(19)國家知識產權局(10)授權公告號CN113993527B(21)申請?zhí)?02080043727.1(22)申請日2020.06.12(65)同一申請的已公布的文獻號申請公布號CN113993527A(43)申請公布日2022.01.28(30)優(yōu)先權數(shù)據(jù)(85)PCT國際申請進入國家階段日(86)PCT國際申請的申請數(shù)據(jù)PCT/JP2020/0232082020.(87)PCT國際申請的公布數(shù)據(jù)(73)專利權人株式會社鐘化地址日本大阪府(72)發(fā)明人梅田伸好小椋康平(74)專利代理機構北京市柳沈律師事務所專利代理師沈雪A61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61PA61P(56)對比文件FormationviaE-cadherinPromotesTherapeuticPotencyofMesenchymalStemCellsDerivedFromHumanUmbilicalCoBloodforMyocardialInfarction.MOLECULARTHERAPY.2012,第20卷(第7期),補充材料圖S1、材料與方法.A61PA61P(54)發(fā)明名稱包含間充質細胞的細胞群、包含其的醫(yī)藥組合物及其制造方法(57)摘要本發(fā)明的問題在于提供包含能夠形成可自發(fā)地從基材剝離的細胞片的間充質細胞的細胞群。本發(fā)明是包含間充質細胞的細胞群，在上述細胞群中，呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上，且呈CD[轉續(xù)頁]231.一種包含間充質細胞的細胞群，其來自于羊膜，在所述細胞群的貼壁培養(yǎng)時，呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上，且呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上，呈CD326陽性的細胞的比率為10%以下，呈CD73陽性的間充質細胞的比率為80%以上，呈CD166陽性的間充質細胞的比率為80%以上，呈CD45陽性的細胞的比率為10%以下，且呈CD105陽性的間充質細胞的比率為70%以上，在所述貼壁培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中添加有人血小板溶解物，并且，培養(yǎng)基中人血小板溶解物的最終濃度為1重量%以上且10重量%以下。2.一種包含間充質細胞的細胞群的制造方法，該方法包括：對來自于羊膜且包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)的工序、以及從所述包含間充質細胞的細胞群中篩選貼壁培養(yǎng)時具有以下所示的(a)及(g)的特性的細胞群的工序，(a)在所述細胞群中，呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上；(b)在所述細胞群中，呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上；(c)呈CD326陽性的細胞的比率為10%以下；(d)呈CD73陽性的間充質細胞的比率為80%以上；(e)呈CD166陽性的間充質細胞的比率為80%以上；(f)呈CD45陽性的細胞的比率為10%以下；且(g)呈CD105陽性的間充質細胞的比率為70%以上，在所述貼壁培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中添加有人血小板溶解物，并且，培養(yǎng)基中人血小板溶解物的最終濃度為1重量%以上且10重量%以下。權利要求1所述的細胞群、以及藥學上可接受的介質。4.根據(jù)權利要求3所述的醫(yī)藥組合物，其中，以間充質細胞的1次的給藥量為1012個以下的方式對人給藥。5.根據(jù)權利要求3或4所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述醫(yī)藥組合物為注射用制劑。6.根據(jù)權利要求3或4所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述醫(yī)藥組合物為細胞團塊或片狀結構的移植用制劑。7.根據(jù)權利要求3或4所述的醫(yī)藥組合物，其是選自下述疾病的治療劑：4包含間充質細胞的細胞群、包含其的醫(yī)藥組合物及其制造方法技術領域[0001]本發(fā)明涉及可以在醫(yī)學、生物化學等領域中利用的包含間充質細胞的細胞群、包含該細胞群的醫(yī)藥組合物、以及該細胞群的制造方法。背景技術[0002]再生醫(yī)療是通過將在體外人工培養(yǎng)的干細胞等施用至患者體內，使損傷的器官、組織再生而使生物體功能恢復的醫(yī)療。近年來，將間充質干細胞、骨骼肌成肌細胞、上皮細胞等細胞施用于患者而促進組織、器官的再生、功能改善的新治療方法的實用化快速發(fā)展。例如，以急性移植物抗宿主病(GVHD)、脊髓損傷的患者作為對象的骨髓間充質干細胞制劑、以嚴重心力衰竭的患者作為對象的骨骼肌成肌細胞片已經作為再生醫(yī)療等的產品而在日本國內銷售。[0003]再生醫(yī)療等所使用的大多數(shù)細胞具有粘附于培養(yǎng)基材的性質，在制造上述細胞制劑時，除了使細胞粘附于培養(yǎng)基材進行增殖培養(yǎng)的工序以外，還有將粘附于培養(yǎng)基材的細胞剝離的工序。上述的骨髓間充質干細胞也具有粘附于培養(yǎng)基材的性質，在使細胞粘附于培養(yǎng)基材的狀態(tài)下進行增殖培養(yǎng)后，經過將細胞從培養(yǎng)基材剝離的工序，回收細胞懸浮液。作為上述將細胞從培養(yǎng)基材剝離的方法，可以列舉例如：使用了胰蛋白酶這樣的蛋白質分解酶、化學試劑的化學方式、使用了細胞刮刀這樣的將細胞物理性剝離的器具的物理方式。例如，專利文獻1公開了將胰蛋白酶添加于培養(yǎng)基材而使間充質干細胞剝離的方法。[0004]另外，專利文獻2公開了使用將細胞粘附性隨溫度而發(fā)生變化的溫度響應型高分子包覆于表面而得到的培養(yǎng)基材，通過溫度變化將細胞從培養(yǎng)基材剝離的方法。[0005]現(xiàn)有技術文獻[0006]專利文獻[0007]專利文獻1:日本專利第5394932號公報[0008]專利文獻2:國際公開WO2001/068799發(fā)明內容[0009]發(fā)明要解決的問題[0010]如上所述，開發(fā)了各種將間充質干細胞等粘附性細胞從培養(yǎng)基材剝離的方法。然而，在專利文獻1的方法中，培養(yǎng)細胞會因胰蛋白酶等化學物質而受蛋白酶處理而將培養(yǎng)細胞從培養(yǎng)基材剝離時，被剝離的細胞成為單個細胞，無法以細胞片的形態(tài)剝離。[0011]另外，在專利文獻2的方法中，作為成為細胞培養(yǎng)的支架的培養(yǎng)基材，需要使用特[0012]因此，本發(fā)明的問題在于提供不使用化學方式、物理方式、特殊培養(yǎng)基材而從培養(yǎng)基材自發(fā)剝離的細胞群、其制造方法、以及包含其的醫(yī)藥組合物。5[0013]解決問題的方法[0014]本發(fā)明人等為了解決上述問題而進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，包含呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上、且呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上的間充質細胞的細胞群可自發(fā)地從基材剝離而不需要特殊的手段、器具。本發(fā)明是基于這樣的見解而完成的。[0015]即，根據(jù)本說明書，可以提供以下的發(fā)明。[0016](1)一種細胞群，其是包含間充質細胞的細胞群，[0017]在上述細胞群中，呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上，且呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上。[0018](2)根據(jù)(1)所述的細胞群，其中，在上述細胞群中，呈CD326陽性的細胞的比率為10%以下。[0019](3)根據(jù)(1)或(2)所述的細胞群，其中，在上述細胞群中，呈CD73陽性的間充質細胞的比率為80%以上，呈CD166陽性的間充質細胞的比率為80%以上，呈CD45陽性的細胞的比率為10%以下，且呈CD105陽性的間充質細胞的比率為70%以上。[0020](4)根據(jù)(1)～(3)中任一項所述的細胞群，其中，上述間充質細胞來自于胎兒附屬[0021](5)一種包含間充質細胞的細胞群的制造方法，該方法包括：[0022]對包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)的工序、以及[0023]從上述包含間充質細胞的細胞群中篩選具有以下所示的(a)及(b)的特性的細胞群的工序，[0024](a)在上述細胞群中，呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上，[0025](b)在上述細胞群中，呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上。[0026](6)一種醫(yī)藥組合物，其包含(1)～(4)中任一項所述的細胞群和藥學上可接受的介質。[0027](7)根據(jù)(6)所述的醫(yī)藥組合物，其中，以間充質細胞的1次給藥量為1012個以下的方式對人給藥。[0028](8)根據(jù)(6)或(7)所述的醫(yī)藥組合物，其中，上述醫(yī)藥組合物為注射用制劑。[0029](9)根據(jù)(6)或(7)所述的醫(yī)藥組合物，其中，上述醫(yī)藥組合物為細胞團塊或片狀結構的移植用制劑。[0030](10)根據(jù)(6)～(9)中任一項所述的醫(yī)藥組合物，其是選自免疫相關疾病、缺血性疾病、下肢缺血、腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、神經系統(tǒng)疾病、移植物抗宿主病、炎癥性腸病、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、放射性腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、膠原性疾病、腦卒炎、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、大皰性表皮松解癥、糖尿病、蕈樣真菌病、硬皮病、由軟骨等結締組織的變性和/或炎癥引起的疾病、關節(jié)軟骨缺損、半月板損傷、剝脫性骨軟骨炎、無菌性骨壞死、膝骨性關節(jié)炎(kneeosteoarthritis)、炎性關節(jié)炎(inflammatory風濕性關節(jié)炎、眼病、血管新生相關疾病(angiogenesis-relateddisease)、缺血性心臟病、冠心病、心肌梗塞、心絞痛、心力衰竭、心肌病、心瓣膜病、創(chuàng)傷、上皮損傷、纖維癥(fibrosis)、肺病、肌肉萎縮癥、慢性胰腺炎、慢性腎炎、以及癌中的疾病的治療劑。[0031](11)(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群在醫(yī)藥組合物的制造中的用6[0032](12)(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群在細胞治療劑的制造中的用[0033](13)(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群在用于心肌的再生、心肌細胞[0034](14)根據(jù)(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群，其用于疾病的治療。[0036](16)根據(jù)(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群，其用于對患者或受試者[0037](17)一種患者或受試者的疾病的治療方法，該方法包括：對患者或受試者給藥治療有效量的(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群的工序。[0038](18)根據(jù)(17)所述的方法，其中，上述疾病為上述(10)所述的疾病，上述患者或受試者為需要上述疾病的治療的患者或受試者。[0039](19)根據(jù)(17)或(18)所述的方法，其中，患者為人，1次的給藥量為1012個細胞以[0040](20)根據(jù)(17)、(18)或(19)所述的方法，其中，上述細胞群具有細胞團塊或[0041](21)對患者或受試者進行心肌的再生、心肌細胞的產生、血管新生、血管的修復、或免疫應答的抑制的方法，該方法包括：對患者或受試者給藥治療有效量的(1)～(4)中任一項的包含間充質細胞的細胞群的工序。[0044]本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權基礎的日本專利申請編號2019-111470號的公開內容。[0045]發(fā)明的效果[0046]本發(fā)明的一個以上實施方式的細胞群即使不使用化學方法和/或物理方法也會自發(fā)地從培養(yǎng)基材剝離。[0047]本發(fā)明的一個以上實施方式的細胞群的制造方法可以高效地制造具有上述效果的細胞群。[0048]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物可以用于免疫相關疾病等的治療。附圖說明[0049]圖1是評價1中的由供體#1制備的比較例1的第5次傳代的細胞群在培養(yǎng)第21天的細胞形態(tài)的觀察像(倍率40倍)。[0050]圖2是評價2中的由供體#1制備的實施例1的第5次傳代的細胞群在培養(yǎng)第10天的細胞形態(tài)的觀察像(倍率40倍)。觀察到了部分細胞的剝離。[0051]圖3是評價2中的由供體#3制備的實施例2的第2次傳代的細胞群在培養(yǎng)第10天的細胞形態(tài)的觀察像(倍率100倍)。觀察到了部分細胞的剝離。[0052]圖4是評價2中的由供體#3制備的實施例2的第2次傳代的細胞群在培養(yǎng)第11天的7細胞形態(tài)的觀察像(倍率40倍)。觀察到了從基材剝離的細胞片凝聚成的塊狀結構物(細胞團塊)。具體實施方式細胞(Mesenchymalstemcells:MSC)”也包含于本發(fā)明的間充質細胞。[0055]作為“間充質細胞”,在能夠從各種組織及器官中采集的體細胞(組織細胞)中，可的細胞，優(yōu)選可以使用滿足下述i)及ii)的特征的細胞。間充質細胞、間充質干細胞、羊膜來源的間充質細胞、羊膜來源的間充質干細胞、羊膜上皮來源的間充質細胞、羊膜上皮來源的間充質干細胞、羊膜細胞外基質層來源的間充質細胞、羊膜細胞外基質層來源的間充質干細胞、消化道上皮細胞、消化道上皮干細胞、成骨細胞、[0056]本說明書中的間充質細胞的典型特征[0057]i)在標準培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下對塑料顯示出粘附性。這里所謂的標準培養(yǎng)基是指清代替試劑的人血小板溶解物)的培養(yǎng)基。明書中的“間充質細胞”也包括如間充質干細胞那樣具有分化為骨、軟骨及脂肪的分化能力性、CD45陰性、CD326陰性中的至少1種、但并不具有分化為骨、軟骨、脂肪的兒的羊水的胎囊，從內側起由羊膜、絨毛膜及蛻膜形成。其中，羊膜和絨毛膜起源于胎兒。“羊膜”是指位于胎膜最內層的缺乏血管的透明薄膜，內壁被具有分泌功能的一層上皮細胞覆蓋并分泌羊水。羊膜的內層(也被稱為上皮細胞層)被具有分泌功能的一層上皮細胞包覆，分泌羊水，羊膜的外層(也被稱為細胞外基質層，相當于基質)包含間充質細胞。[0061]本說明書中的“包含間充質細胞的細胞群”的形態(tài)沒有特別限定，可以列舉例如：[0062]在本說明書中，對于給定的表面抗原的“呈陽性的(間充質)細胞的比率”如后述的8中，呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上，且呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以質細胞的比率可以為70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、97%以上、99%以上、100%,但沒有特別限定。[0069]另外，上述包含間充質細胞的細胞群中的其它細胞的比率可以為30%以下、20%[0070]表面抗原的CD324是指分化群324,是已知為上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)的蛋白[0072]在上述細胞群中，呈CD324陽性的細胞的比率可以更優(yōu)選為75%以上、80%以上、85%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%[0073]在上述細胞群中，呈CD90陽性的間充質細胞的比率可以更優(yōu)選為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上，可以為[0074]本發(fā)明的一個以上實施方式的細胞群優(yōu)選呈CD326陽性的細胞的比率為10%以[0076]在上述細胞群中，呈CD326陽性的細胞的比率可以更優(yōu)選為5%以下(陰性率95%以上)、4%以下(陰性率96%以上)、3%以下(陰性率97%以上)、2%以下(陰性率98%以上)、1%以下(陰性率99%以上),可以為0%(陰性率100%)。9間充質細胞的比率為80%以上、呈CD105陽性的間充質細胞的比率為70%以上、呈CD45陽性的細胞的比率為10%以下。另外，根據(jù)本發(fā)明的一個方式，由本發(fā)明提供的包含間充質細胞的細胞群優(yōu)選呈CD34陽性的細胞的比率為10%以下。[0078]CD73是指分化群73,是已知為5-核苷酸酶或Ecto-5'-核苷酸酶的蛋白質。[0079]CD166是指分化群166,是已知為Activatedleukocytecelladhesionmolecule[0080]CD105是指分化群105,是已知為Endoglin的蛋白質。[0081]CD45是指分化群45,是已知為PTPRC(Proteintyrosinephosphatase,receptortype,C)或LCA(Leukocytecommonantigen)的蛋白質。[0082]CD34是指分化群34,是已知為Hematopoieticproge蛋白質。[0083]在上述細胞群中，呈CD73陽性的間充質細胞的比率可以更優(yōu)選為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上，可以為[0084]在上述細胞群中，呈CD166陽性的間充質細胞的比率可以更優(yōu)選為85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。[0085]在上述細胞群中，呈CD105陽性的間充質細胞的比率可以更優(yōu)選為74%以上、75%以上、80%以上、85%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上。[0086]在上述細胞群中，呈CD45陽性的細胞的比率可以更優(yōu)選為5%以下(陰性率95%以上)、4%以下(陰性率96%以上)、3%以下(陰性率97%以上)、2%以下(陰性率98%以上)、1%以下(陰性率99%以上),可以為0%(陰性率100%)。[0087]在上述細胞群中，呈CD34陽性的細胞的比率可以更優(yōu)選為5%以下(陰性率95%以上)、4%以下(陰性率96%以上)、3%以下(陰性率97%以上)、2%以下(陰性率98%以上)、1%以下(陰性率99%以上),可以為0%(陰性率100%)。CD45及CD34的表達為陽性的細胞或間充質細胞。[0089]在本發(fā)明的一個以上實施方式中，作為指標的表達標記(CD324、CD90、CD326、CD73、CD166、CD105、CD45或CD34)可以通過該技術領域中公知的任為檢測表達標記的方法，可以列舉例如：流式細胞術或細胞染色，但并不限定于此。在使用熒光標記抗體的流式細胞術中，在檢測到比陰性對照(同型對照)發(fā)出更強熒光的細胞時，判斷該細胞為對該標志物呈“陽性”。熒光標記抗體可以使用該技術領域中公知的任意抗體，可以列舉利用例如異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、別藻藍蛋白(APC)等進行了標記的抗體，但并不限定于此。在細胞染色中，在顯微鏡下觀察到著色或發(fā)出熒光的細胞不使用抗體的非免疫細胞染色。對于免疫細胞染色中使用的抗體，沒有特別限定，為了檢測目標標記，可以使用通常已知的抗體，優(yōu)選使用后述的實施例中使用的抗體。例如，為了檢測CD324陽性而使用的抗體沒有特別限定，可以使用由REA811、67A4、SPM381的克隆制作的隆制作的抗體來檢測CD324陽性。需要說明的是，表達標記與表面抗原含義相同，兩者可以置換使用。[0090]對于本發(fā)明的一個以上實施方式的細胞群而言，有無分化能力沒有特別限定，優(yōu)選具有分化為軟骨組織的分化能力、且不具有分化為脂肪組織的分化能力或分化為脂肪組織的分化能力低，進一步優(yōu)選分化為骨組織的分化能力低或不具有分化為骨組織的分化能[0091]本發(fā)明的一個以上實施方式的細胞群可以在冷凍狀態(tài)下保存至即將使用之前。上述的細胞群除間充質細胞及其它細胞以外還可以包含任意的成分。作為這樣的成分，可以[0092][3]包含間充質細胞的細胞群的制造方法[0093]本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群的制造方法包括：對包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)的工序、從上述包含間充質細胞的細胞群中篩選具有以下特性的細胞群的工序：(a)在上述細胞群中，CD324呈陽性的細胞的比率為70%以上，(b)在上述細胞群中，CD90呈陽性的間充質細胞的比率為90%以上。[0094]根據(jù)本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群的制造方法，可以制備具有上述(a)及(b)的特性的包含間充質細胞的細胞群。上述特性作為得到能夠從基材自發(fā)地剝離的包含間充質細胞的細胞群時的指標是有用的。另外，上述特性作為不使剝離后的間充質細胞群成為單個細胞的形態(tài)而以細胞片的形態(tài)獲得時的指標是有用的。[0095]在上述細胞群的制造方法中，對包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)的工序與從上述包含間充質細胞的細胞群中篩選具有上述特性的細胞群的工序可以是不同的工序，也可以是一體的工序。作為上述兩個工序為一體的工序的例子，例如，如后所述，在能夠篩選滿足上述(a)及(b)中一者或兩者的特性的細胞群的特定條件下對包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)。[0096]在上述細胞群的制造方法中，篩選滿足上述特性的細胞群的工序只要是能夠篩選滿足上述特性的細胞群的工序即可，沒有特別限定。作為這樣的工序，可以舉出例如用細胞分選儀選擇滿足(a)的細胞群，接著，在能夠對得到的細胞群篩選滿足(b)的細胞群的條件下進行培養(yǎng)。另外，可以用細胞分選儀選擇滿足(b)的細篩選滿足(a)的細胞群的條件下進行培養(yǎng)。另外，作為滿足上述特性的細胞群的其它制備方法，可以舉出在能夠篩選滿足上述(a)及(b)的細胞群的特定條件下對細胞群進行培養(yǎng)。對于培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法的詳細情況，在以下進行說明。另外，也可以使用后述的細胞群的篩選方法中記載的方法，篩選滿足上述特性的細胞群。[0097]本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群的制造方法可以優(yōu)選進一步包括：通過對羊膜等胎兒附屬物進行酶處理，獲得作為原料的包含間充質細胞的細胞群的細胞群獲得工序。[0098]羊膜由上皮細胞層和細胞外基質層形成，后者包含間充質細胞。上述的細胞群獲得工序可以進一步包括通過剖宮產得到羊膜的工序。[0099]包含從胎兒附屬物采集到的細胞的細胞群更優(yōu)選為對從胎兒附屬物采集到的試11樣至少用膠原酶進行處理而得到的細胞群，所述試樣包含上皮細胞層和含有間充質細胞的細胞外基質層。[0100]從胎兒附屬物采集到的試樣(優(yōu)選為包含上皮細胞層和含有間充質細胞的細胞外基質層的試樣)的酶處理優(yōu)選為利用能夠使胎兒附屬物的細胞外基質層中包含的間充質細胞游離、且不會分解上皮細胞層的酶(或其組合)進行的處理。作為這樣的酶，沒有特別限定，可以舉出例如膠原酶和/或金屬蛋白酶。作為金屬蛋白酶，可以舉出作為將非極性氨基酸的N末端側切斷的金屬蛋白酶的嗜熱菌蛋白酶和/或分散酶(Dispase),沒有特別限定。[0101]膠原酶的活性濃度優(yōu)選為50PU/ml以上、更優(yōu)選為100PU/ml以上、進一步優(yōu)選為定義為在pH7.5、30℃下1分鐘分解1ug的FITC-collagen的酶量。[0102]金屬蛋白酶(例如，嗜熱菌蛋白酶和/或分散酶)的活性濃度優(yōu)選為50PU/ml以上、更優(yōu)選為100PU/ml以上、進一步優(yōu)選為150PU/ml以上、進一步優(yōu)選為190PU/ml以上。另外，金屬蛋白酶的活性濃度優(yōu)選為1000PU/ml以下、更優(yōu)選為900PU/ml以下、進一步優(yōu)選為800PU/ml以下、進一步優(yōu)選為700PU/ml以下、進一步優(yōu)選為600PU/ml以下、進一步優(yōu)選為500PU/ml以下、進一步優(yōu)選為300PU/ml以下。這里，在使用了分散酶作為金屬蛋白酶的方式離出相當于1ug酪氨酸的氨基酸的酶量。在上述的酶濃度的范圍，可以防止胎兒附屬物的上皮細胞層中包含的上皮細胞的混入，同時可以使細胞外基質層中包含的間充質細胞效率良好地游離。膠原酶和/或金屬蛋白酶的優(yōu)選的濃度的組合可以通過酶處理后的胎兒附屬物的顯微鏡觀察、獲得的細胞的流式細胞術來確定。[0103]從高效率地回收活細胞的觀點考慮，優(yōu)選將膠原酶及金屬蛋白酶組合對胎兒附屬物進行處理。進一步優(yōu)選通過上述組合對胎兒附屬物同時一并進行處理。作為該情況下的金屬蛋白酶，可以使用嗜熱菌蛋白酶和/或分散酶(Dispase),但并不限定于此?？梢酝ㄟ^使用含有膠原酶及金屬蛋白酶的酶液對胎兒附屬物僅進行一次處理而簡便地獲得間充質細[0104]胎兒附屬物的酶處理優(yōu)選將使用生理鹽水、Hank's平衡鹽溶液等清洗液進行了清洗的羊膜浸漬于酶液，一邊通過攪拌裝置進行攪拌，一邊進行處理。作為這樣的攪拌裝置，從使胎兒附屬物的細胞外基質層中包含的間充質細胞效率良好地游離的觀點考慮，可以使用例如攪拌器或振動器，但并不限定于此。攪拌速度沒有特別限定，在使用了攪拌器或振動另外，攪拌速度沒有特別限定，在使用了攪拌器或振動器的情況下，例如為100rpm以下、90rpm以下、80rpm以下、70rpm以下或60rpm以下。酶處理時間沒有特別限定，例如為10分鐘以上或90分鐘以上。另外，酶處理時間沒有特別限定，例如為6小[0105]在本發(fā)明的一個以上實施方式的制造方法中，可以根據(jù)希望利用過濾器、離心分離、中空纖維分離膜、細胞分選儀等公知的方法從包含游離的間充質細胞的酶溶液中分離和/或回收游離的間充質細胞。優(yōu)選利用過濾器對包含游離的間充質細胞的酶溶液進行過濾。在利用過濾器對上述酶溶液進行過濾的方式中，僅游離的細胞通過過濾器，未被分解的上皮細胞層無法通過過濾器而殘留在過濾器上，因此不僅能夠容易地分離和/或回收游離濾器的孔徑為上述范圍，可以通過使包含間充質細胞的酶溶液自然滴落來進行過濾，由此能夠防止細胞生存率的降低。[0106]作為篩網過濾器的材質，優(yōu)選使用尼龍?？梢岳脧V泛用作研究用途的Falcon細使用的醫(yī)療用網眼布(尼龍及聚酯)。另外，也可以利用體外循環(huán)時使用的動脈過濾器(聚酯[0107]在使間充質細胞通過過濾器時，優(yōu)選為自然滴落(自由落下)。也可以為使用了泵等的抽吸等強制性的過濾器通過，為了避免對細胞造成損傷，優(yōu)選設為盡量弱的壓力。[0108]通過過濾器的包含間充質細胞的細胞群可以在用倍量或其以上量的培養(yǎng)基或平衡鹽緩沖液將濾液稀釋之后，通過離心分離進行回收。作為平衡鹽緩沖液，可以使用Dulbecco's磷酸緩沖液(DPBS)、Earle's平衡鹽溶液(EBSS)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸緩沖液(PBS)等，但并不限定于此。[0109]本發(fā)明的一個以上實施方式的制造方法包括：對包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)的工序。[0110]包含間充質細胞的細胞群的培養(yǎng)工序中的細胞的接種密度沒有特別限定，例如可以以例如500～10,000細胞/cm2的密度進行接種。作為上述接種密度的下限，例如優(yōu)選為500細胞/cm2以上、1,000細胞/cm2以[0111]需要說明的是，上述進行培養(yǎng)的工序可以包括傳代工序，也可以包括在不同的培養(yǎng)條件下重復多次培養(yǎng)的工序。[0112]作為上述的1次培養(yǎng)的培養(yǎng)期間，可以舉出例如4～10天，更具體可以舉出4天、5[0113]上述的培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基可以通過以任意的動物細胞培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基并根據(jù)需要適當添加其它成分(血清、血清代替試劑、增殖因子等)而制備。需要說明的是，在上述基礎培養(yǎng)基中添加增殖因子的方式中，可以通過向增殖因子中進一步添加用于使增殖因子在培養(yǎng)基中穩(wěn)定化的試劑(肝素等)而制備，也可以預先用凝膠、多糖類基、以及它們的混合培養(yǎng)基(例如，DMEM/F12培養(yǎng)基(Dulbecco'sModi小板溶解物在培養(yǎng)基中的濃度的下限，可以列舉例如以最終濃度計為1重量%以上、2重20重量%以下、10重量%以下、7重量%以下。如塑料制培養(yǎng)容器),在3%以上且5%以下的CO?濃度、37℃的環(huán)境中使用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)中培養(yǎng)至達到匯合度95%以下的細胞用乙二胺四處理，使其從培養(yǎng)容器(例如塑料制培養(yǎng)容器)剝離。種于培養(yǎng)容器(例如塑料制培養(yǎng)容器),在3%以上且5%以下的CO?濃度、37℃環(huán)境中使用培不進行進一步傳代培養(yǎng)而將培養(yǎng)細胞回收的情況下，可以將細胞培養(yǎng)至達到匯合度100%[0119]本發(fā)明的一個以上實施方式的制造方法可以包括篩選具有以下所示的(a)及(b)的特性的細胞群的工序。[0120](a)呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上，[0121](b)呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上。[0122]作為以上述特性為指標篩選細胞群的方法，可以使用如下方法，所述方法包括如上所述用細胞分選儀篩選滿足上述(a)和/或(b)的特性的細胞群的工序，進一步根據(jù)需要包括在能夠篩選滿足上述工序中未篩選的特性的細胞群的條件下進行培養(yǎng)的工序。另外，作為除細胞分選儀以外的篩選方法，可以使用例如FACS、基于磁珠的分取等物理方法。[0123]另外，作為其它的篩選工序，可以舉出在能夠篩選滿足上述(a)及(b)的特性的細胞群的特定條件下對細胞群進行培養(yǎng)的工序。例如，在上述的細胞群的培養(yǎng)工序中，將優(yōu)選的培養(yǎng)條件適當組合，也能夠得到滿足上述(a)及(b)的特性的細胞群。在該情況下，上述的細胞群的培養(yǎng)工序的一部分或全部也是篩選滿足上述(a)及(b)的特性的細胞群的工序。作為一例，可以舉出在添加了人血小板溶解物等血清代替試劑的培養(yǎng)基中對包含間充質細胞的細胞群進行培養(yǎng)。具體可以列舉：通過使用添加了人血小板溶解物的基礎培養(yǎng)基等適當?shù)呐囵B(yǎng)條件淘汰不滿足指標的細胞，以滿足上述指標的方式對包含間充質細胞的細胞群進行純化的化學方法；或者通過選擇添加了人血小板溶解物的基礎培養(yǎng)基等適當?shù)臉藴逝囵B(yǎng)基進行培養(yǎng)而使其變化為滿足上述指標的細胞群的方法。但是，其方法沒有特別限定，可以根據(jù)培養(yǎng)方法等適當選擇。[0124]需要說明的是，在上述篩選之前，可以包括以上述特性作為指標識別包含多能性干細胞的細胞群的工序。[0125]篩選具有上述(a)及(b)的特性的細胞群的時機沒有特別限定，可以列舉例如：培將細胞的冷凍保存原液解凍后等。[0126]對于篩選具有上述(a)及(b)的特性的細胞群的方法，更詳細地進行說明。[0127]作為通過細胞群的培養(yǎng)來篩選具有上述(a)及(b)的特性的細胞群的方法，可以列舉例如：將包含間充質細胞的細胞群接種于培養(yǎng)基材，在培養(yǎng)基材上進行增殖培養(yǎng)，由此，對呈CD324陽性且呈CD90陽性的間充質細胞進行陽性選擇，對呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上且呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上的細胞群進行剝離/回收的方法。此時，可以使用涂布了抗CD324抗體、抗CD90抗體的培養(yǎng)基材進行培養(yǎng)。從包含間充質細胞的細胞群中通過培養(yǎng)呈CD324陽性且呈CD90陽性的間充質細胞來進行篩選的時機沒有特別限定，可以在任意的傳代培養(yǎng)中進行篩選，優(yōu)選在初代培養(yǎng)中從包含間充質細胞的細胞群中篩選呈CD324陽性且呈CD90陽性的間充質細胞。[0128]另外，也可以通過流式細胞術、使用了磁珠的細胞分離法從包含間充質細胞的細胞群中篩選呈CD324陽性且呈CD90陽性的間充質細胞。[0129]在細胞群的篩選中，優(yōu)選進一步篩選呈CD326陽性的細胞的比率為10%以下的細胞群；優(yōu)選進一步篩選滿足呈CD73陽性的間充質細胞的比率為80%以上、呈CD166陽性的間充質細胞的比率為80%以上、呈CD105陽性的間充質細胞的比率為70%以上、呈CD45陽性的細胞的比率為10%以下中的1項以上的細胞群，更優(yōu)選篩選滿足上述全部的細胞群；優(yōu)選進一步篩選滿足呈CD34陽性的細胞的比率為10%以下的細胞群。可以進一步用上述的方法對篩選后的細胞群進行培養(yǎng)。另外，篩選具有這些追加的特性的細胞群的工序可以是與培養(yǎng)細胞群的工序成為一體的工序，也可以是另外的工序。篩選具有這些追加的特性的細胞群的工序可以是與篩選具有上述(a)及(b)的特性的細胞群的工序成為一體的工序，也可以是另外的工序。[0130]另外，本發(fā)明的一個以上實施方式的制造方法可以包括：將包含上述間充質細胞的細胞群進行冷凍保存的工序。在包括將上述細胞群進行冷凍保存的工序的方式中，可以在將上述細胞群解凍后，根據(jù)需要對上述細胞群進行分離、回收和/或將上述細胞群解凍后直接使用。[0131]用于將包含上述間充質細胞的細胞群進行冷凍保存的方式沒有特別限定，可以列190℃以下、或-196℃(液氮溫度)以下?！?分、-13℃/分、-14℃/分或-15℃/分。在使用了程序冷凍儀作為上述冷凍方式的情況下，例如可以以-2℃/分以上且-1℃/分以下的冷凍速度將溫度降至-50℃以上且-30℃以下之間的溫度(例如，-40℃),進一步以-11℃/分以上且-9℃/分以下(例如，-10℃/分)的冷凍速度將溫度降至-100℃以上且-80℃以下的溫度(例如，-90℃)。[0132]通過上述冷凍方式進行冷凍時，上述的細胞群可以在裝入任意保存容器的狀態(tài)下并不限定于此。[0133]從提高增殖能力相對高的間充質細胞的生存率的觀點考慮，冷凍用保存液優(yōu)選含有多于0質量%的給定濃度的白蛋白。白蛋白的優(yōu)選濃度例如為0.5質量%以上、1質量%以上、2質量%以上、3質量%以上、4質量%以上、5質量%以上、6質量%以上、7質量%以上或8質量%以上。另外，白蛋白的優(yōu)選濃度例如為40質量%以下、35質量%以下、30質量%以下、25質量%以下、20質量%以下、15質量%以下、10質量%以下或9質量%以下。作為白蛋白，[0135]本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群可以作為醫(yī)藥組合物使用。即，根據(jù)本發(fā)明的一個以上實施方式，可以提供一種醫(yī)藥組合物，其包含上述細胞群和藥學上可接受的介質。[0136]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物可以作為細胞治療劑、例如難治性疾病治療劑來使用。[0137]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物可以用作選自免疫相關疾病、缺血性疾變性和/或炎癥引起的疾病、關節(jié)軟骨缺損、半月板損傷、剝脫性骨軟骨炎、無菌性骨壞死、萎縮癥、慢性胰腺炎、慢性腎炎、以及癌中的疾病的治療劑。通過對治療部位給藥能夠測量效果的量的本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物，可以治療上述疾病。[0138]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供用于醫(yī)藥組合物的本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群。[0139]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供用于細胞治療劑的本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群。[0140]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供用于上述疾病的治療的本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群。[0141]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供用于對患者或受試者給藥而進行心肌的再生、心肌細胞的產生、血管新生、血管的修復、或免疫應答的抑制的本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群。[0142]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供對患者或受試者移植細胞的方法、以及患者或受試者的疾病的治療方法，該方法包括：對患者或受試者給藥治療有效量的本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群的工序。[0143]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群在醫(yī)藥組合物的制造中的用途。[0144]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群在細胞治療劑的制造中的用途。[0145]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群在上述疾病的治療劑的制造中的用途。[0146]根據(jù)本發(fā)明的一個以上的實施方式，可以提供本發(fā)明的一個以上實施方式的包含間充質細胞的細胞群在對患者或受試者給藥而進行心肌的再生、心肌細胞的產生、血管新生、血管的修復、或免疫應答的抑制所需要的治療劑的制造中的用途。[0147]作為本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物的給藥量，在對患者或受試者給藥的情況下，為與未給藥的患者或受試者相比能夠獲得對于疾病的治療效果的細胞的量。具體的給藥量可以根據(jù)給藥方式、給藥方法、使用目的、以及患者或受試者的年齡、體重及癥狀等而適當確定。給藥量沒有特別限定，例如，以間充質細胞的細胞數(shù)計為10?個/kg體重以胞的細胞數(shù)計為10?個/kg體重以下、10?個/kg體重以下或10?個/kg體重以下。此外，作為1次個以下。[0148]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物的給藥方法沒有特別限定，可以列舉例或者對局部進行直接移植等。[0149]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物也可以以用于其它疾病治療的注射用制劑、或者細胞團塊或片狀結構的移植用制劑、或者與任意凝膠混合而成的凝膠制劑的形式使用。如上所述，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，由于得到的細胞群能夠以細胞片的形態(tài)從基材剝離，因此也可以將得到的片形態(tài)的細胞群直接(或經最低限度的加工)用作片狀的移植用制劑。即，片狀的包含間充質細胞的細胞群也是本發(fā)明的一個方式。[0150]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物的作為對象的患者或受試者代表性地[0151]本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物可以在冷凍狀態(tài)下保存至即將使用前。本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物可以包含對人治療時所使用的任意成分。作為這[0152]另外，本發(fā)明的一個以上實施方式的醫(yī)藥組合物可以是利用作為藥學上可接受的介質而使用的輸液制劑將包含間充質細胞的細胞群稀釋后的醫(yī)藥組合物。作為本說明書中的“輸液制劑(藥學上可接受的介質)”,只要是對人治療時所使用的溶液即可，沒有特別限[0153]可以對患者或受試者使用包含間充質細胞的細胞群進行治療的疾病等的其它例子、上述疾病等的其它具體例子、以及治療的具體步驟可以參照Hareetal.,J.Am.Col1.Cardiol.,2009590577號公報、日本特表2010-518096號公報、日本特表2012-509087號公報、日本特表2014-501249號公報、日本特開2013-256515號公報、日本特開2014-185173號公報、日本特表2010-535715號公報、日本特開2015-038059號公報、日本特開2015-110659號公報、日本特表2006-521121號公報、日本特表2009-542727號公報、日本特開2014-224117號公報、日本特開2015-061862號公報、日本特表2002-511094號公報、日本特表2004-507454號公報、日本特表2010-505764號公報、日本特表2011-514901號公報、日本特開2013-064003號公報、日本特開2015-131795號公報等中記載的事項。[0154]通過以下的實施例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不限定于實施例。[0155]實施例[0156]比較例1>[0158]從獲得知情同意的擇期剖宮產病例的孕婦(供體#1)無菌采集作為胎兒附屬物的胎膜及胎盤。將得到的胎膜及胎盤容納于裝有生理鹽水的滅菌盆，手工將羊膜從胎膜的斷端剝離。用Hank's平衡鹽溶液(不含Ca/Mg)清洗羊膜，去除附著的血液及血塊。[0159](工序1-2:羊膜的酶處理及間充質細胞的回收)[0160]將包含上皮細胞層和含有間充質細胞的細胞外基質層的羊膜浸漬于含有240PU/mL膠原酶及200PU/mL分散酶(Dispase)I的Hank's平衡鹽溶液(含有Ca/Mg),在37℃、90分鐘、50rpm的條件下進行振蕩攪拌，由此對羊膜進行了酶處理。通過用網眼95μm的尼龍篩網胞的細胞群接種于培養(yǎng)容器CellSTACK(注冊商標)(Corning公司制)。接種密度為6,000cells/cm2的密度。在細胞接種后，在包含以最終濃度計10%的胎牛血清(FBS)及10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的αMEM(AlphaModificationofMinimumEssentialMediumEagle)中貼壁培養(yǎng)至近匯合(subconfluence)。在培養(yǎng)后，每1層進行了傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基更換以2～4天1次的頻率實施。在達到近匯合的時刻，每1層加入等量的CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存1次傳代的細胞群接種于CellSTACK(注冊商標),在包含以最終濃度計10%的胎牛血清(FBS)及10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的αMEM(AlphaModificationofMinim15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，結果是3成左右的細胞群未剝離而以粘附于CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶上述冷凍保存的細胞群解凍，以約6,000cells/cm2的密度將上述第3次傳代的細胞群接種于CellSTACK(注冊商標),在包含以最終濃度計10%的胎牛血清(FBS)及10ng/mL的堿性成Select,在37℃下孵育3分鐘，結果是3成左右的細胞群未剝離而以粘附于CellSTACK(注冊商標)的狀態(tài)殘留在培養(yǎng)容器中。因此，追加孵育5分鐘(總計8分鐘),使上述細胞群完全剝離，對殘留的細胞群也進行了回收。這里得到的細胞群為第4細胞群的1/5量的細胞群接種于與先前培養(yǎng)相同規(guī)模的CellSTACK(注冊商標),由此在包含1次的頻率實施。在達到近匯合的時刻，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，結果是3成左右的細胞群未剝離而以粘附于CellSTACK(注冊商標)的狀態(tài)殘留在培養(yǎng)容器中。因此，追加孵育5分鐘(總計8分鐘),使上述細胞群完全剝離，對殘留的細胞群也進行了回收。這里得到的細胞群為第5次傳代的細胞群。然后，添加RPMI1640,使得細胞濃度達到4×10?cells/mL。向其中加入等量的CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存。[0163](工序1-4:間充質細胞的表面抗原分析)[0164]關于通過上述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的第5次傳代的細胞群，使用流式細胞儀對各種表CD45的陰性率、CD326的陰性率)進行了分析。其結果是，CD324的陽性率小于70%(具體為33%),CD105的陽性率為70%以上(具體為93%),CD73、CD90、CD166的陽性率均為90%以上(具體為CD73:99%、CD90:93%、CD166:97%)。CD45、CD326的陰性率均為95%以上(具體為CD45:100%、CD326:100%)。根據(jù)以上的結果可知，通過上述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞群是包含間充質細胞的細胞群。另外可知，比較例1的第5次傳代的細胞群是盡管滿足呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上的條件，但不滿足呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上的條件的細胞群。[0165]需要說明的是，在本測定中，作為同型對照用抗體，使用了REAControl(S)APC111-909),作為對CD90抗原的抗體，使用了CD90-APC、Human(MiltenyiBiotec公司、克隆：型號：130-111-000)。表面抗原分析使用了Merck公司的GuavaeasyCyte,測定條件設為分析細胞數(shù)30,000cells,流速設定為35.4μL/min。另外，陽性細胞對于各抗原的比率(陽性率)按照以下的步驟計算。的熒光強度的柱狀圖的形式進行繪制。[0168](3)在(2)的柱狀圖中，在利用同型對照用抗體進行了測定的全部細胞中，選擇熒光強度更強的細胞群為0.5%以下的所有區(qū)域(門)。[0169](4)計算出(3)所選擇出的門內包含的細胞在利用與表面抗原標記相對應的抗體進行了測定的全部細胞中的比例。[0170]<實施例1>[0171](工序2-1:羊膜的采集)[0172]從與比較例1相同的供體(供體#1)用與比較例1相同的方法得到了羊膜。[0173](工序2-2:羊膜的酶處理及間充質細胞的回收)[0174]通過與比較例1相同的方法得到了包含間充質細胞的細胞群。[0175](工序2-3:間充質細胞的培養(yǎng))[0176]將通過上述的“工序2-2:羊膜的酶處理及間充質細胞的回收”得到的包含間充質細胞的細胞群接種于培養(yǎng)容器CellSTACK(注冊商標)(Corning公司制)。接種密度為6,000cells/cm2的密度。在細胞接種后，在包含以最終濃度計5%的人血小板溶解物(hPL)的αMEM中貼壁培養(yǎng)至近匯合。在培養(yǎng)后，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第0次傳代的細胞群。然后，將上述細胞群的1/5量的細胞群接種于與先前培養(yǎng)相同規(guī)模的CellSTACK(注冊商標),由此在包含最終濃度為5%的hPL的αMEM中進行了傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基更換以2～4天1次的頻率實施。在達到近匯合的時刻，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第1次傳代的細胞群。然后，添加RPMI1640,使得細胞濃度達到2×10?cells/mL。向其中加入等量的CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶后，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存1天。然后，將上述冷凍保存的細胞群解凍，以約15,000～18,000cells/cm2的密度將上述第1次傳代的細胞群接種于CellSTACK(注冊商標),在包含以最終濃度計5%的人血小板溶解物(hPL)的aMEM中貼壁培養(yǎng)至近匯合。然后，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第2次傳代的細胞群。接著，將上述細胞群的1/5量的細胞群接種于與先前培養(yǎng)相同規(guī)模的CellSTACK(注冊商標),由此在包含最終濃度為5%的hPL的αMEM中進行了傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基更換以2～4天1次的頻率實施。在達到近匯合的時刻，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第3次傳代的細胞群。然后，添加RPMI1640,使得細胞濃度達到4×10?cells/mL。向其中加入等量的CP-1溶液(注冊商標)(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶后，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存1天。然后，將上述冷凍保存的細胞群解凍，以約6,000cells/cm2的密度將上述第3次傳代的細胞群接種于CellSTACK(注冊商標),在包含以最終濃度計5%的人血小板溶解物(hPL)的αMEM中貼壁培養(yǎng)至近匯合。然后，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第4次傳代的細胞群。接著，將上述細胞群的1/5量的細胞群接種于與先前培養(yǎng)相同規(guī)模的CellSTACK(注冊商標),由此在包含最終濃度為5%的hPL的αMEM中進行了傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基更換以2～4天1次的頻率實施。在達到近匯合的時刻層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第5次傳代的細胞群。對于上述細胞群，添加RPMI1640,使得細胞濃度達到4×10?cells/mL。向其中加入等量的CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶后，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存。[0177](工序2-4:間充質細胞的表面抗原分析)[0178]關于通過上述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的第5次傳代的間充質細胞群，使用流式細胞儀對的陽性率為70%以上(具體為CD324:91%、CD105:95%),CD73、CD90、CD166的陽性率均為90%以上(具體為CD73:100%、CD90:100%、CD166:99%)。CD45、CD326的陰性率均為95%以上(具體為CD45:100%、CD326:99%)。根據(jù)以上的結果可知，通過上述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞是包含間充質細胞的細胞群。另外，確認了實施例1中記載的細胞群是呈CD324陽性的細胞的比率為70%以上、且呈CD90陽性的間充質細胞的比率為90%以上的細胞群。[0180]實施例2>[0181]與比較例1、實施例1相比，在以下示出的實施例2條件不同的間充質細胞群。[0182]與比較例1、實施例1不同的是從獲得知情同意的擇期剖宮產病例的3名孕婦(供體#2～#4)無菌采集了作為胎兒附屬物的胎膜及胎盤。[0183](工序3-1:羊膜的采集)[0184]通過與比較例1及實施例1相同的方法得到了羊膜。[0185](工序3-2:羊膜的酶處理及間充質細胞的回收)[0186]將包含上皮細胞層和含有間充質細胞的細胞外基質層的羊膜浸漬于含有480PU/mL膠原酶及400PU/mL分散酶I的Hank's平衡鹽溶液(含有Ca/Mg),在37℃、90分鐘、50rpm的條件下進行振蕩攪拌，由此對羊膜進行了酶處理。通過用網眼95μm的尼龍篩網對酶處理后的溶液進行過濾，去除羊膜的未消化物，回收了包含間充質細胞的細胞懸浮液。[0187](工序3-3:間充質細胞的培養(yǎng))[0188]將通過上述的“工序3-2:羊膜的酶處理及間充質細胞的回收”得到的包含間充質細胞的細胞群接種于培養(yǎng)容器CellSTACK(注冊商標)。接種密度設為1,000cells/cm2。在細胞接種后，在包含以最終濃度計5%的人血小板溶解物(hPL)的aMEM中貼壁培養(yǎng)至近匯合。培養(yǎng)基更換以3～5天1次的頻率實施。在培養(yǎng)后，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第0次傳代的細胞群。然后，添加生理鹽水，使得細胞濃度達到2×10?cells/mL。向其中加入等量的CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶后，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存1天。然后，將上述冷凍保存的細胞群解凍，以約1,000cells/cm2的密度將第1次傳代的細胞群接種于CellSTACK(注冊商標),在包含以最終濃度計5%的人血小板溶解物(hPL)的αMEM中貼壁培養(yǎng)5天至近匯合。然后，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第1次傳代的細胞群。接著，添加生理鹽水，使得細胞濃度達到2×10?cells/mL。向其中加入等量的CP-1(注冊商標)溶液(以CP-1(注冊商標):25%人血清白蛋白=34:16的比例混合而成的溶液),以每份1mL轉移至凍存小瓶后，緩慢冷凍至-80℃,然后在液氮中冷凍保存1天。然后，將上述冷凍保存的細胞群解凍，以約1,000cells/cm2的密度將第2次傳代的細胞群接種于CellSTACK(注冊商標),在包含以最終濃度計5%的人血小板溶解物(hPL)的aMEM中貼壁培養(yǎng)5天至近匯合。然后，每1層CellSTACK(注冊商標)添加15mL的TrypLESelect,在37℃下孵育3分鐘，使上述細胞群完全剝離。這里得到的細胞群為第2