無創(chuàng)胚胎植入前非整倍體檢測技術的研究進展及展望胚胎植入前非整倍體檢測(preimplantationgenetictestingforaneuploidies,PGT-A)技術是目前高齡(年齡≥35歲)、反復的胚胎染色體檢測以及胚胎質量評估方法引起了生殖醫(yī)學工作者的DNA,cfDNA)在無創(chuàng)胚胎植入前非整倍體檢測(non-invasivepreimplantationgenetictes中的研究進展及其存在缺陷，并提出應用單分子納米孔技術檢測cfDNA進行niPGT-A的創(chuàng)新性猜想，為niPGT-A技術的進一步研究提胚胎植入前非整倍體檢測(preimplantationgenetictestingforaneuploidies,PGT-A)是一種檢測體外受精產生的胚胎中染色高齡(年齡≥35歲)、反復種植失敗、復發(fā)性流產患者提高胚胎種但該操作為有創(chuàng)檢查，是否會對胚胎的后續(xù)發(fā)育造成潛在威脅及其遠期影響尚需進一步驗證。尋找無創(chuàng)、安全、準確有效的胚胎染色體檢測以及胚胎質量評估方法給生殖醫(yī)學工作者帶來了挑戰(zhàn)。隨著二代測序(next-generationsequencing,NGS)技術的發(fā)展與胚胎發(fā)育時釋放的游離DNA(cell-freeDNA,cfDNA)的發(fā)現(xiàn)，通過NGS技術檢測cfDNA反映胚胎染色體整倍性，實現(xiàn)了無創(chuàng)PGT-A(non-invasivePGT-A,niPGT-A)。然而，其檢測結果的準確性受到眾多因素的影響，在臨床廣泛應用尚被制約。本文概述了近年來通過NGS檢測cfDNA在niPGT-A中的研究進展及其存在缺陷，并提出應用單分子納米孔技術檢測cfDNA進行niPGT-A的創(chuàng)新性猜想，為niPGT-A技術的進一步研究提供新的思路niPGT-A是輔助生殖技術的重要革新，近年來在臨床研究及應用中展現(xiàn)出了顯著的發(fā)展?jié)摿?。相較于傳統(tǒng)PGT-A需要進行侵入性活檢操作，niPGT-A的檢測材料為囊胚培養(yǎng)液中的cfDNA,可以在避免胚胎損傷風險的同時實現(xiàn)染色體非整倍體篩查。將17對夫婦共42個胚胎培養(yǎng)液進行檢測，檢測結果與相應全胚胎染色體倍性信息進行比較，發(fā)現(xiàn)染色體拷貝數(shù)變異檢測的成功率可達到100%,與TE細胞染色體整倍體的結果相比一致率達到了85.7%,計算得到靈敏度及特異度分別可達88.2%和84.0%。得到驗證后，作者對7對染色體易位平衡或復發(fā)性流產的夫婦進行了niPGT-A,選擇染其中5對已經實現(xiàn)了健康的活產。該研究展現(xiàn)出的高擴增率與高一致性，使得niPGT-A在臨床應用上更具意義。2020年Franco等[2]報道了第一例基于niPGT-A獲得活產的巴西女嬰，同樣提出niPGT-A等[3]對52枚囊胚進行niPGT-A并與TE活檢進行對比，研究顯示niPGT-A在胚胎倍性和染色體拷貝數(shù)的一致率方面均高于TE活檢。這些研究結果均提示niPGT-A在輔助生殖技術的臨床應用中具有可觀前景。Metais[4]便在血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了cfDNA的存在，1997年首次證實孕婦血漿中存在胎兒cfDNA,開啟了無創(chuàng)產前篩查(non-invasiveprenataltesting,NIPT)新紀元。如今2013年，Stigliani等[5]首次證明了廢棄胚胎培養(yǎng)液(spent (mitochondrialDNA,mtDNA),與優(yōu)質胚胎樣本相比Hammond等[6]的研究顯示，暴露于胚胎后的培養(yǎng)基中cfDNA含量常發(fā)育過程中的凋亡細胞，作為非整倍體的校正機制存在。然而Vera-Rodriguez等[7]則觀察到非整倍體和整倍體胚胎的培養(yǎng)基中ICM)的整倍體和非整倍體細胞凋亡，整倍體細胞凋亡的非整倍體細胞，且ICM細胞發(fā)生凋亡的比例較TE更高。Gleicher等[8]對此研究提出了質疑，認為TE與培養(yǎng)基直接接觸，為整倍體，故無法確認最終核型，使得假陽性率偏高。對此等[9]的團隊做出回應，認為減數(shù)分裂導致的非整倍體不太可能通最多為40%,此外，通過對嵌合體小鼠胚胎的觀察發(fā)現(xiàn)ICM中非整倍體細胞的凋亡頻率是TE中非整倍體細胞的10倍，由此可推斷PGT-A在TE活檢中出現(xiàn)假陽性最可能的解釋是嵌合體，而非自我校正， [10]通過測序分析培養(yǎng)液中cfDNA的甲基化特征與卵丘細胞或顆粒和TE共同衍生而來，但同時存在來自極體、精子、顆粒細胞DNA的污染。Domingo-Muelas等[11]通過小鼠和人囊胚的活體成像可視1.母源性DNA污染：Xu等[1]研究報道母源性的卵丘-放射冠細胞(具有正常染色體組成)若去除不徹底，殘留細胞可能會在胚胎發(fā)育過程中釋放DNA,導致假陰性結果。Hammond等[6]提出了相同觀點。在Vera-Rodriguez等[7]的研究中，母源DNA污染的樣本高約占1/3,而卵丘細胞污染較極體更多，約占樣本的1/2。 (存在于Y染色體上)和TBC1D3(位于7號染色體上)的比率表明3.胚胎培養(yǎng)液滴體積的影響：Minasi等[13]的研究證實了培5天，小體積(7μL)培養(yǎng)液滴的囊胚形成率顯著高于大體積(35μ [14]同樣提出第4天更換培養(yǎng)基，丟棄第1~3天分泌的潛在降解的DNA,使用體積10μL培養(yǎng)液滴，替代較常使用的30μL培養(yǎng)液滴。Ho等[15]使用25μL培養(yǎng)液滴進行胚胎培養(yǎng)，研究顯示與TE活檢相比，第3天的SCM中cfDNA的倍性一致率為56.3%,第5天為45.5%。Yin等[16]同樣使用了25μL培養(yǎng)液滴進行胚胎培養(yǎng)，研發(fā)育遲緩或阻滯[13]。因此，尋求一個最能平衡自分泌因子有益作用和毒性代謝產物負面影響的培養(yǎng)液滴體積至關重要。此外，Jiao等[17]認為小體積培養(yǎng)液滴(12μL)可以在全基因組擴增(whole更高的cfDNA濃度，更有利于擴增。目前，已有多項研究使用10~15[14,17]。然而最佳培養(yǎng)液滴體積尚未明確，仍需進一步探索。4.cfDNA樣本收集時間的影響：Yeung等[18]通過分析168份SCM樣本，提出SCM可以從第4天到第5天的較窄生長期收集，以提高倍性一致性，因為在第4天將胚胎移至新鮮培養(yǎng)基中，并在第5天等[14]通過分析1301枚囊胚，提出胚胎cfDNA和TE活檢的一致率在第6、第7天時較第5天顯著更好。Hanson等[19]的研究表明，胚胎與培養(yǎng)基的接觸時間與DNA擴增失敗率呈負相關(接觸1dDNA擴增失敗率為96.2%;2d為42.9%;3d進一步下降至15.2%;4d后全部樣本均未出現(xiàn)擴增失敗)。為研究分析。胚胎中存在多個細胞系的現(xiàn)象，最常見的嵌合體分為3類：無序嵌合體、非整倍體嵌合體和二倍體-非整倍體嵌合體。無序嵌合體指細胞常細胞系和不同的非整倍體互補共存于同一胚胎中的現(xiàn)象；二倍體-非整倍體嵌合體描述的嵌合體類型僅涉及分析的一條染色體的三體和(或)單體[21]。根據國際胚胎植入前遺傳診斷學會2021聲明，嵌合率低于20%的胚胎可以被認為是整倍體(可移植),而異常細胞超過80%的胚胎被歸類為非整倍體，其余(20%~80%)可歸為嵌合體 [22]。人類胚胎在發(fā)育的早期著床前階段，嵌合現(xiàn)象十分普遍，出現(xiàn)在20%~30%,甚至50%的胚胎中；然而，在妊娠的后期，嵌合體率似乎急劇下降，據估計，真正的嵌合體胎兒僅在約0.4%的胎兒中流行，活產中的嵌合體約<0.2%。若嵌合閾值設置不當，可能會導致假致妊娠失敗甚至出現(xiàn)畸形胎兒[21,23]。Huang等[3]提出將嵌合閾值設置為60.0%時niPGT可獲得最低假陽性率和假陰性率。目前成測序(sequencingbysynthesis,SBS)、連接測序和離析。第二代短讀長平臺的讀長范圍為35~600bp。DNA模板制備的初從一端(單端讀段)或從兩端(雙端讀段)進行PCR擴增，產生數(shù)百由的3'-OH,并與儀器上的數(shù)據檢測相結合。這種擴增為每個模板配到特定的模板，獲得DNA信息[24-26]。目前，已初步實現(xiàn)了應用NGS檢測cfDNA進行niPGT,然而NGS具有較高的假陽性率[25,27]。通常，在進行NGS之前，cfDNA還決策需求。條單鏈DNA(single-strandedDNA,ssDNA)隨后穿過納米孔的納米級通道(即管腔)。由于不同DNA堿基對電流阻礙程度存在差異，因納米孔隨機準備穿過另一個ssDNA分子進行新的測序[28-30]。(<500bp),但通過技術優(yōu)化仍可發(fā)揮長讀長優(yōu)勢，如使用長片段使用便捷[29-30]。產生獨特的電信號[31]。多項