2025年臨床基因擴增試題及答案一、單選題（每題1分，共30分。每題只有一個正確答案，錯選、多選、未選均不得分）1.在實時熒光PCR中，若使用TaqMan探針，探針5'端標(biāo)記的熒光基團最常用的是A.FAM??B.ROX??C.TAMRA??D.HEX答案：A解析：FAM（6羧基熒光素）發(fā)射峰在518nm左右，與大多數(shù)實時PCR儀的檢測通道匹配度最高，且熒光強度高、穩(wěn)定性好，因此成為TaqMan探針5'端報告基團的首選。2.下列哪項不是PCR反應(yīng)體系中的必需組分A.模板DNA??B.引物??C.dNTPs??D.甘油答案：D解析：甘油可作為增強劑提高擴增效率，但非必需；模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶及緩沖液才是基本組分。3.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）中，若靶基因為高GC含量（>70%）的mRNA，首選的逆轉(zhuǎn)錄酶是A.MMLV野生型??B.SuperScriptIV??C.AMV??D.TthDNA聚合酶答案：B解析：SuperScriptIV經(jīng)工程改造，可在55–60℃下保持活性，有利于打開高GC二級結(jié)構(gòu)，提高全長cDNA合成效率。4.數(shù)字PCR（dPCR）中，分區(qū)數(shù)從20000提高到100000，對檢測下限（LOD）的影響是A.LOD升高5倍??B.LOD降低至1/5??C.LOD不變??D.LOD降低至1/√5答案：B解析：dPCR的LOD與分區(qū)數(shù)N近似成反比，N提高5倍，LOD降至1/5，即可靠檢測0.002%的突變頻率。5.臨床實驗室采用內(nèi)標(biāo)法進行HBVDNA定量，若內(nèi)標(biāo)為質(zhì)粒且與靶基因無同源序列，可導(dǎo)致的最大風(fēng)險是A.抑制物干擾無法識別??B.提取效率差異無法校正??C.交叉污染??D.假陰性答案：B解析：非同源內(nèi)標(biāo)無法與靶基因共提取，僅能監(jiān)控擴增過程，不能校正提取效率差異，導(dǎo)致結(jié)果偏差。6.下列哪種突變檢測技術(shù)不依賴PCR擴增A.ARMSPCR??B.Sanger測序??C.高分辨率熔解曲線（HRM）??D.熒光原位雜交（FISH）答案：D解析：FISH利用熒光標(biāo)記探針與染色體原位雜交，無需PCR步驟，其余三項均以PCR為基礎(chǔ)。7.實時PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為–3.42，則擴增效率為A.90%??B.95%?C.96%?D.100%答案：C解析：效率E=10^(–1/斜率)–1=10^(1/3.42)–1≈0.96，即96%。8.臨床檢測EGFRT790M突變，靈敏度要求達到0.1%，下列哪種策略最佳A.突變富集PCR+Sanger?B.ARMSPCR?C.NGS500×覆蓋?D.dPCR答案：D解析：dPCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實現(xiàn)絕對定量，靈敏度可低至0.01%，且重復(fù)性好，是檢測低豐度突變的金標(biāo)準(zhǔn)。9.下列哪項不是避免假陰性的質(zhì)控措施A.內(nèi)參基因監(jiān)控提取?B.無模板對照（NTC）?C.陽性對照?D.擴增后產(chǎn)物電泳答案：B解析：NTC用于監(jiān)控污染，無法提示假陰性；其余三項均可發(fā)現(xiàn)提取失敗或抑制物導(dǎo)致的假陰性。10.臨床實驗室進行BCRABL1融合基因定量，采用國際標(biāo)準(zhǔn)（IS）換算，其參照基因是A.ABL1?B.GUSB?C.BCR?D.GAPDH答案：A解析：WHO2016推薦以ABL1作為內(nèi)參，建立國際單位（IS）換算，保證室間可比性。11.多重PCR設(shè)計時，引物二聚體ΔG值應(yīng)滿足A.<–9kcal/mol?B.>–9kcal/mol?C.<–5kcal/mol?D.>–5kcal/mol答案：B解析：ΔG>–9kcal/mol可顯著降低引物二聚體形成概率，保證多重體系穩(wěn)定。12.下列哪種熒光通道組合最適合四重實時PCRA.FAM/ROX/Cy5/HEX?B.FAM/VIC/ROX/Cy5?C.FAM/TAMRA/JOE/Cy5?D.SYBR/FAM/ROX/Cy5答案：B解析：VIC發(fā)射峰554nm，與FAM（518nm）及Cy5（667nm）間隔大，通道串?dāng)_<0.5%，且ROX作為被動參比，組合最優(yōu)。13.臨床樣本中常含肝素，可抑制PCR，其機制是A.螯合Mg2??B.結(jié)合DNA聚合酶?C.降解引物?D.氧化dNTPs答案：B解析：肝素帶負(fù)電荷，可與DNA聚合酶堿性區(qū)域結(jié)合，阻礙酶與模板結(jié)合，導(dǎo)致擴增失敗。14.采用磁珠法提取全血DNA，若裂解液中SDS殘留過高，對后續(xù)PCR的影響是A.促進引物退火?B.抑制Taq活性?C.增加熒光背景?D.無影響答案：B解析：SDS可變性Taq酶，抑制其活性，需通過乙醇洗滌徹底去除。15.下列哪項不是臨床基因擴增實驗室分區(qū)管理原則A.試劑配制與提取分區(qū)?B.擴增與產(chǎn)物分析分區(qū)?C.樣本接收與提取可同區(qū)?D.單向流動答案：C解析：樣本接收與提取必須分區(qū)，防止原始樣本污染提取潔凈區(qū)，違背CLIA與ISO15189要求。16.實時PCR采用SYBRGreenI，熔解曲線出現(xiàn)雙峰，最可能原因A.引物特異性高?B.存在非特異擴增?C.ROX濃度低?D.探針降解答案：B解析：SYBRGreenI結(jié)合所有雙鏈DNA，非特異產(chǎn)物導(dǎo)致額外熔解峰。17.臨床檢測HCVRNA，若樣本凍融3次，對結(jié)果的影響是A.拷貝數(shù)升高2倍?B.拷貝數(shù)降低0.5log?C.無影響?D.拷貝數(shù)降低2log答案：B解析：RNA易降解，凍融3次可導(dǎo)致約0.3–0.5log拷貝數(shù)下降，需避免反復(fù)凍融。18.下列哪種突變可導(dǎo)致PCR擴增失敗但測序成功A.引物結(jié)合區(qū)單堿基缺失?B.編碼區(qū)同義突變?C.內(nèi)含子點突變?D.終止密碼突變答案：A解析：引物結(jié)合區(qū)缺失導(dǎo)致引物無法退火，PCR失??；但測序可用其他區(qū)域引物，不受影響。19.臨床實驗室進行NGS建庫，若使用PCR富集，需特別關(guān)注A.擴增子長度均一性?B.引物5'端修飾?C.堿基平衡?D.以上均是答案：D解析：擴增子不均一導(dǎo)致覆蓋度差異；5'修飾影響接頭連接；堿基不平衡降低測序質(zhì)量。20.下列哪項不是數(shù)字PCR的優(yōu)勢A.絕對定量?B.高靈敏度?C.依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線?D.抗抑制能力強答案：C解析：dPCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可絕對定量，是其核心優(yōu)勢之一。21.臨床檢測SARSCoV2，若ORF1ab與N基因雙靶標(biāo)，ORF1abCt=38，N基因Ct=40，應(yīng)判讀為A.陽性?B.陰性?C.復(fù)檢?D.不確定答案：C解析：單靶標(biāo)高Ct需復(fù)檢排除低載量或污染，依據(jù)《WHO2023技術(shù)指南》。22.下列哪種酶具有5'→3'外切酶活性A.Pfu?B.KOD?C.Taq?D.Phusion答案：C解析：Taq具有5'→3'外切酶活性，可用于TaqMan探針切割；高保真酶通常無此活性。23.臨床檢測FLT3ITD突變，若PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)野生帶170bp與突變帶190bp，比例1:1，突變負(fù)荷為A.10%?B.25%?C.50%?D.無法確定答案：C解析：條帶亮度比≈分子數(shù)比，1:1提示突變型占50%，即突變負(fù)荷50%。24.下列哪項不是臨床基因擴增實驗室生物安全要求A.負(fù)壓提取區(qū)?B.產(chǎn)物分析區(qū)正壓?C.紫外照射30min/日?D.人員單向流動答案：B解析：產(chǎn)物區(qū)應(yīng)負(fù)壓防止擴增子外泄，正壓會增加污染風(fēng)險。25.實時PCR采用一步法RTPCR，逆轉(zhuǎn)錄溫度50℃，若引物Tm58℃，可能導(dǎo)致A.引物二聚體?B.逆轉(zhuǎn)錄效率低?C.RNaseH活性高?D.無影響答案：A解析：50℃下引物可能非特異退火，形成二聚體，需提高RT溫度或優(yōu)化引物。26.臨床檢測BRCA1大片段缺失，首選方法A.qPCR?B.MLPA?C.ARMS?D.dPCR答案：B解析：MLPA（多重連接探針擴增）可檢測外顯子級缺失，為金標(biāo)準(zhǔn)。27.下列哪種質(zhì)粒最適合作為內(nèi)標(biāo)A.高拷貝?B.低拷貝?C.線性質(zhì)粒?D.無啟動子答案：A解析：高拷貝質(zhì)粒易于定量，信號強，便于監(jiān)控抑制物。28.臨床實驗室進行PCR抑制物對照，常用策略是A.內(nèi)參+外源質(zhì)粒?B.稀釋樣本?C.加熱裂解?D.增加酶量答案：A解析：外源質(zhì)粒與內(nèi)參共同監(jiān)控提取與擴增，可識別抑制物。29.下列哪項不是臨床基因擴增報告必備要素A.檢測方法?B.靈敏度?C.臨床意義解讀?D.實驗室主任簽名答案：D解析：ISO15189要求報告含方法、靈敏度、結(jié)果及臨床意義，主任簽名為管理要求非技術(shù)要素。30.實時PCR采用TaqMan探針，若探針3'端標(biāo)記BHQ1，其作用是A.報告熒光?B.淬滅熒光?C.增強信號?D.延長探針壽命答案：B解析：BHQ1為黑洞淬滅基團，吸收報告基團能量，防止背景信號。二、共用題干單選題（每題1分，共10分。每題只有一個最佳答案）【題干】患者男，55歲，肺腺癌術(shù)后，送檢組織行EGFR基因突變檢測，實驗室采用ARMSPCR法，結(jié)果如下：19號外顯子缺失突變陽性，L858R陰性，T790M陰性。后續(xù)給予吉非替尼治療，3個月后疾病進展，再次活檢血漿ctDNA檢測。31.若血漿檢測T790M突變陽性，最可能機制是A.原發(fā)耐藥?B.獲得性耐藥?C.樣本污染?D.假陽性答案：B解析：一代TKI治療后出現(xiàn)T790M為經(jīng)典獲得性耐藥，占60%。32.此時首選的檢測方法是A.ARMSPCR?B.dPCR?C.FISH?D.IHC答案：B解析：dPCR靈敏度可達0.01%，適合低載量ctDNA檢測。33.若dPCR檢測T790M突變負(fù)荷0.3%，建議治療方案A.繼續(xù)吉非替尼?B.換奧希替尼?C.化療?D.放療答案：B解析：奧希替尼為三代TKI，靶向T790M，F(xiàn)DA批準(zhǔn)用于耐藥后治療。34.若dPCR未檢出T790M，下一步應(yīng)A.重復(fù)dPCR?B.NGSpanel?C.Sanger?D.放棄檢測答案：B解析：NGS可發(fā)現(xiàn)C797S、L792F等罕見耐藥突變，指導(dǎo)治療。35.實驗室發(fā)現(xiàn)血漿樣本溶血，對ARMSPCR的影響是A.假陽性?B.假陰性?C.無影響?D.靈敏度升高答案：B解析：血紅蛋白可抑制Taq酶，導(dǎo)致假陰性。三、多選題（每題2分，共20分。每題至少兩個正確答案，多選少選均不得分）36.下列哪些措施可降低數(shù)字PCR假陽性A.微流控芯片紫外滅菌?B.引物探針HPLC純化?C.增加模板量至10μg?D.設(shè)置NTC?E.使用UNG酶答案：ABDE解析：模板量過高導(dǎo)致微滴重疊，反而增加假陽性；其余均可降低污染。37.臨床基因擴增實驗室質(zhì)量管理體系文件包括A.質(zhì)量手冊?B.程序文件?C.作業(yè)指導(dǎo)書?D.記錄表格?E.人事檔案答案：ABCD解析：人事檔案屬行政管理，非質(zhì)量體系文件。38.下列哪些情況需重新驗證檢測方法A.更換引物廠家?B.更換Taq酶批次?C.更換核酸提取試劑盒?D.更換儀器通道?E.更換報告格式答案：ACD解析：更換關(guān)鍵試劑或儀器需驗證性能；僅換批次或格式無需驗證。39.實時PCR外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)品需滿足A.可溯源?B.基質(zhì)與樣本一致?C.濃度梯度覆蓋檢測范圍?D.含內(nèi)參?E.穩(wěn)定性驗證答案：ABCE解析：外標(biāo)法無需內(nèi)參，內(nèi)參為內(nèi)標(biāo)法要求。40.下列哪些屬于PCR污染來源A.氣溶膠?B.手套?C.移液器?D.試劑?E.紫外燈答案：ABCD解析：紫外燈為去污染手段，非污染源。四、填空題（每空1分，共15分）41.實時PCR擴增效率計算公式為E=10^(–1/斜率)–1，當(dāng)斜率=–3.32時，效率為________%。答案：100解析：10^(1/3.32)=2，E=1=100%。42.臨床檢測BCRABL1國際標(biāo)準(zhǔn)值（IS）換算系數(shù)為0.8，若實驗室測得轉(zhuǎn)錄本水平10000copies/μL，則IS值為________。答案：8000解析：IS=實測值×CF=10000×0.8=8000。43.數(shù)字PCR中，泊松分布校正公式為________。答案：c=–ln(1–p)/V解析：c為靶分子濃度，p為陽性微滴比例，V為微滴體積。44.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，RNaseH活性可________cDNA第二鏈合成。答案：促進解析：RNaseH降解RNADNA雜合鏈，為DNA聚合酶提供模板，促進第二鏈合成。45.臨床基因擴增實驗室生物安全柜氣流模式為________。答案：垂直層流解析：ClassIIA2型為垂直層流，70%循環(huán)30%外排。46.臨床報告突變豐度為5%，對應(yīng)dPCR突變拷貝數(shù)為________copes/μL（總模板1000copies/μL）。答案：50解析：1000×5%=50。47.實時PCR采用TaqMan探針，探針Tm應(yīng)比引物高________℃。答案：8–10解析：保證探針優(yōu)先退火，提高切割效率。48.臨床檢測HBVDNA，若內(nèi)參為βglobin，其單倍體基因組拷貝數(shù)為________。答案：2解析：二倍體細胞含2拷貝βglobin基因。49.多重PCR引物設(shè)計時，二聚體ΔG應(yīng)>________kcal/mol。答案：–9解析：>–9kcal/mol可降低二聚體。50.臨床基因擴增實驗室紫外照射有效波長為________nm。答案：254解析：254nm為UVC，可破壞DNA。五、名詞解釋（每題3分，共15分）51.擴增效率答案：指每個循環(huán)產(chǎn)物量相對于前一周期的增加比例，理想為100%，計算公式E=10^(–1/斜率)–1。52.突變負(fù)荷答案：指突變型分子占野生型與突變型分子總數(shù)的百分比，反映突變豐度。53.內(nèi)標(biāo)答案：與靶基因同步提取擴增的非人序列，用于監(jiān)控抑制物與提取效率。54.獲得性耐藥答案：腫瘤經(jīng)TKI治療后新出現(xiàn)的耐藥突變，如EGFRT790M。55.微滴數(shù)字PCR答案：將樣本分割成數(shù)萬微滴，各自獨立PCR，終點檢測陽性比例，實現(xiàn)絕對定量。六、簡答題（每題10分，共30分）56.簡述臨床基因擴增實驗室防止污染的措施。答案：（1）嚴(yán)格分區(qū)：試劑配制、樣本提取、擴增、產(chǎn)物分析四區(qū)獨立，負(fù)壓與正壓區(qū)分；（2）單向流動：人員、物品、空氣單向流動，避免交叉；（3）紫外照射：每日工作后紫外30min，254nm破壞DNA；（4）UNG酶：使用dUTP+UNG，防止既往產(chǎn)物污染；（5）耗材管理：一次性槍頭帶濾芯，手套隨時更換；（6）定期監(jiān)測：每周擦拭實驗臺面，用空白對照監(jiān)控污染；（7）人員培訓(xùn)：考核合格上崗，定期演練污染應(yīng)急預(yù)案。57.比較ARMSPCR與dPCR在EGFRT790M檢測中的優(yōu)缺點。答案：ARMSPCR：優(yōu)點—成本低、周期短、設(shè)備普及；缺點—靈敏度1%，定量能力差，易假陰。dPCR：優(yōu)點—靈敏度0.01%、絕對定量、抗抑制；缺點—成本高、通量低、操作復(fù)雜。臨床建議：初治組織用ARMS，耐藥ctDNA用dPCR，互為補充。58.敘述實時PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立步驟及接受標(biāo)準(zhǔn)。答案：步驟：（1）選擇標(biāo)準(zhǔn)品：可溯源質(zhì)粒或線性化DNA，濃度經(jīng)數(shù)字PCR定值；（