環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(LAMP)發(fā)展研究國內(nèi)外文獻綜述1.1環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)的反應(yīng)體系環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-

mediated

Isothermal

Amplification,LAMP)，是針對目標(biāo)基因的6個區(qū)域設(shè)計出4條特異性引物，在恒溫條件下(65℃左右)加入鏈置換DNA聚合酶，可在1h之內(nèi)完成核酸擴增反應(yīng)，將目標(biāo)DNA片段擴增109～1010倍，具有恒溫快速擴增和高特異性的特點REF_Ref20152\n\h[48]。(1)引物：LAMP技術(shù)的引物設(shè)計是反應(yīng)的關(guān)鍵，它的設(shè)計很巧妙。設(shè)計的總體原則是提高核酸擴增的效率和特異性，它要求四種特異性引物與靶基因序列上的6個不同區(qū)域完全匹配后才能進行核酸擴增反應(yīng)。引物由目標(biāo)DNA序列及其互補堿基序列構(gòu)成，分為2條內(nèi)引物和2條外引物。內(nèi)引物IP和BP含有2個顯著區(qū)域，IP含有區(qū)域F1的互補序列F1c和F2區(qū)域的靶序列；BP含有區(qū)域B1的互補序列B1c和B2區(qū)域的靶序列。在反應(yīng)開始的階段要將4條特異性引物與目標(biāo)DNA的相應(yīng)區(qū)域進行契合是十分重要的一個步驟，所以要選擇一定的溫度范圍，以便不同序列和不同大小的引物可以進行融合REF_Ref20302\n\h[49-50]。內(nèi)引物(F2和B2)引導(dǎo)的合成反應(yīng)所需的溫度顯然高于外引物(F3和B3)所引導(dǎo)的合成反應(yīng)，這就可以保證內(nèi)內(nèi)引物可以更早的結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上，這個最適合溫度一般設(shè)定為63℃左右REF_Ref20416\n\h[51]。(2)模板DNA：因為對于LAMP技術(shù)來說，其中有一步限速反應(yīng)，這就是鏈置換DNA合成反應(yīng)，因此LAMP反應(yīng)的效率由模板DNA的大小來決定。模板DNA一般控制在130～200bp

DNAs最為合適。(3)鏈置換DNA聚合酶：由上可知鏈置換DNA合成反應(yīng)是LAMP反應(yīng)的限速反應(yīng)，鏈置換DNA聚合酶就是此反應(yīng)步驟的限速酶，因此鏈置換DNA聚合酶是控制擴增速率的一個關(guān)鍵性因素，當(dāng)模板DNA少于10～23mol，鏈置換DNA聚合酶對于擴增反應(yīng)是最好的。(4)緩沖液：緩沖液可以破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而顯著的提高LAMP技術(shù)的擴增效率。1.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)的反應(yīng)步驟第一步:在恒溫條件下一般是65℃左右，目的序列上的e和正向內(nèi)引物FIP的2區(qū)段堿基互補配對，此時的模板DNA雙鏈處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，同時啟動鏈置換DNA的合成，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，以F2區(qū)段的3＇末端為起點開始。第二步:在鏈置換活性DNA聚合酶的作用下，開始合成模板DNA的互補鏈，并以F2區(qū)段的3＇端為起點。第三步:正向外引物F3和目的序列F2c區(qū)段的F3c堿基序列互補，以F3區(qū)段的3＇末端開始，在鏈置換活性DNA聚合酶的作用，一同開始置換由FP引物引導(dǎo)合成的DNA鏈，同時一頭開始合成新的DNA鏈，就這樣一直向前延伸。第四步:在最后形成雙鏈，分別由引物F3引導(dǎo)合成的DNA鏈和DNA模板鏈形成。第五步:由前幾步可知，在置換酶的作用下，正向引物2區(qū)段引導(dǎo)合成的DNA鏈被正向引物F3區(qū)段引導(dǎo)合成的鏈進行了置換反應(yīng)，變成了DNA單鏈，而這條DNA單鏈的5＇末端存在有F1c和F1區(qū)段與之互補的段。第六步:5＇末端F1c和F1區(qū)段的互補段，可以自身進行堿基互補配對，形成一個形似環(huán)狀的結(jié)構(gòu)。而在另一端以B2區(qū)段的3＇端為起點，反向的內(nèi)引物BIP可以和此DNA單鏈堿基互補配對形成互補雙鏈。在合成雙鏈的同時環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開，此時引物BIP的外側(cè)插入一個反向外引物B3，并與B3c堿基序列進行互補配對。第七步:由B3的3＇末端開始，在置換酶的作用下，反向內(nèi)引物BIP引導(dǎo)合成的DNA鏈，同時一頭開始合成新的DNA鏈，就這樣一直向前延伸。最終和引物B3所引導(dǎo)合成DNA鏈形成雙鏈。第八步:在置換酶的作用下，引物B3將之前由引物BP所引導(dǎo)合成DNA鏈進行鏈換反應(yīng)，產(chǎn)生一條DNA單鏈，這條單鏈的兩端有堿基互補序列。他們可自己進行堿基互補配對，形成另一個形似環(huán)狀的結(jié)構(gòu)。此時的DNA鏈呈現(xiàn)出一個啞鈴狀的結(jié)構(gòu)這個啞鈴狀結(jié)構(gòu)就是LAMP核酸擴增反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)。到目前為止，以上所有的步驟都是為了形成啞鈴結(jié)構(gòu)，為開始進行LAMP核酸擴增反應(yīng)做準(zhǔn)備，如圖1-2所示。圖1-2LAMP技術(shù)原理圖1Fig.1-2SchemeofLAMPreaction1第九步:以下是LAMP核酸擴增反應(yīng)循環(huán):在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，由3＇末端的FIP區(qū)段開始，以自身DNA鏈為模板，進行DNA鏈的合成和延伸。就在此時，引物FP的F2區(qū)段與環(huán)上單鏈F2c雜交，開啟新一輪的鏈置換反應(yīng)。首選將之前區(qū)段合成的DNA雙鏈解離成單鏈。在解離出的單鏈3＇末端上有存在B1c和B1的堿基互補序列，同樣他們自身可以發(fā)生堿基互補配對，從而再次形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后由3＇末端的B1區(qū)段開始，以自身DNA鏈為模板，進行DNA鏈的合成和延伸REF_Ref20625\n\h[54]。而此時解離FP區(qū)段的互補鏈，解離出的單鏈兩端分別有F11c區(qū)段和B1/B1c區(qū)段兩區(qū)段互補，這就可以使其自身發(fā)生堿基配對，又形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，但此時形成的啞鈴結(jié)構(gòu)正好與之前在第八步中形成的啞鈴結(jié)構(gòu)相反。同樣的繼續(xù)由3＇末端的B1區(qū)段開始，以本身的DNA鏈為模板，進行DNA鏈的合成和延伸。而此時此刻，引物BP的B2區(qū)段與環(huán)上單鏈B2c雜交，開啟新一輪的鏈置換反應(yīng)。經(jīng)過與之前相同的過程，又形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過前幾個過程，周而復(fù)始在同一條鏈上互補序列形成大小不一的結(jié)構(gòu)，完成核酸擴增，如圖1-3所示。圖1-3LAMP技術(shù)原理圖2Fig.1-3SchemeofLAMPreaction21.3環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)產(chǎn)物的檢測方法(1)肉眼觀察法：LAMP反應(yīng)具有高效性，在核酸大量擴增合成的時候，溶液中鎂離子結(jié)合與焦磷酸根離子（從dNTPs中析出）結(jié)合，產(chǎn)生白色沉淀物，即副產(chǎn)物焦磷酸鎂REF_Ref20739\n\h[55]。因此我們可以直接在反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察白色沉淀的產(chǎn)生情況，根據(jù)是否形成副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀來定性判斷反應(yīng)是否發(fā)生LAMP反應(yīng)，或者通過儀器來檢測反應(yīng)液的濁度變化情況，從而進行實時定量測定。本研究就是采用觀察濁度曲線情況來進行試驗的實時定量測定。雖然在常規(guī)的PCR反應(yīng)時也能夠產(chǎn)生焦磷酸鹽或焦磷酸鹽離子，但由于PCR反應(yīng)它擴增效率較LAMP來說比較低，焦磷酸鹽或焦磷酸鹽離子的生成量比較小，即白色沉淀產(chǎn)生量不大，因此很難直接通過肉眼觀察到白色沉淀進行產(chǎn)物測定。(2)添加熒光染料法：對LAMP反應(yīng)進行實時定量檢測也可以通過添加熒光染料的方法。也就是說向整個反應(yīng)體系里添加熒光染料比如溴化乙錠、SYR、Green等，使得反應(yīng)結(jié)果進行熒光呈色，然后可以通過觀察反應(yīng)體系里的熒光強弱變化來判斷擴增反應(yīng)的是否發(fā)生和發(fā)生程度，我們還可以通過檢測儀器來對混有熒光燃料的反應(yīng)產(chǎn)物進行測定，從而實現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的實時定量測REF_Ref20841\n\h[56]。例如我們將1μSYBR-GreenⅠ熒光染料(只與雙鏈DNA中的小溝進行結(jié)合)添加到整個LAMP反應(yīng)體系中，當(dāng)出現(xiàn)擴增產(chǎn)物的時候，熒光染料便與DNA小溝雙鏈進行結(jié)合進行染色，通過肉眼可觀察到熒光染料的顏色由原來的橘黃色變?yōu)榫G色，同時也可以使用手持紫外線燈(320nm)照射完成觀察進行熒光檢測。在1個LAMP體系里，熒光信號的強弱就代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量多少，也可以用實時定量PCR儀進行熒光強度測定，進一步實現(xiàn)定量檢測的目的。(3)瓊脂糖凝膠電泳法：我們通過之前反應(yīng)擴增原理可以知道，LAMP擴增反應(yīng)最后產(chǎn)生一個像花椰菜一樣的莖環(huán)DNA混合物，其原理是是在退火過程中在同一條鏈上目標(biāo)序列的反向重復(fù)反復(fù)交替從而形成的一個多重環(huán)狀形似花椰菜的一個結(jié)構(gòu)REF_Ref20955\n\h[57]。所以，在用2％的瓊脂糖凝膠進行電泳的時候，LAMP核酸擴增反應(yīng)最終產(chǎn)物由于結(jié)構(gòu)原因在結(jié)果上呈現(xiàn)的是典型的階梯狀條帶，而非常見的一條單鏈條帶。我們可以通過觀察梯形條帶，從而更準(zhǔn)確的了解LAMP反應(yīng)發(fā)生的情況。如果用限制性核酸內(nèi)切酶剪切LAMP最終產(chǎn)物后，再利用瓊脂糖凝膠進行電泳可出現(xiàn)一條單一目標(biāo)序列條帶。(4)特異性可視化檢測：如果運用上述的檢測方法檢測的話，就只能得到2種結(jié)果:顯示擴增或者顯示不擴增。所以如果在LAMP核酸擴增反應(yīng)過程中一旦發(fā)生了非特異性的核酸擴增，我們就無法進行鑒別了。因此，眾多研究者們又對產(chǎn)物的特異性進行了大量的研究。2006年MoriREF_Ref21324\n\h[58]等通過加入探針和陽離子聚合物對LAMP核酸擴增產(chǎn)物進行了特異性可視化檢測的試驗研究。如果在LAMP反應(yīng)體系中加入特異性探針，而這些探針帶有不同的熒光素，這些探針可以與反應(yīng)的產(chǎn)物進行特異性結(jié)合，同時在反應(yīng)結(jié)束后加入陽離子聚合物（聚乙烯亞胺），而這些和探針特異性結(jié)合的反應(yīng)產(chǎn)物與這些陽離子聚合物結(jié)合后形成了P聚合物，這個P聚合物不溶于水而且可以釋放出其特異性探針?biāo)鶎?yīng)的熒光，利用熒光監(jiān)測裝置就可以肉眼的情況下進行熒光觀察，來判斷擴增反應(yīng)的特異性。1.4環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）的優(yōu)點(1)可以直接擴增RNA:可以通過添加逆轉(zhuǎn)錄酶，實現(xiàn)將DNA擴增到RNA的結(jié)果，就是在擴增脫氧核糖核酸體系中添加一些逆轉(zhuǎn)錄酶，同時需要加入適當(dāng)?shù)囊种苿┍热缫种芌NA酶的抑制劑，就可以將DNA逆轉(zhuǎn)錄為RNA，繼續(xù)擴增就可以實現(xiàn)RNA的一步擴增。(2)操作簡單:LAMP反應(yīng)對溫度要求不高，在恒定的溫度下反應(yīng)就可以很好的進行，同時反應(yīng)時不需要反復(fù)進行溫度循環(huán)，也不需要加入什么特殊的試劑就可以完成。(3)快速高效：整個擴増反應(yīng)只需要在1小時以內(nèi)就可以擴增到原來的109~1010倍，耗時短。(4)特異性強：LAMP技術(shù)是針對目標(biāo)基因的6個區(qū)域設(shè)計出了4種特異性的引物，而且目標(biāo)基因的這6個區(qū)段順序也是有固定的規(guī)定的，因此理論上來講LAMP技術(shù)擴增反應(yīng)的特異性十分高，我們也可以根據(jù)特異性引物引導(dǎo)的擴增反應(yīng)是否發(fā)生從而判斷所要檢測的目標(biāo)基因是否存在，也就是說可以設(shè)定某細菌或者病毒的特異性引物，觀察擴增與否來對于該細菌或病毒進行定性檢測。(5)靈敏度高:因為反復(fù)大量的擴增反應(yīng)，可以在短時間內(nèi)將微量的目標(biāo)基因擴增到大量，足以通過儀器檢測出來的程度，因此將該技術(shù)應(yīng)用于檢測微量目的病原菌上，可以達到在極少目標(biāo)菌含量的檢測目的。(6)檢測簡便，污染小:檢測結(jié)果可以直接通過儀器檢測熒光信號或者濁度曲線的變化來確定有沒有發(fā)生特異性擴增反應(yīng)，進行實時測定。同時整個試驗過程中均不需要開蓋，采用閉管式擴增，從而避免了開蓋造成的氣溶膠污染現(xiàn)象。1.5環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）的應(yīng)用由于LAMP技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、快速高效、操作簡單等特點，此方法在多個領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用前景，比如食品衛(wèi)生檢驗、臨床疾病的診斷、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生監(jiān)測等，在這里我們主要探討一下LAMP技術(shù)在食品安全檢測中的一些應(yīng)用：2003年MaruyamaREF_Ref21582\n\h[59]等將LAMP技術(shù)和原位雜交技術(shù)相結(jié)合，用于檢驗帶有stx2基因的Ecoli57:H7，這種結(jié)合的方法克服了原位PCR的一些缺點，LAMP技術(shù)在恒溫條件下尤其是相對較低的溫度下，可以減少對細胞的破壞，有利于應(yīng)用熒光抗體對細胞進行進一步的鑒定，并且其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的特殊性防止了產(chǎn)物泄露到細胞外。在擴增中，還可以使用熒光抗體標(biāo)記，結(jié)果的檢測更加準(zhǔn)確。研究還發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)的背景顏色較淺。2005年，SongREF_Ref14953\n\h[60]等用LAMP技術(shù)對EIEC和志賀氏菌的同源基因ipaH進行檢測，從病人的腹瀉樣便中分離出38株腸病原體，利用LAMP技術(shù)對其進行特異性檢測，試驗結(jié)果表明LAMP方技術(shù)對所有的志賀氏菌及EIEC呈陽性，對其他菌呈陰性。除此之外，LAMP技術(shù)還可應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌回等許多細菌的檢測，結(jié)果均顯示出了該方法的較高特異性和較高的靈敏度。LAMP方法的優(yōu)勢除了較高的特異性和靈敏度外，還有操作簡單的優(yōu)勢，反應(yīng)對儀器設(shè)備要求比較低，擁有一臺水浴鍋或恒溫箱就能夠進行試驗反應(yīng)，同時該方法觀測試驗結(jié)果的方法也十分簡單，LAMP反應(yīng)的結(jié)果通過肉眼觀察白色渾濁或者綠色熒光的生成就可判斷反應(yīng)是否發(fā)生，十分簡便快捷高效，特別是適合口岸現(xiàn)場快速診檢測的要求，這正是今后研究工作發(fā)展的方向和要考慮的關(guān)鍵點，可以為提高口岸食品快速檢測工作效率提供有力技術(shù)支撐。參考文獻TongS,DavisJS,EichenbergerE,etal.StaphylococcusaureusInfections:Epidemiology,Pathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2015,28(3):603-661.東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001,246-247.方太松,王軍,王曄茹,吳瑜凡,劉陽泰,王翔,董慶利.我國熟肉制品中金黃色葡萄球菌污染狀況Meta分析[J].生物加工過程,2020,1803:386-391.陳瓊,董華夏,戴小芳,劉萍,晏濤,酈娟.畜禽肉中金黃色葡萄球菌活菌可視化LAMP檢測方法的研究[J].食品工業(yè)科技,2020,4120:235-240+245.QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheeponthephagocytosisofStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandSaureusbyneutrophils-ScienceDirect[J].ResearchinVeterinaryScience,1996,61(3):231-233.李瓊瓊,范一靈,宋明輝,施春雷,楊美成.食源性金黃色葡萄球菌腸毒素及其檢測方法[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2016,702:555-560.胡金強,雷俊婷,白艷紅,魏向珂,景建洲,高輝,孫新城,董彩文,耿堯,姜春鵬.食品中金黃色葡萄球菌PCR-ELISA檢測技術(shù)建立[J].食品工業(yè)科技,2016,3720:63-67.

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