ICS65.020.01

CCSB04

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T4109—2025

番茄病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程

CodeofpracticeforRT-PCRdetectionoftomatoviruses

2025-07-10發(fā)布2025-08-10實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T4109—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)果蔬標準化技術(shù)委員會（SAM/TC25）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院、內(nèi)蒙古中天現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)開發(fā)有限

責任公司、鄂爾多斯市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心。

本文件主要起草人：張磊、李正男、孫平平、劉燕、王永、楊永青、高婧、廉勇、付崇毅、趙沁、

徐文俊、韓靜宇、張靜春、徐磊、張佳。

I

DB15/T4109—2025

番茄病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了番茄病毒檢測中的術(shù)語和定義、檢測對象、抽樣、取樣、檢測方法和判定規(guī)則等內(nèi)容。

本文件適用于番茄病毒的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T34265Sanger法測序技術(shù)指南

GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評價方法

SN/T2497.21進出口危險化學品安全試驗方法第21部分：瓊脂糖凝膠電泳試驗

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

RNA病毒RNAviruses

核糖核酸病毒，其遺傳物質(zhì)為RNA。

DNA病毒DNAviruses

脫氧核糖核酸病毒，其遺傳物質(zhì)為DNA。

反轉(zhuǎn)錄Reversereversetranscription（RT）

以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA的過程。

互補DNAcomplementaryDNA（cDNA）

由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的、與RNA模板互補的DNA。

聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction（PCR）

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DB15/T4109—2025

利用DNA聚合酶，對DNA或cDNA模板的特定區(qū)域進行體外擴增的技術(shù)。反應(yīng)混合物通常由DNA聚合酶、

脫氧核苷三磷酸、引物和緩沖液組成，反應(yīng)過程主要包括變性、退火和延伸三個步驟。

引物primers

人工合成的具有一定長度的單鏈DNA分子，與DNA模板鏈的特定區(qū)域互補，其3’末端在PCR過程中作

為復制延伸的起始位點。

4檢測對象

主要RNA病毒種類

苜?；ㄈ~病毒（Alfalfamosaicvirus，AMV）。

黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）。

南方番茄病毒（Southerntomatovirus，STV）。

番茄斑駁花葉病毒（Tomatomottlemosaicvirus，ToMMV）。

番茄花葉病毒（Tomatomosaicvirus，ToMV）。

番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）。

主要DNA病毒種類

番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）。

5抽樣方法

采用5點法抽樣。

種植面積在2001m2以內(nèi)（含2001m2），抽檢100株。種植面積在2001m2到20010m2之間（含

20010m2），前2001m2抽100株，之后每增2001m2增檢50株。種植面積超過20010m2時，前20010

m2按上述方法抽樣，之后每增加2001m2增檢20株。

6取樣方法

對樣方內(nèi)的番茄進行采樣，取靠近頂部的新鮮葉或枝條，撣掉灰塵或其他附著物，除去蚜蟲，放置

于自封采樣袋內(nèi)。

采樣點距離檢測點較遠時，用濕紙巾、海綿或布條包裹葉或枝條的切割處，置于采樣自封袋內(nèi)進行

運輸。

樣品在檢測點存儲時間較短時（一般不超過24h），在4℃存放即可。長期存放樣品時，需要將樣

品用液氮預(yù)冷后，保存于-80℃超低溫保存箱。

7檢測方法

樣品前處理

避開葉片中脈，切取葉片組織用于檢測。

2

DB15/T4109—2025

樣品核酸提取

選擇市售的用于提取含有多糖多酚材料的RNA或DNA的試劑盒，按照試劑盒自帶的說明書進行操作。

核酸質(zhì)量評價按照GB/T40974執(zhí)行。

反轉(zhuǎn)錄

DNA病毒檢測不執(zhí)行該步驟。以提取的質(zhì)量合格的總RNA為模板，選擇市售的具有基因組DNA去除功

能的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照試劑盒自帶的說明書進行設(shè)置。

PCR擴增

7.4.1PCR反應(yīng)體系

市售產(chǎn)品通常為預(yù)混液或單品，根據(jù)所選產(chǎn)品提供的說明書，進行PCR反應(yīng)混合物配制，并按說明

書指示加入cDNA或DNA模板以及病毒檢測引物。各種病毒的特異性檢測引物見表1。

表1番茄病毒的特異性檢測引物

病毒名稱引物名稱引物序列/（5’→3’方向）目標DNA片段大小/（bp）

AMVAMV-FaGTGCGTATAGATGCCGGTTC900

AMVAMV-RbGAGCGAATAGGACTTCATACC900

CMVCMV-FGTTTATTTACAAGAGCGTACGG632

CMVCMV-RGGTTCGAARRWATAACCGGG632

STVSTV-FTGATGGAGGATATCTACTGTCATT582

STVSTV-RACAAGATGTTTAAAGCCGTGTCC582

ToMMVToMMV-FCTGGAGAAGACTGGGTCTAG1193

ToMMVToMMV-RTTCGGTAAGTTCAATGGGACCT1193

ToMVToMV-FTCTCAAGAATGTTACACGGGAAG980

ToMVToMV-RCGCATTCTCCGTAATTTTGATC980

TSWVTSWV-FTCACTGTAATGTTCCATAGCAA861

TSWVTSWV-RAGAGCAATYGTGTCAATTTTATTC861

TYLCVTYLCV-FTAATCATTTCCACGCCCGTCTCG648

TYLCVTYLCV-RGGTTCTCATACTTGGCTGCCTCCT648

TYLCVTYLCV-FCGGGATCCACTTCTAAATG2800

TYLCVTYLCV-RCGGGATCCCACATATTGCAAG2800

aF表示上游引物。

bR表示下游引物。

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7.4.2PCR反應(yīng)程序

95℃預(yù)變性2min。35個反應(yīng)循環(huán)：95℃變性20s；退火20s，退火溫度按引物合成報告設(shè)置，

兩個引物退火溫度不一致時，取較低溫度；72℃延伸，延伸時間根據(jù)所選產(chǎn)品說明書提供的參數(shù)進行

計算。最后，72℃終延伸5min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測

7.5.1瓊脂糖凝膠制備

用Tris-乙酸緩沖液溶解瓊脂糖，制備質(zhì)量體積比為1%的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的制備按照SN/T

2497.21執(zhí)行。

7.5.2電泳檢測

用Tris-乙酸緩沖液，在水平板電泳槽中進行電泳。上樣、電泳按照SN/T2497.21執(zhí)行。電泳結(jié)束

時，凝膠置于紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)進行觀測和拍照，獲取的圖片用于結(jié)果判定。

8結(jié)果判定

異常結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖，與圖中DNA相對分子質(zhì)量標準品相比，從陰性對照樣品擴增到了預(yù)期大小

的DNA片段，或從陰性對照和陽性對照樣品均未擴增到預(yù)期大小的DNA片段。此時，判定為檢測錯誤，應(yīng)

重新進行檢測。

陽性結(jié)果

從陰性對照樣品未擴增到預(yù)期大小的DNA片段，從被檢測樣品擴增到了預(yù)期大小的DNA片段。有陽性

對照時，從陽性對照擴增的DNA片段大小，與