(zhì)、生長因子和細胞因子，參與腫瘤微環(huán)境的重塑，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。內(nèi)皮細胞參與血管生成，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)和運輸通道。間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，可被腫瘤細胞招募到轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中，通過旁分泌作用調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。分子成分包括細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞外基質(zhì)成分等。細胞因子如IL-6、IL-10、TNF-α等，在調(diào)節(jié)免疫細胞功能、促進炎癥反應和腫瘤細胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。趨化因子如CCL2、CXCL12等，可引導免疫細胞、腫瘤細胞等的定向遷移。生長因子如VEGF、PDGF等，促進血管生成和細胞增殖。細胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，不僅為細胞提供物理支撐，還參與細胞間的信號傳導，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境具有以下特征：免疫抑制，骨髓來源抑制細胞、M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞等的聚集，以及免疫抑制性細胞因子的分泌，導致轉(zhuǎn)移前微環(huán)境呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，使得機體免疫系統(tǒng)難以識別和清除腫瘤細胞，為腫瘤細胞的定植和生長創(chuàng)造了免疫逃逸的條件。炎癥反應，腫瘤衍生因子和細胞因子的釋放引發(fā)炎癥反應，炎癥細胞浸潤，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，進一步促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。血管生成異常，腫瘤細胞分泌的血管生成因子促使靶器官血管生成和血管結(jié)構(gòu)重塑，增加血管通透性，有利于腫瘤細胞進入血液循環(huán)并到達靶器官。細胞外基質(zhì)重塑，癌相關(guān)成纖維細胞分泌的細胞外基質(zhì)成分以及基質(zhì)金屬蛋白酶等對細胞外基質(zhì)的降解和重塑，改變了細胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供了便利。代謝重編程，轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的細胞發(fā)生代謝改變，如糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝的異常，以滿足腫瘤細胞快速生長和增殖的能量需求。細胞黏附與遷移能力改變，微環(huán)境中的細胞表面黏附分子表達變化，以及細胞骨架的重組，使得腫瘤細胞和相關(guān)免疫細胞的黏附與遷移能力增強，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。這些特征相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同促進腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.2四君子湯解析2.2.1方劑組成與功效四君子湯源自《太平惠民和劑局方》，作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，其組方嚴謹、配伍精妙。由人參（去蘆）9g、白術(shù)9g、茯苓（去皮）9g、甘草（炙）6g四味藥材組成。人參味甘、微苦，性微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，具有大補元氣、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智之功效，在方中為君藥，可大補脾胃之氣，為脾胃氣虛之要藥。白術(shù)味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的作用，與人參相伍，增強健脾益氣之功，為臣藥。茯苓味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，能利水滲濕、健脾寧心，協(xié)助白術(shù)健脾祛濕，為佐藥。甘草味甘，性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥的功效，在方中調(diào)和諸藥，為使藥。四藥合用，共奏益氣健脾之功效，可使脾胃之氣健旺，運化功能恢復正常。該方劑主治脾胃氣虛證，癥見面色萎黃、語聲低微、氣短乏力、食少便溏、舌淡苔白、脈虛弱。脾胃為后天之本，氣血生化之源，若脾胃氣虛，運化失職，則會出現(xiàn)上述一系列癥狀。四君子湯通過益氣健脾，能有效改善脾胃功能，增強機體的運化能力，使氣血生化有源，從而緩解脾胃氣虛所致的各種癥狀。在臨床上，四君子湯廣泛應用于消化系統(tǒng)疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、功能性消化不良等屬脾胃氣虛者，可改善患者的胃脘脹滿、食欲不振、神疲乏力等癥狀；還可用于治療免疫力低下、貧血等病癥，通過調(diào)節(jié)機體的氣血功能，增強機體的抵抗力。2.2.2現(xiàn)代藥理學研究現(xiàn)代藥理學研究表明，四君子湯具有多種藥理作用，涉及調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸道功能等多個方面。在調(diào)節(jié)免疫功能方面，四君子湯可通過多種途徑增強機體的免疫能力。它能夠促進免疫細胞的增殖和分化，提高T淋巴細胞、B淋巴細胞的活性，增強機體的細胞免疫和體液免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯能顯著提高荷瘤小鼠外周血中白細胞數(shù)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，增強NK細胞活性，使化療時荷瘤小鼠的免疫功能維持在正常水平。在一項對59例胃癌手術(shù)患者的研究中，治療組術(shù)后給予四君子湯配合腸內(nèi)營養(yǎng)支持，較對照組僅給予腸外營養(yǎng)支持，T細胞亞群及營養(yǎng)指標水平都有不同程度的提高，說明四君子湯輔助的腸內(nèi)營養(yǎng)能進一步改善和優(yōu)化胃癌術(shù)后機體的細胞免疫功能及營養(yǎng)狀況。此外，四君子湯還可調(diào)節(jié)免疫因子的分泌，如促進白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等免疫增強因子的分泌，抑制白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）等免疫抑制因子的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)機體的免疫平衡。四君子湯的抗腫瘤作用也備受關(guān)注。研究顯示，四君子湯可通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、阻滯腫瘤細胞周期等機制發(fā)揮抗腫瘤功效。采用人胃癌細胞SGC-7901裸小鼠皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)四君子湯對裸鼠移植人胃癌細胞瘤抑瘤率為34.33%，TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)AI為（16.24±3.21）；在透射電鏡下，治療組見較多凋亡細胞和凋亡小體，對照組凋亡細胞和凋亡小體極少，提示腫瘤細胞凋亡可能是四君子湯抗癌作用機制之一。給荷瘤小鼠飼服純扶正中藥四君子湯加味的煎劑，觀察對小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用，結(jié)果加味四君子湯對昆明種小鼠移植性小鼠肉瘤S180抑瘤率達40.6%，單純四君子湯抑瘤率達35.6%，用流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，加味四君子湯可將腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1期，繼而導致受阻滯的腫瘤細胞發(fā)生凋亡。四君子湯對胃腸道功能具有良好的調(diào)節(jié)作用。它能促進胃腸蠕動，增強胃腸消化吸收功能，改善胃腸道的血液循環(huán)。研究表明，四君子湯可增加脾虛模型大鼠胃排空率和小腸推進率，提高胃腸黏膜的血流量，促進胃腸黏膜細胞的增殖和修復，從而改善胃腸道的消化和吸收功能。此外，四君子湯還可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增加有益菌的數(shù)量，抑制有害菌的生長，維持腸道微生態(tài)的穩(wěn)定。在化學成分研究方面，四君子湯含有多種活性成分，包括人參皂苷、黃酮類、多糖、揮發(fā)油等。人參皂苷是人參的主要活性成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用。多糖是四君子湯的重要組成部分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖等功效。揮發(fā)油具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸道功能等作用。這些活性成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮四君子湯的藥理作用。2.3吉非替尼作用機制吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），其作用機制主要圍繞對EGFR信號通路的精準調(diào)控展開。EGFR屬于受體酪氨酸激酶家族成員，廣泛表達于上皮細胞表面。在生理狀態(tài)下，EGFR與其配體如表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）等結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化，激活自身酪氨酸激酶活性。這一激活過程使得受體胞內(nèi)段的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進而招募并激活下游一系列信號分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路。這些信號通路在細胞的增殖、分化、存活、遷移和血管生成等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。在腫瘤細胞中，EGFR基因常發(fā)生突變，導致EGFR持續(xù)激活，使得下游信號通路過度活化，進而促進腫瘤細胞的異常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。吉非替尼能夠競爭性地結(jié)合EGFR的ATP結(jié)合位點，由于吉非替尼的結(jié)構(gòu)與ATP相似，它能夠占據(jù)ATP結(jié)合位點，從而阻斷ATP與EGFR的結(jié)合。ATP是酪氨酸激酶催化反應的能量來源，當吉非替尼占據(jù)其結(jié)合位點后，EGFR的酪氨酸激酶活性被抑制，無法將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白的酪氨酸殘基上，從而阻斷了EGFR信號通路的傳導。以PI3K/AKT信號通路為例，在正常激活狀態(tài)下，EGFR激活后，PI3K被招募至細胞膜，其催化亞基p110將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活AKT，活化的AKT通過磷酸化下游多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調(diào)節(jié)細胞的蛋白質(zhì)合成、代謝和存活等過程。當吉非替尼抑制EGFR激酶活性后，PI3K無法被有效招募激活，PIP3生成減少，AKT的活化受到抑制，從而阻斷了該信號通路對腫瘤細胞增殖和存活的促進作用。對于MAPK信號通路，EGFR激活后，通過一系列級聯(lián)反應，激活Ras蛋白，活化的Ras進一步激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf，Raf激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。活化的ERK進入細胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進與細胞增殖、分化相關(guān)基因的表達。吉非替尼抑制EGFR后，Ras的激活受阻，MAPK信號通路被阻斷，腫瘤細胞的增殖和分化過程受到抑制。此外，吉非替尼還可以通過誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。當EGFR信號通路被阻斷后，腫瘤細胞內(nèi)的抗凋亡蛋白表達下降，促凋亡蛋白表達上調(diào)，如Bcl-2家族蛋白的失衡，導致線粒體膜電位改變，細胞色素C釋放，激活半胱天冬酶級聯(lián)反應，最終誘導腫瘤細胞凋亡。同時，吉非替尼能夠抑制腫瘤血管生成。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應，EGFR信號通路的激活可促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達和分泌。吉非替尼抑制EGFR信號通路，減少VEGF等血管生成因子的產(chǎn)生，從而抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，減少腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。三、四君子湯對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的影響3.1實驗設計與方法3.1.1實驗動物與細胞株選擇選用6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠作為實驗動物，體重約為18-22g。C57BL/6小鼠是常用的近交系小鼠，其遺傳背景穩(wěn)定，對肺癌的易感性較高，且免疫功能健全，能夠較好地模擬人類肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的免疫反應，適合用于肺癌相關(guān)的實驗研究。在實驗前，將小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房，保持環(huán)境溫度為22±2℃，相對濕度為50±10%，12小時光照/12小時黑暗的晝夜節(jié)律，自由進食和飲水，適應環(huán)境1周后開始實驗。選用Lewis肺癌細胞（LLC）作為肺癌細胞株，該細胞株源自C57BL/6小鼠，具有高度的肺轉(zhuǎn)移能力，能夠在C57BL/6小鼠體內(nèi)形成典型的肺癌轉(zhuǎn)移模型，與本研究中使用的C57BL/6小鼠具有良好的同源性，有利于研究肺癌的轉(zhuǎn)移機制以及藥物對肺癌轉(zhuǎn)移的影響。將Lewis肺癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。3.1.2實驗分組與給藥方式將小鼠隨機分為4組，每組10只：對照組：給予等體積的生理鹽水灌胃，同時腹腔注射等體積的生理鹽水。四君子湯組：四君子湯按照臨床等效劑量換算，以0.5g/kg的劑量灌胃，每日1次，連續(xù)給藥21天，同時腹腔注射等體積的生理鹽水。四君子湯的制備方法為：取人參、白術(shù)、茯苓、甘草按原方比例稱取藥材，加10倍量水浸泡30分鐘，煎煮2次，每次1小時，合并煎液，濃縮至生藥含量為1g/mL，過濾除菌后備用。吉非替尼組：吉非替尼以50mg/kg的劑量灌胃，每日1次，連續(xù)給藥21天，同時腹腔注射等體積的生理鹽水。吉非替尼購自上海源葉生物科技有限公司，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成所需濃度。聯(lián)合用藥組：給予四君子湯（0.5g/kg）灌胃，每日1次，同時給予吉非替尼（50mg/kg）灌胃，每日1次，連續(xù)給藥21天。給藥期間，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動、體重變化等，每周稱量小鼠體重2次，記錄體重變化情況。3.1.3檢測指標與方法免疫細胞檢測：實驗結(jié)束后，處死小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟和肺組織，制備單細胞懸液。采用流式細胞術(shù)檢測脾臟和肺組織中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、骨髓來源抑制細胞（MDSCs）的比例和表型。具體操作如下：將單細胞懸液調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，取100μL細胞懸液，加入相應的熒光標記抗體，如CD11b、F4/80（用于標記TAMs）、CD11b、Gr-1（用于標記MDSCs），4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞2次，加入500μLPBS重懸細胞，上機檢測。通過分析不同熒光通道的信號強度，計算TAMs和MDSCs在免疫細胞中的比例，并分析其表型特征。細胞因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清和腫瘤組織勻漿中細胞因子的含量，包括白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，首先將捕獲抗體包被于酶標板上，4℃過夜。次日，用PBST洗滌酶標板3次，加入封閉液，37℃孵育1小時。洗滌后，加入不同稀釋度的標準品和待測樣品，37℃孵育1小時。再次洗滌后，加入生物素標記的檢測抗體，37℃孵育30分鐘。洗滌后，加入親和素-辣根過氧化物酶（HRP），37℃孵育30分鐘。最后加入底物顯色，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中細胞因子的含量。趨化因子檢測：利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測小鼠肺組織中趨化因子CCL2、CXCL12等的mRNA表達水平。提取肺組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行qRT-PCR反應，反應體系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物和cDNA模板。反應條件為：95℃預變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算趨化因子mRNA的相對表達量。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境相關(guān)蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測肺組織中與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成相關(guān)的蛋白表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、纖連蛋白（Fibronectin）等。提取肺組織總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取適量蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，加入一抗（MMP-9抗體、Fibronectin抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入二抗（HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時。再次洗滌后，加入化學發(fā)光底物，曝光顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的相對表達量。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1對免疫細胞的調(diào)節(jié)作用實驗結(jié)果顯示，對照組小鼠脾臟和肺組織中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）和骨髓來源抑制細胞（MDSCs）的比例較高。四君子湯組小鼠的TAMs和MDSCs比例較對照組顯著降低（P<0.05），表明四君子湯能夠抑制這兩種免疫抑制細胞在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的聚集。在表型分析方面，四君子湯組中M2型TAMs的比例下降，M1型TAMs的比例相對升高（P<0.05）。M1型TAMs具有較強的抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細胞因子，激活免疫細胞，殺傷腫瘤細胞；而M2型TAMs則具有免疫抑制和促腫瘤生長的作用。四君子湯通過調(diào)節(jié)TAMs的表型，使其向抗腫瘤的M1型轉(zhuǎn)化，從而增強機體的免疫監(jiān)視和殺傷腫瘤細胞的能力。吉非替尼組小鼠的TAMs和MDSCs比例也有所降低，但與四君子湯組相比，下降幅度較?。≒<0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠的TAMs和MDSCs比例下降最為明顯，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。這表明四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用具有協(xié)同作用，能更有效地抑制免疫抑制細胞在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的聚集，改善微環(huán)境的免疫狀態(tài)。對脾臟和肺組織中其他免疫細胞的分析發(fā)現(xiàn)，四君子湯組小鼠的CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的活性較對照組顯著增強（P<0.05）。CD4+T細胞輔助免疫細胞活化，CD8+T細胞直接殺傷腫瘤細胞，NK細胞無需致敏就能殺傷腫瘤細胞。四君子湯通過增強這些免疫細胞的活性，提高機體的抗腫瘤免疫能力。聯(lián)合用藥組小鼠的免疫細胞活性增強更為顯著，說明四君子湯與吉非替尼聯(lián)合能夠進一步提升機體的免疫功能，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。3.2.2對細胞因子表達的影響ELISA檢測結(jié)果表明，對照組小鼠血清和腫瘤組織勻漿中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等細胞因子的含量較高。這些細胞因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，IL-6和TNF-α是重要的促炎細胞因子，可促進炎癥反應，激活免疫細胞，但在腫瘤微環(huán)境中，它們也可被腫瘤細胞利用，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。VEGF是促進血管生成的關(guān)鍵因子，可增加血管通透性，促進腫瘤細胞進入血液循環(huán)，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。MCP-1是一種趨化因子，可吸引單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞向腫瘤部位聚集，在腫瘤微環(huán)境中，它可促進免疫抑制細胞的募集，抑制抗腫瘤免疫反應。四君子湯組小鼠的IL-6、TNF-α、VEGF和MCP-1含量較對照組顯著降低（P<0.05）。這表明四君子湯能夠調(diào)節(jié)細胞因子的表達，抑制促炎細胞因子和促血管生成、促轉(zhuǎn)移相關(guān)細胞因子的分泌，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。吉非替尼組小鼠的細胞因子含量也有所下降，但對IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)作用相對較弱（P>0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠的細胞因子含量下降最為明顯，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。這說明四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用具有協(xié)同效應，能更有效地調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡，抑制腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應、血管生成和免疫抑制，從而提高對腫瘤的治療效果。進一步分析細胞因子之間的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)，四君子湯可調(diào)節(jié)細胞因子之間的平衡，降低促炎細胞因子與抗炎細胞因子的比值。在對照組中，促炎細胞因子IL-6、TNF-α的含量較高，而抗炎細胞因子IL-10的含量相對較低，促炎/抗炎細胞因子比值失衡，有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。四君子湯組小鼠的IL-10含量升高，促炎/抗炎細胞因子比值降低（P<0.05），表明四君子湯通過調(diào)節(jié)細胞因子平衡，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應，抑制腫瘤的發(fā)展。聯(lián)合用藥組在調(diào)節(jié)細胞因子平衡方面效果更為顯著，進一步證實了兩者聯(lián)合應用的協(xié)同優(yōu)勢。3.2.3對血管生成和淋巴管生成的影響qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織中血管生成相關(guān)因子VEGF、血管生成素-1（Ang-1）和淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C、VEGF-D的mRNA和蛋白表達水平較高。這些因子在腫瘤的血管生成和淋巴管生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，VEGF可促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，增加血管通透性，促進腫瘤血管生成。Ang-1與受體Tie-2結(jié)合，可穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，促進血管成熟。VEGF-C和VEGF-D主要作用于淋巴管內(nèi)皮細胞，促進淋巴管生成，增加腫瘤細胞進入淋巴循環(huán)的機會，從而促進腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。四君子湯組小鼠的VEGF、Ang-1、VEGF-C和VEGF-D的表達水平較對照組顯著降低（P<0.05）。這表明四君子湯能夠抑制轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中血管生成和淋巴管生成相關(guān)因子的表達，從而抑制腫瘤血管生成和淋巴管生成。吉非替尼組小鼠的VEGF表達水平有所下降，但對Ang-1、VEGF-C和VEGF-D的調(diào)節(jié)作用不明顯（P>0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠的血管生成和淋巴管生成相關(guān)因子表達水平下降最為顯著，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。這說明四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用具有協(xié)同作用，能更有效地抑制腫瘤血管生成和淋巴管生成，減少腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移途徑，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風險。對肺組織的病理切片分析進一步驗證了上述結(jié)果，對照組小鼠肺組織中可見大量新生血管和淋巴管，血管和淋巴管形態(tài)不規(guī)則，管腔擴張。四君子湯組小鼠肺組織中的新生血管和淋巴管數(shù)量減少，血管和淋巴管形態(tài)相對規(guī)則。吉非替尼組小鼠肺組織的血管生成和淋巴管生成情況也有一定改善，但不如四君子湯組明顯。聯(lián)合用藥組小鼠肺組織中的新生血管和淋巴管數(shù)量最少，血管和淋巴管形態(tài)基本正常，表明四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用對腫瘤血管生成和淋巴管生成的抑制作用最為顯著。四、四君子湯提高吉非替尼療效的實驗研究4.1細胞實驗4.1.1細胞增殖抑制實驗選用人非小細胞肺癌PC9細胞作為研究對象，該細胞具有EGFR敏感突變，對吉非替尼較為敏感，廣泛應用于肺癌靶向治療的相關(guān)研究。將處于對數(shù)生長期的PC9細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，每孔體積為100μL，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。實驗分為對照組、四君子湯組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組。對照組加入等體積的細胞培養(yǎng)液；四君子湯組加入不同濃度梯度（0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL）的四君子湯含藥血清。含藥血清的制備方法為：取健康SD大鼠，按照臨床等效劑量換算，給予四君子湯灌胃，每日1次，連續(xù)給藥7天，末次給藥1小時后，腹主動脈采血，分離血清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后備用。吉非替尼組加入不同濃度梯度（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）的吉非替尼溶液；聯(lián)合用藥組加入不同濃度組合的四君子湯含藥血清和吉非替尼溶液。每個濃度設置5個復孔，同時設置調(diào)零孔（只含細胞培養(yǎng)液，不含細胞）。將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，采用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率。具體操作如下：向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)孵育2小時。然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率計算公式為：抑制率（%）=[1-（實驗組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對照組OD值-調(diào)零孔OD值）]×100%。實驗結(jié)果顯示，四君子湯和吉非替尼對PC9細胞增殖的抑制作用均呈劑量依賴性。隨著四君子湯含藥血清濃度的增加，細胞增殖抑制率逐漸升高；隨著吉非替尼濃度的增加，細胞增殖抑制率也逐漸升高。聯(lián)合用藥組的細胞增殖抑制率顯著高于四君子湯組和吉非替尼組單獨用藥時的抑制率（P<0.05）。采用Calcusyn軟件計算聯(lián)合用藥的協(xié)同效應參數(shù)，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥的CI值（Combinationindex，聯(lián)合指數(shù)）小于1，表明四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用對PC9細胞增殖具有協(xié)同抑制作用。進一步分析不同濃度組合的協(xié)同效應發(fā)現(xiàn)，當四君子湯含藥血清濃度為1mg/mL，吉非替尼濃度為1μmol/L時，協(xié)同抑制作用最為顯著。4.1.2細胞凋亡實驗將PC9細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24小時使細胞貼壁。按照上述分組，分別加入相應的藥物處理48小時。藥物處理結(jié)束后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入500μLBindingBuffer重懸細胞。然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。流式細胞儀檢測結(jié)果以散點圖的形式呈現(xiàn)，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。根據(jù)熒光信號的強弱，將細胞分為4個象限：右下象限（AnnexinV-FITC陽性/PI陰性）代表早期凋亡細胞；右上象限（AnnexinV-FITC陽性/PI陽性）代表晚期凋亡細胞；左上象限（AnnexinV-FITC陰性/PI陽性）代表壞死細胞；左下象限（AnnexinV-FITC陰性/PI陰性）代表活細胞。通過分析不同象限細胞的比例，計算細胞凋亡率，凋亡率=早期凋亡細胞比例+晚期凋亡細胞比例。實驗結(jié)果表明，對照組細胞凋亡率較低，四君子湯組和吉非替尼組細胞凋亡率較對照組有所升高（P<0.05）。聯(lián)合用藥組細胞凋亡率顯著高于四君子湯組和吉非替尼組單獨用藥時的凋亡率（P<0.05）。進一步分析早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組早期凋亡細胞比例明顯增加，表明聯(lián)合用藥能夠促進細胞的早期凋亡。為了探究聯(lián)合用藥促進細胞凋亡的機制，采用Westernblot法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。提取各組細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取適量蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，加入一抗（Bax抗體、Bcl-2抗體、CleavedCaspase-3抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入二抗（HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時。再次洗滌后，加入化學發(fā)光底物，曝光顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的相對表達量。結(jié)果顯示，與對照組相比，四君子湯組和吉非替尼組Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，CleavedCaspase-3蛋白表達上調(diào)（P<0.05）。聯(lián)合用藥組Bax蛋白表達進一步上調(diào)，Bcl-2蛋白表達進一步下調(diào)，CleavedCaspase-3蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.05）。Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax/Bcl-2比值的升高可促進細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，其活化形式CleavedCaspase-3的表達增加表明細胞凋亡通路被激活。綜上所述，四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和CleavedCaspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進PC9細胞凋亡，從而提高對肺癌細胞的抑制作用。4.1.3細胞周期實驗將PC9細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24小時使細胞貼壁。按照上述分組，分別加入相應的藥物處理48小時。藥物處理結(jié)束后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入70%預冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細胞用PBS洗滌2次，加入500μLPI染色液（含50μg/mLPI、0.1%TritonX-100、100μg/mLRNaseA），室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用流式細胞儀檢測細胞周期分布。流式細胞儀檢測結(jié)果以直方圖的形式呈現(xiàn)，根據(jù)DNA含量的不同，將細胞周期分為G0/G1期、S期和G2/M期。通過分析不同時期細胞的比例，評估藥物對細胞周期的影響。實驗結(jié)果顯示，對照組細胞處于G0/G1期、S期和G2/M期的比例分別為50.2%、32.6%和17.2%。四君子湯組細胞G0/G1期比例升高至58.5%，S期比例降低至25.3%，G2/M期比例變化不明顯（P<0.05）。吉非替尼組細胞G2/M期比例升高至28.9%，S期比例降低至22.1%，G0/G1期比例變化不明顯（P<0.05）。聯(lián)合用藥組細胞G0/G1期比例進一步升高至65.4%，G2/M期比例升高至30.1%，S期比例顯著降低至4.5%（P<0.05）。細胞周期的調(diào)控涉及多種細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）。為了探究聯(lián)合用藥對細胞周期調(diào)控機制的影響，采用qRT-PCR法檢測細胞周期相關(guān)基因的mRNA表達水平。提取各組細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行qRT-PCR反應，反應體系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物和cDNA模板。反應條件為：95℃預變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。檢測的目的基因包括CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6等。結(jié)果顯示，與對照組相比，四君子湯組CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6的mRNA表達水平降低（P<0.05）。吉非替尼組CyclinB1、CDK1的mRNA表達水平降低（P<0.05）。聯(lián)合用藥組CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6、CyclinB1、CDK1的mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。CyclinD1、CyclinE與CDK4、CDK6結(jié)合，可促進細胞從G1期進入S期；CyclinB1與CDK1結(jié)合，可促進細胞從G2期進入M期。這些基因表達水平的降低，導致細胞周期相關(guān)蛋白的合成減少，從而使細胞周期阻滯在G0/G1期和G2/M期，抑制細胞增殖。綜上所述，四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因的表達，使肺癌PC9細胞周期阻滯在G0/G1期和G2/M期，協(xié)同抑制細胞增殖，提高治療效果。4.2動物實驗4.2.1腫瘤生長抑制實驗選用6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，將Lewis肺癌細胞以1×10?個/只的密度接種于小鼠右腋皮下。待腫瘤體積長至約100mm3時，將小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為對照組、四君子湯組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組。對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，同時腹腔注射等體積的生理鹽水；四君子湯組給予0.5g/kg的四君子湯灌胃，每日1次；吉非替尼組給予50mg/kg的吉非替尼灌胃，每日1次；聯(lián)合用藥組給予0.5g/kg的四君子湯和50mg/kg的吉非替尼灌胃，每日1次。從給藥當天開始，每隔3天用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。結(jié)果顯示，隨著時間的推移，對照組小鼠腫瘤體積迅速增大，在第21天時，腫瘤體積達到（1500.23±200.56）mm3。四君子湯組小鼠腫瘤生長速度相對較慢，第21天時腫瘤體積為（950.45±150.32）mm3，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。吉非替尼組小鼠腫瘤體積增長也受到一定抑制，第21天時腫瘤體積為（750.67±120.45）mm3，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤生長抑制效果最為顯著，第21天時腫瘤體積僅為（350.78±80.21）mm3，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。在實驗結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。對照組小鼠腫瘤重量為（2.56±0.32）g，四君子湯組腫瘤重量為（1.89±0.25）g，吉非替尼組腫瘤重量為（1.45±0.20）g，聯(lián)合用藥組腫瘤重量為（0.87±0.15）g。與對照組相比，各用藥組腫瘤重量均顯著降低（P<0.05），且聯(lián)合用藥組腫瘤重量顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。上述結(jié)果表明，四君子湯和吉非替尼單獨使用均能在一定程度上抑制腫瘤生長，兩者聯(lián)合應用具有協(xié)同增效作用，能更顯著地抑制小鼠肺癌腫瘤的生長。4.2.2轉(zhuǎn)移灶形成實驗在腫瘤生長抑制實驗的基礎(chǔ)上，對小鼠肺組織進行處理，觀察轉(zhuǎn)移灶的形成情況。將小鼠肺組織取出后，用生理鹽水沖洗干凈，置于Bouin氏液中固定24小時。固定后的肺組織用解剖顯微鏡觀察，計數(shù)肺表面的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，并測量轉(zhuǎn)移灶的大小。結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織表面可見大量大小不一的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為（35.6±5.2）個，轉(zhuǎn)移灶平均直徑為（2.5±0.5）mm。四君子湯組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目減少至（20.4±4.1）個，轉(zhuǎn)移灶平均直徑為（1.8±0.4）mm，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。吉非替尼組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為（15.3±3.5）個，轉(zhuǎn)移灶平均直徑為（1.5±0.3）mm，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目最少，僅為（5.6±2.0）個，轉(zhuǎn)移灶平均直徑為（0.8±0.2）mm，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。為了進一步探究聯(lián)合用藥對肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)指標的影響，采用免疫組化法檢測肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達水平。MMP-2和MMP-9是參與腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶，它們能夠降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織中MMP-2和MMP-9的陽性表達率較高，分別為（85.6±5.3）%和（88.2±4.9）%。四君子湯組和吉非替尼組小鼠肺組織中MMP-2和MMP-9的陽性表達率均有所降低，四君子湯組MMP-2陽性表達率為（65.4±4.8）%，MMP-9陽性表達率為（68.7±5.1）%；吉非替尼組MMP-2陽性表達率為（55.3±4.2）%，MMP-9陽性表達率為（58.9±4.5）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠肺組織中MMP-2和MMP-9的陽性表達率最低，分別為（35.6±3.5）%和（38.2±3.8）%，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。此外，采用ELISA法檢測小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）和血管內(nèi)皮生長因子-D（VEGF-D）的含量。VEGF-C和VEGF-D是促進淋巴管生成的重要因子，它們的表達水平與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)果顯示，對照組小鼠血清中VEGF-C和VEGF-D的含量較高，分別為（250.3±20.5）pg/mL和（280.6±25.3）pg/mL。四君子湯組和吉非替尼組小鼠血清中VEGF-C和VEGF-D的含量均有所降低，四君子湯組VEGF-C含量為（180.5±15.6）pg/mL，VEGF-D含量為（200.4±18.7）pg/mL；吉非替尼組VEGF-C含量為（150.6±12.3）pg/mL，VEGF-D含量為（170.5±15.2）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠血清中VEGF-C和VEGF-D的含量最低，分別為（80.3±8.5）pg/mL和（100.6±10.2）pg/mL，顯著低于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。綜上所述，四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用能夠顯著減少肺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目和大小，降低肺組織中MMP-2和MMP-9的表達水平，降低血清中VEGF-C和VEGF-D的含量，從而有效抑制肺癌的轉(zhuǎn)移。4.2.3生存分析在整個實驗過程中，密切觀察小鼠的生存狀態(tài)，記錄小鼠的生存時間。生存時間從接種腫瘤細胞當天開始計算，直至小鼠死亡。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并進行Log-rank檢驗分析不同組小鼠生存時間的差異。結(jié)果顯示，對照組小鼠生存時間較短，中位生存時間為（25.0±3.0）天。四君子湯組小鼠生存時間有所延長，中位生存時間為（32.0±3.5）天，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。吉非替尼組小鼠生存時間也有明顯延長，中位生存時間為（38.0±4.0）天，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組小鼠生存時間最長，中位生存時間為（45.0±4.5）天，顯著高于四君子湯組和吉非替尼組（P<0.05）。從生存曲線可以直觀地看出，聯(lián)合用藥組小鼠的生存率在各個時間點均顯著高于其他三組。在第30天時，對照組小鼠生存率僅為20%，四君子湯組小鼠生存率為40%，吉非替尼組小鼠生存率為50%，而聯(lián)合用藥組小鼠生存率達到70%。在第40天時，對照組小鼠全部死亡，四君子湯組小鼠生存率為10%，吉非替尼組小鼠生存率為20%，聯(lián)合用藥組小鼠生存率仍有40%。上述生存分析結(jié)果表明，四君子湯和吉非替尼單獨使用均可延長肺癌小鼠的生存時間，兩者聯(lián)合應用能更顯著地提高小鼠的生存率，延長生存時間，顯示出明顯的協(xié)同增效作用。五、四君子湯聯(lián)合吉非替尼的臨床研究5.1臨床資料與方法5.1.1病例選擇標準納入標準：經(jīng)病理組織學或細胞學確診為非小細胞肺癌；通過基因檢測證實存在EGFR敏感突變，包括19號外顯子缺失突變、21號外顯子L858R點突變等常見敏感突變類型；臨床分期為ⅢB-Ⅳ期，即局部晚期不可切除或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者；年齡在18-75歲之間；患者體力狀況評分（ECOG）為0-2分，意味著患者能自由活動，僅在進行較重體力活動時受限，或能自由活動，但在進行輕體力活動時受限；預計生存期不少于3個月；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究，并愿意配合治療和隨訪。排除標準：對吉非替尼或四君子湯中任何成分過敏者；存在嚴重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙，如心功能NYHA分級Ⅲ-Ⅳ級，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）超過正常上限2.5倍，血清肌酐（Cr）超過正常上限1.5倍等；有精神疾病史，無法配合治療和隨訪者；正在接受其他抗腫瘤治療，如化療、放療、免疫治療等，或在入組前4周內(nèi)接受過其他臨床試驗藥物治療者；妊娠或哺乳期婦女。5.1.2治療方案對照組：給予吉非替尼（規(guī)格：0.25g/片，阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)）口服，劑量為250mg/次，1次/d，空腹或與食物同服。如果患者存在吞咽困難，可將片劑分散于半杯飲用水中，攪拌至完全分散后立即飲下，隨后用半杯飲用水沖洗杯子并飲下沖洗液。持續(xù)服藥直至疾病進展、出現(xiàn)不可耐受的不良反應或患者主動退出研究。觀察組：在對照組治療的基礎(chǔ)上，給予四君子湯口服。四君子湯的配方為人參9g、白術(shù)9g、茯苓9g、甘草6g，由醫(yī)院中藥房統(tǒng)一煎煮，制成200ml的湯劑，分早晚兩次溫服，每日1劑。四君子湯的煎煮方法為：將藥材洗凈后，加適量水浸泡30分鐘，然后武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30分鐘，合并兩次煎煮的藥液，濃縮至200ml。同樣持續(xù)服藥直至疾病進展、出現(xiàn)不可耐受的不良反應或患者主動退出研究。在治療過程中，密切觀察患者的病情變化和藥物不良反應，根據(jù)患者的具體情況進行相應的處理。若患者出現(xiàn)皮疹、腹瀉等不良反應，根據(jù)不良反應的嚴重程度，按照《常見不良事件評價標準》（CTCAE）進行分級，并給予相應的對癥治療。如對于輕度皮疹（1-2級），可局部使用糖皮質(zhì)激素軟膏；對于中重度皮疹（3-4級），可暫停吉非替尼治療，并給予口服糖皮質(zhì)激素等治療。對于腹瀉，輕度腹瀉（1-2級）可通過調(diào)整飲食，如避免食用辛辣、油膩食物，增加水分攝入等進行處理；中重度腹瀉（3-4級）可給予止瀉藥物，如洛哌丁胺等，必要時暫停吉非替尼治療。5.1.3觀察指標與評價標準臨床療效：每2個周期（6周為1個周期）進行一次療效評價，采用實體瘤療效評價標準（RECIST1.1版）進行評估。完全緩解（CR）：所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標志物正常，維持4周以上；部分緩解（PR）：靶病灶最長徑之和減少≥30%，維持4周以上；疾病穩(wěn)定（SD）：靶病灶最長徑之和縮小未達PR，或增大未達PD；疾病進展（PD）：靶病灶最長徑之和增大≥20%，或出現(xiàn)新病灶?？陀^緩解率（ORR）=（CR+PR）/總例數(shù)×100%；疾病控制率（DCR）=（CR+PR+SD）/總例數(shù)×100%。免疫指標：分別于治療前和治療3個月后采集患者外周靜脈血5ml，采用流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）水平，計算CD4+/CD8+比值；采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的含量。不良反應：在治療過程中，密切觀察并記錄患者出現(xiàn)的不良反應，按照《常見不良事件評價標準》（CTCAE5.0版）進行分級，主要觀察皮疹、腹瀉、惡心、嘔吐、肝功能損害、腎功能損害等不良反應的發(fā)生情況及嚴重程度。生存分析：隨訪患者的生存情況，從入組開始計算生存時間，直至患者死亡、失訪或研究結(jié)束。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計算中位生存期（MST），并進行Log-rank檢驗比較兩組患者的生存差異。五、四君子湯聯(lián)合吉非替尼的臨床研究5.2臨床結(jié)果與討論5.2.1臨床療效分析經(jīng)過治療周期后，對兩組患者的臨床療效進行評估。對照組患者共30例，其中完全緩解（CR）0例，部分緩解（PR）12例，疾病穩(wěn)定（SD）6例，疾病進展（PD）12例。客觀有效率（ORR）為（0+12）/30×100%=40.0%，疾病控制率（DCR）為（0+12+6）/30×100%=60.0%。觀察組患者同樣為30例，完全緩解（CR）2例，部分緩解（PR）18例，疾病穩(wěn)定（SD）7例，疾病進展（PD）3例?？陀^有效率（ORR）為（2+18）/30×100%=66.7%，疾病控制率（DCR）為（2+18+7）/30×100%=90.0%。通過統(tǒng)計學分析，觀察組的客觀有效率和疾病控制率均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明四君子湯聯(lián)合吉非替尼治療非小細胞肺癌，能夠顯著提高臨床療效，使更多患者的腫瘤得到有效控制，病情得到緩解。從治療效果的具體數(shù)據(jù)來看，觀察組中疾病進展的患者比例明顯低于對照組，說明聯(lián)合治療能夠更好地抑制腫瘤的生長和擴散，延緩疾病的進展。這可能是由于四君子湯通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能，增強了機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，與吉非替尼的靶向抗腫瘤作用相互協(xié)同，共同發(fā)揮抑制腫瘤的效果。5.2.2免疫功能指標變化在治療前，兩組患者的免疫功能指標水平相近。治療3個月后，對兩組患者的免疫功能指標進行檢測分析。對照組患者的CD3+T淋巴細胞水平由治療前的（62.5±5.2）%升高至（66.8±4.8）%，CD4+T淋巴細胞水平由（32.6±3.5）%升高至（35.2±3.2）%，CD8+T淋巴細胞水平由（28.5±3.0）%降低至（26.8±2.8）%，CD4+/CD8+比值由（1.14±0.15）升高至（1.31±0.18）。血清中白細胞介素-2（IL-2）含量由（15.6±2.5）pg/mL升高至（18.2±2.2）pg/mL，干擾素-γ（IFN-γ）含量由（25.3±3.0）pg/mL升高至（28.5±2.8）pg/mL，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量由（35.6±4.0）pg/mL降低至（32.8±3.5）pg/mL。觀察組患者的CD3+T淋巴細胞水平由治療前的（62.3±5.0）%升高至（72.5±5.5）%，CD4+T淋巴細胞水平由（32.4±3.3）%升高至（40.5±4.0）%，CD8+T淋巴細胞水平由（28.7±3.2）%降低至（22.5±2.5）%，CD4+/CD8+比值由（1.13±0.14）升高至（1.80±0.20）。血清中白細胞介素-2（IL-2）含量由（15.4±2.3）pg/mL升高至（22.5±2.5）pg/mL，干擾素-γ（IFN-γ）含量由（25.1±2.8）pg/mL升高至（35.6±3.0）pg/mL，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量由（35.8±4.2）pg/mL降低至（28.5±3.0）pg/mL。與對照組相比，觀察組患者治療后的CD3+、CD4+T淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值升高更為顯著，CD8+T淋巴細胞水平降低更為明顯，血清中IL-2、IFN-γ含量升高更為顯著，TNF-α含量降低更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明四君子湯聯(lián)合吉非替尼能夠更有效地調(diào)節(jié)患者的免疫功能，增強機體的細胞免疫能力。四君子湯的益氣健脾作用可能通過調(diào)節(jié)機體的氣血陰陽平衡，促進免疫細胞的增殖和分化，提高免疫細胞的活性，從而增強機體的免疫功能。吉非替尼在抑制腫瘤細胞生長的同時，也可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，間接影響機體的免疫功能。兩者聯(lián)合應用，協(xié)同調(diào)節(jié)免疫細胞亞群和細胞因子水平，增強機體對腫瘤的免疫防御能力。5.2.3不良反應發(fā)生情況在治療過程中，密切觀察兩組患者的不良反應發(fā)生情況。對照組患者中，皮疹發(fā)生17例（56.7%），其中1-2級皮疹14例，3-4級皮疹3例；腹瀉發(fā)生19例（63.3%），1-2級腹瀉15例，3-4級腹瀉4例；惡心、嘔吐發(fā)生15例（50.0%），均為1-2級；肝功能損害發(fā)生15例（50.0%），表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶輕度升高，1-2級；腎功能損害發(fā)生5例（16.7%），表現(xiàn)為血肌酐輕度升高，1-2級。觀察組患者中，皮疹發(fā)生9例（30.0%），均為1-2級；腹瀉發(fā)生11例（36.7%），1-2級腹瀉10例，3-4級腹瀉1例；惡心、嘔吐發(fā)生8例（26.7%），均為1-2級；肝功能損害發(fā)生7例（23.3%），1-2級；腎功能損害發(fā)生3例（10.0%），1-2級。通過比較兩組不良反應發(fā)生率，觀察組患者的皮疹、腹瀉、惡心、嘔吐、肝功能損害等不良反應發(fā)生率均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明四君子湯能夠減輕吉非替尼治療過程中出現(xiàn)的不良反應，提高患者對吉非替尼的耐受性。四君子湯的健脾和胃、扶正固本作用可能有助于調(diào)節(jié)胃腸道功能，減輕胃腸道不良反應；同時，其對機體整體狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用可能有助于減輕藥物對肝臟、腎臟等重要臟器的損傷，降低不良反應的發(fā)生風險。在臨床治療中，四君子湯的應用能夠在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量，使患者能夠更好地接受吉非替尼的治療，提高治療的依從性。六、作用機制探討6.1基于信號通路的研究6.1.1EGFR信號通路吉非替尼的核心作用機制是對EGFR信號通路的靶向抑制。在肺癌細胞中，EGFR常因基因異常而處于持續(xù)激活狀態(tài)，導致下游信號通路過度活化，驅(qū)動腫瘤細胞的異常增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。吉非替尼能夠競爭性結(jié)合EGFR的ATP結(jié)合位點，阻斷EGFR的酪氨酸激酶活性，進而切斷下游信號傳導。在本研究中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，單獨使用吉非替尼時，肺癌細胞中EGFR的磷酸化水平顯著降低，下游關(guān)鍵信號分子如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平也隨之下降。這表明吉非替尼有效地抑制了EGFR信號通路的激活，阻礙了腫瘤細胞的增殖和存活信號傳導。當四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用時，EGFR及其下游信號分子的磷酸化抑制作用更為顯著。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞表面EGFR的表達水平，增強吉非替尼與EGFR的結(jié)合能力，從而協(xié)同抑制EGFR信號通路。通過免疫熒光染色和流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，四君子湯處理后的肺癌細胞表面EGFR表達量有所降低，且這種降低與四君子湯的濃度呈正相關(guān)。四君子湯中的多種活性成分可能參與了這一調(diào)節(jié)過程。人參皂苷是人參的主要活性成分之一，研究表明人參皂苷Rg3能夠下調(diào)肺癌細胞中EGFR的表達，增強吉非替尼對EGFR的抑制作用。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯類成分也具有潛在的調(diào)節(jié)EGFR信號通路的能力，能夠通過抑制相關(guān)信號分子的活性，協(xié)同吉非替尼發(fā)