CCSB41T/CVMA158—2024牛分枝桿菌抗體熒光偏振檢測方法Fluorescencepolarizationassayfordetectionofantibodiesagainst2024-5-8發(fā)布2024-5-8實(shí)施中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布IT/CVMA158—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、山東生科尚儀生物技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：楊顯超、于慧茹、王建、趙洪進(jìn)、莊勇、楊德全、鞠厚斌、李鑫、沈海瀟、葛菲菲、向蒙、馮桂丹、張玉杰、唐聰圣、盧軍。T/CVMA158—20241牛分枝桿菌抗體熒光偏振檢測方法本文件規(guī)定了牛分枝桿菌抗體熒光偏振試驗(yàn)的試驗(yàn)原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品的采集和保存、操作方法和結(jié)果判定。本文件適用于對(duì)牛分枝桿菌抗體的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理熒光偏振方法的原理：溶液中的分子作隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，大分子比轉(zhuǎn)動(dòng)快的小分子發(fā)射更多的偏振光。將牛分枝桿菌三種特異性蛋白質(zhì)MPB70、MPB83和ESAT-6的重組融合蛋白用硫氰熒光素（FITC）進(jìn)行標(biāo)記作為抗原，當(dāng)加到待檢血清中，若有相應(yīng)抗體與標(biāo)記抗原結(jié)合，就會(huì)降低其轉(zhuǎn)動(dòng)速度，發(fā)射更多的偏振光，用熒光偏振儀檢測待檢血清的偏振光增加值即可判斷血清中是否存在牛分枝桿菌抗體。5試劑和材料5.1試劑5.1.1總則：除非另有說明，所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。5.1.2陽性對(duì)照：牛分枝桿菌抗體陽性血清。5.1.3陰性對(duì)照：牛分枝桿菌抗體陰性血清。5.1.4樣品稀釋緩沖液配制方法見附錄A。5.1.5結(jié)合物：用硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記牛分枝桿菌MPB70、MPB83和ESAT-6重組融合蛋白。5.2材料2T/CVMA158—20245.2.196孔黑色平板微孔板。5.2.2移液器吸頭。6儀器和設(shè)備6.1熒光偏振儀。6.2微量板振蕩器。6.3微量移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）。7樣品的采集與處理按照NY/T541進(jìn)行。使用不含抗凝劑的采血管或注射器采集血液，分離血清。8操作方法8.1將試劑和樣品恢復(fù)至室溫。8.2制備的樣品稀釋緩沖液應(yīng)避免有顆粒物，配置后的溶液放置室溫保存，需在1個(gè)月內(nèi)使用。8.3分別取20μL陰性對(duì)照加入96孔黑色平板微孔板A1、B1、C1孔中，取20μL陽性對(duì)照加入96孔黑色平板微孔板D1孔中。取20μL待檢血清樣品加入96孔黑色平板微孔板內(nèi)其余相應(yīng)孔中。向96孔黑色平板微孔板加樣或加液體時(shí)應(yīng)避免氣泡產(chǎn)生。8.4取180μL樣品稀釋緩沖液加入到96孔黑色平板微孔板的每個(gè)反應(yīng)孔中，置振蕩器上振蕩2min。8.5將96孔黑色平板微孔板室溫孵育3min～5min后，置熒光偏振儀上讀取陰陽性對(duì)照和樣品的初始值，作為空白偏振值。8.6取10μL結(jié)合物加入到每個(gè)反應(yīng)孔中，置振蕩器上振蕩2min。8.7將96孔黑色平板微孔板置室溫孵育2min～3min，置熒光偏振儀上讀取最終偏振值。9結(jié)果判定對(duì)照或樣品的偏振值計(jì)算見式（1）：FP=A-B（1）FP——對(duì)照或樣品的偏振值，mP；A——對(duì)照或樣品的最終偏振值，mP；B——對(duì)照或樣品的初始偏振值，mP。當(dāng)陽性對(duì)照的偏振值在120mP～250mP之間，陰性對(duì)照的偏振值在70mP～90mP之間時(shí)，方可進(jìn)行被檢樣品的結(jié)果判定。若陽性對(duì)照或陰性對(duì)照的偏振值超過規(guī)定的范圍，需根據(jù)儀器手冊(cè)的說明書重新校正儀器。結(jié)果判定計(jì)算公式（2）：T/CVMA158—20243△=FP-C..（2）△——樣品的偏振值與陰性對(duì)照平均值的差值，mP；FP——對(duì)照或樣品的偏振值，mP；C——陰性對(duì)照平均偏振值，mP。當(dāng)被檢樣品△<10mP，樣品判為陰性；10mP≤△≤20mP，樣品判為可疑；△>20mP，樣品判為陽性。可疑樣品應(yīng)重新檢測兩次。如果兩次復(fù)檢