(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號(43)申請公布日2019.11.01(73)專利權(quán)人浙江中醫(yī)藥大學(xué)地址310053浙江省杭州市濱江區(qū)濱文路548號(72)發(fā)明人楊波趙華軍王偉倩朱智慧(74)專利代理機(jī)構(gòu)杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200專利代理師陳升華A61K31/365(2006.01)A61P35/00(2006.01)A61P15/14(2006.01)滕飛等.浙江香茶菜屬植物抗腫瘤活性成分的比較研究及藥效物質(zhì)的快速發(fā)現(xiàn).《浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》.2020,第44卷(第03期),297-302.IsolatedfromIsolationofGuaiaglehninA,StructureRevisionofHiyodorilactoneB,andGeneticComparison.《Chem.Pharm.Bull.》.2008,第56卷(第5期),677-681.cytotoxicityofsesquiterpenelactoneseupatoriopicrin.《Phytotherapy.1988,第2卷(第3期),109-114.(續(xù))從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位及其制備方法和應(yīng)用本發(fā)明公開了一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位及其制備方法和應(yīng)用，該抗腫瘤有效部位包括hiyodorilactoneD、3β-Hydroxyl-8β-sarracinolyoxycostuhiyodorilactonetlgloylcostunohde,依次通過滲漉、粗提物與探壓柱層析等方法，對大麻葉澤蘭進(jìn)行提取、分離純化得到。該有效部位可用于乳腺癌的治療。該方法制備的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，生BB時(shí)間(天)[轉(zhuǎn)續(xù)頁]2BoYang等.Precisedisactivityofanti-triple-negative9.EdnaRibeiro-Varandas等.CytoofEupatoriumcannabinumLAliceGRIGORE等.EvaluationofantiproliferativeandprotectivofEupatoriumcannabinumL.extracts.卷477-486.ZhihuiZhu等.Eucannabinolide,anovelsesquiterpenelactone,sgrowth,metastasisandBCSCS-liketraitsYingyingWei等.EupaformosaninBarbaraMichalak等.EupatoriInhibitsPro-inflamm31.一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位的制備方法，其特征在于，包括以下步(1)將大麻葉澤蘭藥材粉碎、過篩，用乙醇溶液浸泡24～48h后，然后用乙醇滲漉提取，收集滲漉液；(2)將步驟(1)的滲漉液減壓回收乙醇，所得浸膏用水混懸后，再用乙酸乙酯萃取3～5(3)大麻葉澤蘭乙酸乙酯粗提物與探針孵育，所選的探針為還原型谷胱甘肽，通過UPLC-MS分析孵育前后色譜圖的變化，精準(zhǔn)識別乙酸乙酯提取物中含親電倍半萜的部位；(4)大麻葉澤蘭乙酸乙酯粗提物上正相氧化鋁色譜柱或100～200目正相硅膠柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，在步驟(3)分析結(jié)果的指導(dǎo)下，收集含經(jīng)孵育實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)識別出來的含親電倍半萜的流分，得到含有抗腫瘤有效部位的流分，將流(5)將步驟(4)制備得到的有效部位粗產(chǎn)物，進(jìn)行中壓柱層析分離，進(jìn)一步收集富含親電倍半萜的抗腫瘤有效部位的流分，減壓回收溶劑，即得到從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位；從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位，其活性成分包括式A結(jié)構(gòu)的hiyodorilactone4C5D442.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的乙醇溶液的體積百分含量為75～95%,所述的乙醇溶液的體積用量與大麻葉澤蘭藥材的質(zhì)量之比為10L～20L:3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，混懸所用的水的體積用量與浸膏質(zhì)量之比為3L～10L:1kg;萃取所用的乙酸乙酯的體積用量與浸膏質(zhì)量之比為3L～10L:1kg。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，孵育的探針采用溶液的形式，還原型谷胱甘肽用Tris-HCl緩沖液溶解，配5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中酸乙酯體積比為2:1～1:4的流分。7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的中壓柱層析分離采用40～60μm的十八烷基鍵合相硅膠作為填料，上樣后用體積分?jǐn)?shù)40%～100%范圍的甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫3～5個(gè)柱體積。5從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于中藥及天然藥物的研究與開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，涉及從中藥中提取、制備有效部位及其應(yīng)用的領(lǐng)域，尤其是涉及一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]菊科(Compositae)澤蘭屬(Eupatoriu物具有悠久的用藥歷史。[0003]大麻葉澤蘭為菊科澤蘭屬植物大麻葉澤蘭(EupatoriumcannabinumLinn.)的干燥地上部分，據(jù)中國植物志記載：該種遍布?xì)W洲及北非洲，蘇聯(lián)西伯利亞地區(qū)、高加索地區(qū)也有分布。我國僅在江蘇宜興、浙江杭州有記錄，可能是引種歸化的種。課題組經(jīng)野外資源[0004]澤蘭屬中藥：野馬追被2015版中國藥典收載，現(xiàn)已有制劑用于臨床；澤蘭屬中藥：華澤蘭在民間亦有較多應(yīng)用，且中國多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對其化學(xué)成分進(jìn)行過較系統(tǒng)的研究(岳1530-1536;尉小琴，J.Nat.Prod,2018,81,85-91)。大麻葉澤蘭與野馬追、華澤蘭為同屬不同種，親緣關(guān)系較近的植物。課題組研究表明：大麻葉澤蘭亦含有澤蘭屬植物特有的吉瑪烷型的倍半萜，該類倍半萜報(bào)道具有：抗腫瘤、抗菌、殺蟲、抗炎和鎮(zhèn)痛等活性(吳雙慶，HelveticaChimicaActa,2012,95,1637-44;[0005]課題組對大麻葉澤蘭化學(xué)成分及藥理研究的文獻(xiàn)進(jìn)行了調(diào)研，結(jié)果顯示：僅我國臺灣省ChenJJ課題組對該藥用植物做過一些研究(ChenJJ,ChemBiodivers,2014,11,1374-80;ChenJJ,JNatProd,2011,74,1021-7)且該課題組關(guān)注的是大麻葉澤蘭中的：百里酚、苯并呋喃類、苯丙醇類的成分。國外多個(gè)課題組對大麻葉澤蘭進(jìn)行過較系統(tǒng)的研究(WoerdenbagHJ,PharmWeekblSci,1986,8,245-51),關(guān)注較多的是其含有的倍半萜內(nèi)酯類成分及其生物活性。同一個(gè)種的大麻葉澤蘭，由于中國與國外分布的大麻葉澤蘭的生長環(huán)境、氣候等的差異，其成分一般會有較大的差異。項(xiàng)目組實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：大麻葉澤蘭富含蘭為“引種歸化的種”,大麻葉澤蘭生長的地理、氣候等條件的差異，酯結(jié)構(gòu)、含量、各組分間的天然比例，亦會與國外課題組報(bào)道的有較大差異。研究在中國地域分布較窄，野生資源豐富，且具有較高潛在藥用價(jià)值的大麻葉澤蘭具有重要意義。[0006]大麻葉澤蘭在中國的分布范圍較窄，但其野外資源豐富，提示如果該植物藥確實(shí)核試劑發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，屬于親電天然產(chǎn)物或邁克爾受體分子，也可稱之為“親電倍半6萜”。國內(nèi)、外學(xué)者選親核探針，快速發(fā)現(xiàn)親電天然產(chǎn)物、邁克爾受體分子(馬忠俊，些課題組關(guān)注的是用探針去發(fā)現(xiàn)單體化合物、先導(dǎo)化合物。目前，尚未有以親核探針去精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)有效部位或有效組分群，以減少分離、純化的工作量，提高有效部位活性的報(bào)道。探針的使用，能最大限度保留有效部位中能與探針反應(yīng)的成分，剔除不能反應(yīng)的成分，使得大麻葉澤蘭有效部位的成分均為親電倍半萜。中藥多具有：多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，所以精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)富含親電倍半萜的有效部位，更符合中藥起效及用藥的特點(diǎn)，亦可大大減小后續(xù)藥效物質(zhì)研究的工作量。[0008]在澤蘭屬倍半萜抗腫瘤研究方面，岳建民等報(bào)道澤蘭屬華澤蘭中的倍半萜類成分具有抗腫瘤活性(岳建民，J.Nat.Prod,2004,67,638-643);吳雙慶等報(bào)道澤蘭屬野馬追中的倍半萜類成分具有抗腫瘤活性(吳雙慶，HelveticaChimicaActa,2012,95,1637-44),本發(fā)明關(guān)注的是親電倍半萜有效部位，有效部位由多個(gè)親電倍半萜組成，各組分間協(xié)同，可以起到增效減毒的效果，也較易以此為中間體制備抗腫瘤有效部位類的創(chuàng)新中藥新藥，其研發(fā)難度、成本較單一成分新藥的研究均具有比較優(yōu)勢。[0009]倍半萜內(nèi)酯類成分為大麻葉澤蘭重要生理活性成分。迄今為止，雖然國外學(xué)者研究報(bào)道，對大麻葉澤蘭進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，已從大麻葉澤蘭中提取、分離得到了一系列新穎倍半萜內(nèi)酯類化合物，并且鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)；文獻(xiàn)亦報(bào)道該植物中的多個(gè)倍半萜內(nèi)酯類化合物體外具有抗腫瘤活性。但迄今未有對中國國內(nèi)分布的大麻葉澤蘭中含有的親電倍半萜類有效部位的研究報(bào)道，亦沒有提供一種工藝科學(xué)合理，有效部位性能穩(wěn)定、藥效物質(zhì)明確、純度高、生物活性強(qiáng)的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位的制備方法，及其在臨床發(fā)病率高的乳腺癌治療方面的應(yīng)用。[0010]在澤蘭屬倍半萜純化工藝方面，硅膠柱層析法應(yīng)用較多。該法對大麻葉澤蘭親電[0011]在大麻葉澤蘭親電倍半萜應(yīng)用方面，文獻(xiàn)報(bào)道該屬植物藥的倍半萜內(nèi)酯可用于抗腫瘤方面的應(yīng)用，但文獻(xiàn)多集中在倍半萜內(nèi)酯單體的體外抗腫瘤活性，倍半萜內(nèi)酯單體開發(fā)抗腫瘤新藥具有高成本、高風(fēng)險(xiǎn)等缺陷。親電倍半萜有效部位，具有體內(nèi)、外抗腫瘤活性確切，藥效物質(zhì)明確，質(zhì)量穩(wěn)定、可控等優(yōu)勢，且有效部位具有多組分協(xié)同，增效減毒等優(yōu)勢，亦符合中藥多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮藥效的特色。親電倍半萜有效部位可用于制備中藥有效部位類創(chuàng)新抗腫瘤新藥，符合中國新藥研發(fā)的特色與優(yōu)勢。發(fā)明內(nèi)容[0012]本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位及其制備方法和應(yīng)用，該制備方法科學(xué)合理，工藝操作簡單從菊科澤蘭屬中藥大麻葉澤蘭中提取親電倍半萜有效部位。所述大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位(即從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位)藥效物質(zhì)明確，純度高，大麻葉澤蘭親電倍半萜協(xié)同，亦符合中藥多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮藥效的優(yōu)勢及特點(diǎn)，其對發(fā)病率較高的乳腺癌的體內(nèi)、外抑制活性亦預(yù)示其具有重要的應(yīng)用價(jià)值。[0013]一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位，其活性成分包括式A結(jié)構(gòu)的7Eucannabinolide、式D結(jié)構(gòu)的Eupaformosanin、式E結(jié)構(gòu)的hiyodorilactoneB和式F結(jié)構(gòu)的ACBD[0015]一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位的制備方法，包括以下步驟：[0016](1)將大麻葉澤蘭藥材粉碎、過篩，用乙醇溶液浸泡24～48h后，然后用乙醇滲漉提取，收集滲漉液；[0017](2)將步驟(1)的滲漉液減壓回收乙醇，所得浸膏用水混懸后，再用乙酸乙酯萃取3~5次，合并萃取液，萃取液回收溶劑，得到大麻葉澤蘭乙酸乙酯粗提物；[0018](3)大麻葉澤蘭乙酸乙酯粗提物與探針(親核試劑)孵育，通過UPLC-MS(超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)分析孵育前后色譜圖的變化，精準(zhǔn)識別乙酸乙酯提取物中含親電倍半萜的部位；[0019](4)大麻葉澤蘭乙酸乙酯粗提物上正相氧化鋁色譜柱或100～200目正相硅膠柱，8以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，在步驟(3)分析結(jié)果的指導(dǎo)下，收集含經(jīng)孵育實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)識別出來的含親電倍半萜的流分，得到含有抗腫瘤有效部位的流分，[0020](5)將步驟(4)制備得到的有效部位粗產(chǎn)物，進(jìn)行ODS(十八烷基硅烷鍵合硅膠)中壓柱層析分離，進(jìn)一步收集富含親電倍半萜的抗腫瘤有效部位的流分，減壓回收溶劑，即得到從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位。下操作，亦不會造成熱敏性有效成分的破壞或降解。所用大麻葉澤蘭藥材為菊科澤蘭屬植物大麻葉澤蘭(EupatoriumcannabinumLinn.)的地上部分和或全草。大麻葉澤蘭在杭州、[0022]作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述的乙醇溶液(即乙醇水溶液中乙醇)的體積百分含量為75～95%,用量為大麻葉澤蘭藥材質(zhì)量的10～20倍，即所述的乙醇溶液的體積用量與大麻葉澤蘭藥材的質(zhì)量之比為10L～20L:1kg。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，步驟(1)浸泡和滲漉所用溶劑為95%乙醇。該提取溶劑的性質(zhì)非常適合于提取大麻葉澤蘭的全草和/或地上部分，能夠更加高效、完全地獲取藥用部位中所述親電倍半萜類活性成分，且能避免大量極性較大的非親電倍半萜類雜質(zhì)被提取出來。[0023]步驟(2)中，乙酸乙酯極性大于現(xiàn)有技術(shù)中的石油醚，能夠?qū)⒋舐槿~澤蘭乙醇提取物中親電倍半萜類成分萃取完全；乙酸乙酯萃取，亦剔除了大麻葉澤蘭醇提物中極性較大步驟(2)中，混懸所用的水的量為浸膏質(zhì)量的3～10倍，即混懸所用的水的體積用量與浸膏質(zhì)量之比為3L～10L:1kg,萃取所用的乙酸乙酯的量為浸膏質(zhì)量的3～10倍，即萃取所用的乙酸乙酯的體積用量與浸膏質(zhì)量之比為3L～10L:1kg。[0024]作為優(yōu)選，步驟(3)中，通過超高效液相色譜(UPLC)分析，比較孵育前后色譜峰的消失或色譜峰面積的減小，精準(zhǔn)識別富含所需分離、純化的親電倍半萜的部位。[0025]所選的探針(親核試劑)為還原型谷胱甘肽(GSH),孵育的探針采用溶液的形式，還原型谷胱甘肽用Tris-HC1緩沖液溶解，配成濃度為3～10mmol/L,孵育時(shí)間為1～5小時(shí)。GSH能與大麻葉澤蘭中的親電倍半萜類成分發(fā)生親電加成反應(yīng)，通過UPLC-MS分析孵育前后大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物化學(xué)成分的變化，能精準(zhǔn)識別所述親電倍半萜。[0026]硅膠柱層析后，通過UPLC-MS分析所得流分，并將流分分析結(jié)果與(3)分析的結(jié)果進(jìn)行比較，找到富含親電倍半萜的流分，即：收集石油醚-乙酸乙酯體積比為：分。所述洗脫溶劑洗脫能力強(qiáng)，能夠保證得到性能穩(wěn)定、藥理活性好的富含大麻葉澤蘭親電倍半萜的有效流分。洗脫溶劑有比較嚴(yán)格的要求，并對體積比有限定，所述洗脫溶劑洗脫能力強(qiáng)，能夠保證得到性能穩(wěn)定、藥理活性好的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效流分。大麻葉澤蘭倍半萜類成分幾乎全部位于由體積比為2:1～1:4的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫劑洗脫后的洗脫液中，使得大麻葉澤蘭有效流分中親電倍半萜類活性成分含量更高，分布更加集[0027]作為優(yōu)選，步驟(5)中，將步驟(4)制備得到的有效部位粗產(chǎn)物，進(jìn)行ODS(十八烷基硅烷鍵合硅膠)中壓柱層析分離，通過UPLC分析監(jiān)測，進(jìn)一步收集富含所述親電倍半萜(孵育實(shí)驗(yàn)識別出來的色譜峰會消失或色譜峰面積會減小)的流分，剔除沒有該特征的成分的9流分，減壓回收溶劑，即得到從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位。[0028]中壓柱層析分離采用40～60μm的十八烷基鍵合相硅膠作為填料，上樣后用體積分?jǐn)?shù)40～100%范圍的甲醇水溶液梯度洗脫，即上樣后分別用體積分?jǐn)?shù)45%,55%,65%,100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫約3～5個(gè)柱體積。通過薄層色譜及UPLC檢識，并與(3)分析的結(jié)果進(jìn)行比較分析，收集富含能與GSH反應(yīng)的流分，合并流分，減[0029]利用常規(guī)中藥化學(xué)研究方法，提取、分離，并對主要有效成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，研究并闡明了有效部位的藥效物質(zhì)。[0030]一種從大麻葉澤蘭中提取的抗腫瘤有效部位在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤有效部位特別適合用于乳腺癌的治療，特別適合用于制備治療乳腺癌藥物。[0031]該大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體外對人源三陰性乳腺癌細(xì)胞株，具有一定的抑制作用。以MTT法對得到的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，進(jìn)行了抑制人源乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231兩種人源乳腺癌細(xì)胞株具有顯著的抑制作用，半數(shù)抑制濃度IC??約為：1.53~3.30μg/mL。上述細(xì)胞株可采用市售產(chǎn)品，如：可采用美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(Americantypeculturecollection)的各種細(xì)胞株。[0032]該大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體內(nèi)對較難治療的人源三陰性乳腺癌裸鼠異種移植瘤，亦具有一定的抑制作用。以人源腫瘤裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)法對得到的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，進(jìn)行了體內(nèi)抑制人源三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤增殖活性研究，結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，給藥劑量15mg/kg,給藥為：56%。[0033]本發(fā)明大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位可與市售或者常用的載體結(jié)合，可用于制備預(yù)防或者/和治療，或者/和協(xié)同治療乳腺癌的藥物。所述的藥物可以為脂肪乳劑、注射[0035]按照本發(fā)明方法制備所得的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，生物活性強(qiáng)，含有多個(gè)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景的倍半萜內(nèi)酯類成分。多個(gè)親電倍半萜天然組合物針、UPLC-MS分析、反相中壓柱色譜，配合有效部位的藥效物質(zhì)研究，及體外抗乳腺癌活性研究，分離、純化得到了由大麻葉澤蘭多個(gè)特定倍半萜內(nèi)酯：hiyodorilactoneD、3β-Hydroxyl-8β-sarracinolyoxycostunolide、Eucannabinolide、Eupaformosanin、廉價(jià)易得，毒性較低。正相色譜及反相中壓柱色譜均適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，制得的有效部位純度更高，抗乳腺癌活性更強(qiáng)。本發(fā)明大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位的制備方法科學(xué)合附圖說明[0036]圖1為大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物與GSH孵育前后UPLC色譜圖，其中，圖1(A)為大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物與GSH孵育前UPLC色譜圖，[0037]圖1(B)為大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物與GSH孵育后UPLC色譜圖。圖，A為有效部位UPLC-MS分析的總離子流色譜圖(TIC);B為有效部位UPLC-MS分析的UPLC色分別為有效部位中所鑒定的六個(gè)化合物對照品的UPLC色譜圖。hiyodorilactoneD保留時(shí)間對應(yīng)質(zhì)譜圖。Eucannabinolide保留時(shí)間對應(yīng)質(zhì)譜圖。Eupaformosanin保留時(shí)間對應(yīng)質(zhì)譜圖。hiyodorilactoneB保留時(shí)間對應(yīng)質(zhì)譜圖。[0045]圖9、圖10和圖11為大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體內(nèi)對人源三陰性乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑制作用，其中，圖9為生理鹽水組與大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位給藥組瘤塊對比圖；圖10為給藥后隔天監(jiān)測裸小鼠的瘤塊體積曲線；圖11為生理鹽水空白組與大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位組平均瘤塊質(zhì)量的對比圖。具體實(shí)施方式[0046]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于[0048]大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位的制備方法包括下述步驟：95%乙醇冷浸48h后滲漉提取，收集滲漉液。提取總?cè)軇w積相當(dāng)于藥材質(zhì)量的20倍量(總計(jì)用去95%的乙醇40L),得到滲漉液。混懸至1.5L(混懸所用的水的體積用量與浸膏質(zhì)量之比為5L:1kg),用1.5L的乙酸乙酯、1.5L的正丁醇萃取，各萃取溶劑均萃取三次，合并各次的萃取液，分別得到大麻葉澤蘭乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通過體外抗乳腺癌活性追蹤，大麻葉澤蘭抗乳腺癌有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，得到大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物154.2g。[0051]C、UPLC-MS分析：取40μL大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物的甲醇溶液(40mg/mL),加入112.5-7min40%A,7-7.5min40%-50%A,7.5-9min50%A,9-9.5min50%-60%A,9.5-11min60%A,11-12min60%-30%A,30%A再洗脫3min。進(jìn)樣體積1μL,流速0.25mL/min,柱溫和樣品室溫度分別為30與25℃。紫外檢測波長：220nm。質(zhì)譜條件為：掃描模式：正離子模式，掃描范圍：m/z200-800,噴霧電壓：5.5KV,簾氣：40psi,霧化氣：55p離子源溫度：550℃。大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物與GSH孵育前后UPLC色譜圖如圖1所示。25:1,20:1,5:1,2:1,3:2,1:1,2:3,1:2,1:3,1:4,0:1,并按極性由小到大的順序依次進(jìn)行以45%、55%,65%,100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)溶劑梯度洗脫約600mL(4個(gè)柱體積),100mL/瓶，所得流分進(jìn)行UPLC分析，并將分析結(jié)果與大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物與GSH孵育前后UPLC-MS分析結(jié)果進(jìn)行比較分析，收集富含親電倍半萜的流分，合并，減壓回收溶劑，即得所述大麻葉澤蘭倍半萜內(nèi)酯有效部位，約1.15g。[0054]F、大麻葉澤蘭倍半萜內(nèi)酯有效部位藥效物質(zhì)研究：按照常規(guī)中藥化學(xué)研究方法，通過反相中壓柱層析、制備型高效液相柱層析，核磁共振波譜、質(zhì)譜等，從大麻葉澤蘭倍半萜內(nèi)酯有效部位中分離鑒定了六個(gè)倍半萜內(nèi)酯類化合物，分別為：hiyodorilactoneD、3β-hiyodorilactoneB和9β-hydroxy-8β-0-tlgloylcostunohde。六個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式、[0055]取上述制備的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位約10mg,精密稱定，用甲醇定容至2mL容量瓶中，配成約5mg/mL的樣品，樣品10000r/min離心10min,取上清液，備用。取上述樣譜質(zhì)譜條件與步驟C中所述一致。其UPLC-MS分析的總離子流色譜圖，UPLC色譜圖，六個(gè)化合[0057]實(shí)施例1所得大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物，直接進(jìn)行體外抗乳胰腺癌活性評價(jià)。結(jié)果顯示：乙酸乙酯提取物抗乳腺癌活性，較實(shí)施例1所得大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位活性顯著下降。UPLC分析大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物也顯示，乙酸乙酯提取物化學(xué)成分類別復(fù)雜，需花較多精力去闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)，亦很難做到質(zhì)量穩(wěn)定、可控。[0059]以氧化鋁為填料，取大麻葉澤蘭乙酸乙酯提取物樣品上正相柱進(jìn)行分離，結(jié)果顯示大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位得率與實(shí)施例1接近，故正相柱填料用氧化鋁及100~200目硅膠均可。[0061]大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體外抗乳腺癌實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的人源乳腺癌細(xì)胞株，消化計(jì)數(shù)后，按6～9×103個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的實(shí)施例1制備的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位處理，每孔設(shè)三個(gè)復(fù)孔。藥物與腫瘤細(xì)胞孵育48h后，加MTT,37℃繼續(xù)孵掉培養(yǎng)液，加入DMSO(150μL/孔),振搖均勻后，用酶標(biāo)儀在570nm處測定每個(gè)孔的光密度OD[0062]抑制率=(1-給藥孔平均光密度值/對照組平均光密度值)×100%。根據(jù)抑制率計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC?0),IC??用origin軟件計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，IC??取自ATCC,具體結(jié)果如表1所示。表1的結(jié)果顯示，大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體外對兩株人源乳腺癌細(xì)胞株均具有顯著的抑制作用。[0064]表1:大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位對人源乳腺癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度IC?0值[0065]乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞來源IC??值(Hg/mL)MDA-MB-468乳腺癌1.53±0.21MDA-MB-231乳腺癌3.30±0.68[0066]實(shí)施例5[0067]大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體內(nèi)抗乳腺癌實(shí)驗(yàn)：將人源三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞傳代后，調(diào)整細(xì)胞密度為：2.5×10?上。在SPF級動物房里，裸小鼠在背部皮下接種腫瘤細(xì)胞。約7天左右，待腫瘤生長至50mm3,開始測量腫瘤體積，將裸小鼠隨機(jī)分成兩組，每組10只，一組是生理鹽水對照組，另一組是大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位給藥組，給藥劑量為15mg/kg,每天給藥一次，持續(xù)給藥14結(jié)束后，處死裸小鼠后解剖裸小鼠取出腫瘤組織，并稱取腫瘤重量。體積計(jì)算公式：體積=1/2×a×b2計(jì)算，其中a為腫瘤的最長長度，b為腫瘤的最短長度。相對腫瘤體V?。其中V?為分籠給藥時(shí)候所測量的腫瘤體積，V為每次實(shí)驗(yàn)時(shí)腫瘤體積。具體結(jié)果如圖9、圖10和圖11所示。圖9、圖10和圖11所示的結(jié)果顯示，大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位體內(nèi)對人源三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤具有顯著的抑制作用，15mg/kg劑量，給藥14天，抑制率約為56%。[0068]本發(fā)明制備得到的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位可與市售或者常用的載體結(jié)[0069]本發(fā)明大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將本發(fā)明制備的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中，pH通常約5～8,較佳的pH約為6～8,pH可根據(jù)所選輔料、基質(zhì)及治療疾病病癥的不同而有所變化。配制好的藥物可以通過常規(guī)途徑給藥，包括(但并不限于):肌肉、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或局部給藥。所用載體介質(zhì)包括(但并不限發(fā)明大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡糖糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊劑之類的藥物，也可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天1μg/kg體重～2000mg/kg體重。此外，本發(fā)明制備的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位，還可以與其它抗乳腺癌藥物協(xié)同使用。[0070]當(dāng)本發(fā)明大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位被用做藥物時(shí)，可將治療有效劑量的大麻葉澤蘭親電倍半萜有效部位施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少10μg/kg體重，而且在大多數(shù)情況下不超過50mg/kg體重，較佳的給藥劑量約為10μg/kg體重～30mg/kg體重。具體劑量還應(yīng)考慮給藥方式、病人健康狀況等因素，這些屬熟練醫(yī)師技能范疇以內(nèi)。[0071]本發(fā)明中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。1/15頁A1/15頁A說明書附3-Hydroxy-8B-saracinolyoxycot3-Hydroxy-8B-saracinolyoxycot9β-hydroxy-8p-O-tlgloylcosBEucaD3β-Hydroxyl-8β-sarracinolyoxyEEucannabinEEucannabinH