核酸合成儀用戶手冊(cè)一、技術(shù)原理1.1固相磷酸亞胺化學(xué)法核酸合成儀的核心技術(shù)基于固相合成原理，采用磷酸亞胺化學(xué)法實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的高效合成。該方法具有合成效率高（單步偶聯(lián)率可達(dá)99%以上）、自動(dòng)化程度高、產(chǎn)物純度高等特點(diǎn)，已完全取代傳統(tǒng)的磷酸二酯法和磷酸三酯法。合成過(guò)程在合成柱內(nèi)進(jìn)行，目標(biāo)核酸鏈從3'端向5'端延伸，通過(guò)循環(huán)執(zhí)行脫保護(hù)、活化與偶聯(lián)、蓋帽、氧化四個(gè)關(guān)鍵步驟完成序列組裝。1.2合成循環(huán)四步驟1.2.1脫保護(hù)合成起始于共價(jià)連接在可控孔度玻璃（CPG）載體上的首個(gè)核苷酸，其5'-羥基被二甲氧基三苯甲基（DMT）保護(hù)基封閉。通過(guò)通入三氯乙酸（TCA）溶液（通常為3%~5%濃度），使DMT基團(tuán)脫除并釋放出橙色DMT陽(yáng)離子，暴露出活性5'-羥基。該過(guò)程可通過(guò)光度法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)495nm），當(dāng)吸光度達(dá)到穩(wěn)定閾值（通常>0.1AU）時(shí)判定反應(yīng)完成，典型反應(yīng)時(shí)間為60-90秒。1.2.2活化與偶聯(lián)脫保護(hù)完成后，儀器將下一個(gè)核苷酸單體（5'-DMT保護(hù)的亞磷酰胺單體）與活化劑（常用0.45METT或0.25MDCI乙腈溶液）按1:1比例混合，通過(guò)惰性氣體（氬氣或氮?dú)猓毫︱?qū)動(dòng)進(jìn)入合成柱?；罨瘎┘せ顔误w的3'-磷酸亞胺基團(tuán)，使其與固相載體上的5'-羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成亞磷酸三酯鍵。偶聯(lián)效率直接影響最終產(chǎn)物純度，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時(shí)間為20-30秒，高通量機(jī)型可縮短至15秒，通過(guò)優(yōu)化流速（通常0.5-1.5mL/min）確保反應(yīng)充分。1.2.3蓋帽為消除未參與偶聯(lián)的5'-羥基（約0.5%~1%殘留），需進(jìn)行蓋帽處理。蓋帽試劑由乙酸酐/吡啶（1:1）和N-甲基咪唑（10%乙腈溶液）組成，通過(guò)乙?；磻?yīng)使游離羥基永久失活。該步驟可有效抑制缺失堿基副產(chǎn)物的生成，典型處理時(shí)間為20秒，分兩次交替注入兩種試劑以提高封閉效率。1.2.4氧化偶聯(lián)形成的亞磷酸三酯鍵不穩(wěn)定，需通過(guò)氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的磷酸三酯鍵。常用氧化試劑為0.02M碘的四氫呋喃/吡啶/水溶液（體積比7:2:1），反應(yīng)時(shí)間15-20秒。對(duì)于硫代磷酸修飾核酸，需使用3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物（Beaucage試劑）替代碘溶液，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至60秒。二、設(shè)備結(jié)構(gòu)與型號(hào)選擇2.1核心系統(tǒng)組成2.1.1液路系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計(jì)，包含：試劑輸送模塊：由高精度隔膜泵（流量精度±1%）、電磁閥組（響應(yīng)時(shí)間<5ms）和PEEK材質(zhì)管路（內(nèi)徑0.25-0.5mm）組成，支持8-28種堿基單體和6-12種輔助試劑的獨(dú)立輸送。合成柱單元：兼容0.1-1000μmol規(guī)格的一次性或可重復(fù)使用合成柱，柱床體積1-50mL，配備溫度控制模塊（4-60℃可調(diào)）以優(yōu)化特殊修飾反應(yīng)效率。檢測(cè)系統(tǒng)：集成紫外檢測(cè)器（260nm/495nm雙波長(zhǎng)）、電導(dǎo)儀和壓力傳感器（量程0-500psi），實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)合成效率與系統(tǒng)狀態(tài)。2.1.2氣路系統(tǒng)采用兩級(jí)調(diào)壓設(shè)計(jì)：氣源壓力：0.4-0.6MPa（推薦使用純度≥99.99%的氬氣）工作壓力：?jiǎn)误w瓶0.15-0.2MPa，溶劑瓶0.1-0.15MPa配備氣體過(guò)濾器（0.22μm）和壓力傳感器，異常壓力（超出±0.02MPa）觸發(fā)自動(dòng)停機(jī)保護(hù)。2.1.3控制系統(tǒng)基于PLC或ARM處理器，配備10-15英寸觸摸屏，支持：方法編輯（可自定義循環(huán)參數(shù)、試劑用量、檢測(cè)閾值）實(shí)時(shí)監(jiān)控（壓力曲線、DMT脫除值、合成進(jìn)度）數(shù)據(jù)存儲(chǔ)（≥1000組合成記錄，支持CSV格式導(dǎo)出）遠(yuǎn)程控制（部分機(jī)型支持以太網(wǎng)或Wi-Fi連接）2.2主流型號(hào)參數(shù)對(duì)比型號(hào)合成規(guī)模通道數(shù)循環(huán)時(shí)間修飾能力適用場(chǎng)景DNAchem-450nmol-100μmol44-6分鐘DNA/RNA/LNA中通量研究LK-192X2nmol-3μmol1925-7.5分鐘DNA/RNA高通量篩選Dr.Oligo768XLc2nmol-100nmol7686.5分鐘普通修飾超高通量文庫(kù)構(gòu)建DFL-OligoL10μmol-12mmol1-126分鐘PS/2'-OMe/LNA小核酸藥物研發(fā)MerMade-1250nmol-1μmol125分鐘DNA/RNA/PNA多序列并行合成選型建議：常規(guī)PCR引物合成：選擇DNAchem-4或MerMade-12，兼顧成本與靈活性基因芯片探針制備：優(yōu)先LK-192X或Dr.Oligo系列，滿足高通量需求長(zhǎng)鏈修飾核酸（>80nt）：推薦DFL-OligoL或K&AH-32，耦合效率>99.5%工業(yè)級(jí)生產(chǎn)：選用AKTAoligopilotplus（1μmol-9mmol）或DFL-OligoI（100mmol-1.8mol），符合GMP標(biāo)準(zhǔn)三、操作流程3.1開(kāi)機(jī)前準(zhǔn)備3.1.1試劑檢查確認(rèn)亞磷酰胺單體（A/C/G/T/U）純度≥98%，儲(chǔ)存于-20℃，使用前平衡至室溫（避免水汽凝結(jié)）輔助試劑：乙腈（HPLC級(jí)，含水量<0.01%）、TCA（3%inDCM）、活化劑（0.45METT）、蓋帽A（乙酸酐/吡啶/乙腈=1:1:8）、蓋帽B（10%NMIin乙腈）、氧化劑（0.02MI?溶液）試劑瓶液位：確保所有試劑充足（至少滿足單次合成需求的1.5倍），更換時(shí)需記錄批號(hào)與更換日期3.1.2系統(tǒng)檢查氣體壓力：主壓力0.5MPa，工作壓力0.15MPa廢液桶：確保排空，連接緊密無(wú)泄漏合成柱：根據(jù)合成規(guī)模選擇合適規(guī)格（如50nmol選用10mgCPG柱），檢查柱床是否均勻，無(wú)氣泡或干涸管路連接：確認(rèn)所有接頭（特別是PEEK卡套）無(wú)松動(dòng)，使用扳手按對(duì)角線順序緊固（扭矩2-3N·m）3.2軟件操作步驟3.2.1方法編輯登錄系統(tǒng)（管理員賬戶默認(rèn)密碼：Admin123，建議首次使用后修改）新建方法：依次設(shè)置合成類型：DNA/RNA/修飾（如選擇RNA需額外設(shè)置2'-羥基保護(hù)基脫除程序）序列輸入：支持FASTA格式導(dǎo)入或手動(dòng)輸入，自動(dòng)生成反義鏈（5'→3'方向）合成規(guī)模：50nmol/1μmol/10μmol等，系統(tǒng)自動(dòng)匹配推薦流速（如1μmol對(duì)應(yīng)0.8mL/min）循環(huán)參數(shù)：脫保護(hù)時(shí)間（60s）、偶聯(lián)時(shí)間（25s）、蓋帽時(shí)間（20s×2）、氧化時(shí)間（15s）修飾設(shè)置：若需引入硫代修飾，在對(duì)應(yīng)堿基位置勾選"PS"，并將氧化劑切換為Beaucage試劑3.2.2系統(tǒng)清洗執(zhí)行預(yù)清洗程序（路徑：維護(hù)→系統(tǒng)清洗）：清洗溶劑：乙腈流量：1.0mL/min時(shí)間：每個(gè)通道10分鐘觀察出口廢液，確保無(wú)氣泡、顆?；蝾伾惓＃ㄕ闊o(wú)色透明），同時(shí)監(jiān)測(cè)壓力曲線（波動(dòng)應(yīng)<±5psi）3.2.3合成運(yùn)行裝載合成柱：按通道編號(hào)對(duì)應(yīng)放置，旋緊柱帽（避免過(guò)緊導(dǎo)致柱床壓縮）啟動(dòng)程序：點(diǎn)擊"運(yùn)行"，系統(tǒng)自動(dòng)執(zhí)行：初始脫保護(hù)（延長(zhǎng)至120s，確保起始DMT完全脫除）序列合成（實(shí)時(shí)顯示當(dāng)前循環(huán)數(shù)、已合成長(zhǎng)度、偶聯(lián)效率）終點(diǎn)判斷（當(dāng)最后一個(gè)堿基偶聯(lián)完成后，自動(dòng)執(zhí)行最終脫保護(hù)）過(guò)程監(jiān)控：重點(diǎn)關(guān)注DMT脫除值：正常范圍0.1-0.5AU，若連續(xù)兩個(gè)循環(huán)<0.08AU提示偶聯(lián)異常柱壓：常規(guī)合成<200psi，若突然升高（>300psi）可能為管路堵塞試劑余量：低液位報(bào)警時(shí)需暫停添加，避免空氣進(jìn)入液路3.3合成后處理3.3.1切割與脫保護(hù)取下合成柱，放入氨解管中，加入濃氨水（1-2mL/柱）密封后置于55℃烘箱中：DNA：過(guò)夜（12-16小時(shí)）RNA：8小時(shí)（需額外加入1MTEA·3HF脫除2'-保護(hù)基）硫代修飾：延長(zhǎng)至20小時(shí)，確保硫代磷酸酯鍵穩(wěn)定3.3.2純化方法選擇反相HPLC：適用于>50nt長(zhǎng)鏈或修飾核酸，柱型C18（5μm，4.6×250mm），流動(dòng)相A（0.1MTEAA）、B（乙腈），梯度洗脫（5%-40%B，30分鐘）PAGE純化：用于高純度需求（如結(jié)晶用寡核苷酸），15%-20%變性膠（7M尿素），電泳后紫外燈下切膠回收OPC柱：快速純化短鏈DNA（<50nt），通過(guò)DMT基團(tuán)特異性吸附，乙腈梯度洗脫，回收率>80%3.3.3產(chǎn)物檢測(cè)UV定量：260nm處測(cè)定吸光度，1OD???≈33μg/mLDNA，40μg/mLRNA質(zhì)譜分析：MALDI-TOF或ESI-MS驗(yàn)證分子量（理論值與實(shí)測(cè)值偏差應(yīng)<0.01%）HPLC純度：主峰面積應(yīng)>95%，修飾核酸需同時(shí)檢測(cè)修飾峰比例四、設(shè)備維護(hù)與故障排除4.1日常維護(hù)（每日/每周/每月）4.1.1每日檢查試劑液位：補(bǔ)充乙腈至刻度線，檢查TCA溶液顏色（正常為無(wú)色，變黃提示失效）廢液處理：清空廢液桶，使用2%NaOH溶液沖洗（中和殘留TCA）合成柱更換：一次性柱使用后立即更換，可重復(fù)柱用乙腈沖洗后保存于4℃4.1.2每周保養(yǎng)管路沖洗：依次用乙腈（10分鐘）→甲醇（10分鐘）→超純水（15分鐘）沖洗整個(gè)液路，防止鹽結(jié)晶閥門維護(hù)：對(duì)電磁閥組進(jìn)行"手動(dòng)切換"操作（路徑：診斷→閥門測(cè)試），確保每個(gè)閥門響應(yīng)正常傳感器校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1AUDMT標(biāo)準(zhǔn)液、1000μS/cm電導(dǎo)標(biāo)液）校準(zhǔn)檢測(cè)器4.1.3每月深度維護(hù)更換過(guò)濾芯：包括氣源過(guò)濾器（0.22μm）、溶劑入口過(guò)濾器（1μm）密封圈檢查：查看合成柱接口、試劑瓶口的氟橡膠密封圈，若有裂紋或變形立即更換軟件更新：通過(guò)官網(wǎng)下載最新固件（如DFL-Oligo系列需升級(jí)至v3.2.1版本以上支持在線參數(shù)修改）4.2常見(jiàn)故障排除故障現(xiàn)象可能原因解決方案偶聯(lián)效率<98%單體失效/活化劑濃度不足更換單體（確認(rèn)保質(zhì)期內(nèi)），重新配制活化劑（ETT需現(xiàn)配現(xiàn)用）柱壓異常升高管路堵塞/合成柱干涸拆卸PEEK管路用10%硝酸沖洗，更換新合成柱（確保柱床濕潤(rùn)）DMT脫除值波動(dòng)大TCA濃度不穩(wěn)定/檢測(cè)池污染重新配制TCA溶液，用甲醇沖洗檢測(cè)池（路徑：維護(hù)→檢測(cè)池清洗）試劑無(wú)法輸送氣體壓力不足/電磁閥故障檢查氣源壓力（調(diào)至0.5MPa），更換故障電磁閥（參考部件編號(hào)：V-01-003）軟件報(bào)錯(cuò)"通訊失敗"數(shù)據(jù)線松動(dòng)/PLC程序異常重新插拔以太網(wǎng)電纜，執(zhí)行"系統(tǒng)重置"（長(zhǎng)按設(shè)備面板復(fù)位鍵5秒）緊急情況處理：溶劑泄漏：立即按下急停按鈕，穿戴防護(hù)裝備（耐酸堿手套、護(hù)目鏡），用吸水棉吸附泄漏物，再用10%碳酸鈉中和火災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)：乙腈屬于易燃溶劑，若發(fā)生燃燒，使用二氧化碳滅火器（禁止用水），同時(shí)啟動(dòng)通風(fēng)系統(tǒng)排爆4.3預(yù)防性維護(hù)計(jì)劃為確保設(shè)備長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行，建議制定以下維護(hù)計(jì)劃：每季度：由工程師進(jìn)行液路密封性檢測(cè)（使用0.3MPa氮?dú)獗簻y(cè)試）每半年：更換所有蠕動(dòng)泵管（材質(zhì)為氟橡膠，老化周期約6個(gè)月）每年：進(jìn)行全面校準(zhǔn)（包括流量精度、溫度控制、壓力傳感器），可聯(lián)系廠家工程師上門服務(wù)（如LK-192X保修期內(nèi)提供免費(fèi)年度校準(zhǔn)）五、安全注意事項(xiàng)5.1化學(xué)安全試劑特性：亞磷酰胺單體對(duì)濕氣敏感，操作時(shí)需在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行；TCA具有強(qiáng)腐蝕性，接觸皮膚立即用大量清水沖洗并涂抹2%碳酸氫鈉軟膏廢棄物處理：含DMT廢液需用活性炭吸附后分類存放，硫代試劑廢液需單獨(dú)收集交專業(yè)公司處理5.2設(shè)備安全接地要求：設(shè)備必須連接獨(dú)立接地（接地電阻<4Ω），防止靜電干擾防爆設(shè)計(jì)：工業(yè)級(jí)機(jī)型（如DFL-OligoP/I）需安裝在防爆通風(fēng)櫥內(nèi)，確保換氣次數(shù)≥15次/小時(shí)電氣安全：維修時(shí)需斷開(kāi)主電源（確認(rèn)"Power"指示燈熄滅），電容放電時(shí)間≥5分鐘5.3操作規(guī)范操作人員需經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并考核合格，嚴(yán)禁非授權(quán)人員操作合成過(guò)程中不得打開(kāi)儀器前門，避免接觸運(yùn)動(dòng)部件和化學(xué)試劑實(shí)驗(yàn)記錄需完整填寫：合成序列、試劑批號(hào)、偶聯(lián)效率、產(chǎn)物純度等關(guān)鍵信息，保存至少3年六、應(yīng)用拓展與高級(jí)功能6.1特殊修飾合成6.1.1LNA修飾鎖核酸（LNA）合成需使用2'-O,4'-C-亞甲基橋接核苷酸單體，注意：偶聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)至45秒（LNA單體空間位阻大）脫保護(hù)使用80%乙酸（常規(guī)DNA用3%TCA）純化需采用反相HPLC（C18柱，流速0.5mL/min）6.1.2熒光標(biāo)記在5'端引入Cy3/Cy5標(biāo)記時(shí)：選擇氨基修飾單體（如5'-氨基-C6-phosphoramidite）合成完成后進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)（Cy3NHS酯溶于DMSO，摩爾比1:5）標(biāo)記后需用SEC柱（如Superdex30）去除游離熒光染料6.2高通量合成方案對(duì)于Dr.Oligo768XLc等高通量機(jī)型，可通過(guò)以下方式提升效率：板格式設(shè)計(jì)：采用2×96孔板布局，每板合成192條序列，支持自動(dòng)換板并行處理：同時(shí)運(yùn)行3個(gè)合成程序（需分配不同通道組）數(shù)據(jù)管理：使用LIMS系統(tǒng)對(duì)接，自動(dòng)生成合成報(bào)告（包含每條序列的OD值、純度、分子量）6.3長(zhǎng)鏈核酸合成策略合成>100nt的寡核苷酸時(shí)，建議：降低合成規(guī)模（≤1μmol）以減少雜質(zhì)積累采用"分步合成-連接"策略：先合成50nt片段，再通過(guò)T4DNA連接酶組裝優(yōu)化循環(huán)參數(shù)：偶聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)至60秒，每10個(gè)循環(huán)增加一次額外蓋帽七、附錄7.1試劑配制表試劑名稱配方組成儲(chǔ)存條件有效期脫保護(hù)劑3%TCAinDCM（v/v）室溫避光1個(gè)月活化劑（ETT）0.45M5-乙基硫代-1H-四唑inACN-20℃2周蓋帽A乙酸酐:吡啶:ACN=1:1:8（v/v/v）室溫2個(gè)月氧化劑0.02MI?inTHF/吡啶/H?O=7