(10)申請公布號CN110655453A(21)申請?zhí)?01911171200.2(71)申請人云南綠新生物藥業(yè)有限公司地址655000云南省曲靖市沾益區(qū)城西工業(yè)園區(qū)(72)發(fā)明人王鉦霖劉勝貴蔣永昌付彬彬李智高孔令羽(54)發(fā)明名稱一種次大麻二酚的提取分離方法(57)摘要本發(fā)明公開了一種次大麻二酚的提取分離方法，該方法采用乙醇水溶液提取后，用有機(jī)溶劑萃取富集次大麻二酚，活性炭脫色后經(jīng)聚酰胺樹脂柱、中性氧化鋁和鍵合硅膠柱純化富集，結(jié)2(1)以大麻的花葉部位為原料，粉碎制成30-50目顆粒后采用質(zhì)量濃度60-80%的乙醇溶液熱回流提取2-3次，每次回流提取1-3小時，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得乙醇提取濃縮液；(2)待步驟(1)乙醇提取濃縮液冷卻至常溫后，加入一定量的正己烷萃取，將次大麻二酚萃取到有機(jī)溶劑相層中，收集合并有機(jī)溶劑相層，回收有機(jī)溶劑，得次大麻二酚萃取濃縮(3)在步驟(2)的次大麻二酚萃取濃縮液中加入一定量的活性炭，升溫?cái)嚢?，靜置2分鐘(4)在步驟(3)的次大麻二酚粗膏中加入質(zhì)量濃度20-30%的乙醇，加熱攪拌形成混懸液，靜置冷卻后取上清液過聚酰胺樹脂柱，上樣完后用純凈水洗脫雜質(zhì)至流出液為無色，然后用質(zhì)量濃度30-42%乙醇溶液洗聚酰胺樹脂柱至流出液為無色，再用質(zhì)量濃度55-60%的乙醇溶液洗脫收集次大麻二酚，分瓶收集，薄層鑒別后合并含有次大麻二酚目標(biāo)物的洗脫液，減壓濃縮回收乙醇，得聚酰胺層析次大麻二酚粗品；(5)將步驟(4)聚酰胺層析次大麻二酚濃縮物用中性氧化鋁干法拌樣，上中性氧化鋁柱，干法上樣后，用氯仿-正己烷溶液洗脫除雜，然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺液洗脫次大麻二酚，收集含次大麻二酚目標(biāo)物洗脫液，濃縮得次大麻二酚半成品，含量大于60%;(6)將步驟(5)次大麻二酚粗品用甲醇溶解，過氨基鍵合硅膠柱、氰基鍵合硅膠柱或苯基鍵合硅膠柱，加壓柱層析，鍵合硅膠柱用質(zhì)量濃度20%的甲醇溶液平衡后，使用質(zhì)量濃度30%-42%的甲醇溶液洗2-3個柱體積，然后用質(zhì)量濃度52-65%的甲醇溶液進(jìn)行次大麻二酚洗脫，薄層層析鑒別，洗脫到無次大麻二酚斑點(diǎn)為止，對濃度52-65%的甲醇洗脫液進(jìn)行薄層層析鑒別，合并含有次大麻二酚的洗脫液，濃縮得次大麻二酚純品；(7)將步驟(6)中濃縮物用環(huán)己烷溶解，加入冰乙酸，混勻后靜置敞口放置結(jié)晶，抽濾，晶體低溫干燥得到次大麻二酚成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的次大麻二酚的提取分離方法，其特征在于：步驟(1)中回流提取第一次提取添加原料質(zhì)量7-9倍的乙醇溶液，其余提取添加原料質(zhì)量4-5倍的乙醇溶液，濃縮溫度75-80℃,真空度0.06-0.078MPa,濃縮至1/10體積。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的次大麻二酚的提取分離方法，其特征在于：步驟(2)加入正己烷萃取，正己烷加入量為乙醇提取濃縮液的2-3倍，萃取次數(shù)為2-3次，合并萃取液濃縮至乙醇提取濃縮液體積的1/5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的次大麻二酚的提取分離方法，其特征在于：步驟(3)加入活性炭的量為次大麻二酚萃取濃縮液的2-8%,升溫至40-50℃,攪拌15-20min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的次大麻二酚的提取分離方法，其特征在于：步驟(5)用正己烷-氯仿是正己烷、氯仿按體積比9:1溶液洗脫除雜；然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺溶液洗脫次大麻二酚，是氯仿、乙酸乙酯和乙醇胺按體積比9:1:2的比例混合制得。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的次大麻二酚的提取分離方法，其特征在于：步驟(7)加入冰乙酸的量為0.8%。3一種次大麻二酚的提取分離方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及一種次大麻二酚的提取分離方法，屬于植物化學(xué)成分提取領(lǐng)域。背景技術(shù)[0002]火麻，又稱漢麻、工業(yè)大麻，是我國傳統(tǒng)的藥材和保健食品原料之一。國家衛(wèi)生部2002年文件將火麻仁列入“既是藥品又是食品的物品名單”,這就使火麻食品的開發(fā)與利用有了法規(guī)保障。這也使得對火麻植物花葉的開發(fā)提供了條件與支撐。近年來，隨著人們對火麻認(rèn)識的加深，以及對其加工產(chǎn)品所具有的較強(qiáng)的生理功能研究的深入，各國普遍重新放開對火麻及其產(chǎn)品開發(fā)的限制。隨之而來的就是，火麻的種植面積的不斷擴(kuò)大和火麻產(chǎn)量的逐年提升。作為火麻植物的副產(chǎn)物，火麻花葉除了可以作為秸稈燃燒作肥外，還含有豐富的具有較強(qiáng)生理活性的大麻酚類物質(zhì)，尤其是大麻二酚(CBD)。如何對火麻花葉進(jìn)行高附加值的利用，是當(dāng)前迫切需要解決的一個技術(shù)與環(huán)境問題。目前關(guān)于大麻二酚的利用與提取報(bào)道頗多，在醫(yī)藥行業(yè)和人類大健康行業(yè)中大麻二酚已經(jīng)充分體現(xiàn)出它獨(dú)特的價值，作為與大麻二酚只相差一個亞甲基的次大麻二酚，在結(jié)構(gòu)上不僅與大麻二份具有相同的母環(huán)，在大麻花葉中同樣具有可提取的價值。[0003]本發(fā)明采用酶解、乙醇水溶液提取配合柱層析分離純化，對漢麻葉中次大麻酚的提取工藝進(jìn)行探尋及優(yōu)化，以尋找漢麻葉次大麻酚的最適提取條件及工業(yè)可行性，目的在于研發(fā)一個適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的工藝，旨在為充分利用漢麻葉中的生物活性成分，實(shí)現(xiàn)漢麻資源的綜合利用和效益最大化提供指導(dǎo)。發(fā)明內(nèi)容[0004]為充分利用漢麻葉中的生物活性成分，探尋漢麻葉中次大麻二酚的可利用度，本發(fā)明提供了一種收率高、產(chǎn)品純度高的次大麻二酚的提取分離方法。[0005]本發(fā)明方法具體步驟如下：(1)以大麻的花葉部位為原料，粉碎制成30-50目顆粒后采用質(zhì)量濃度60-80%的乙醇溶液熱回流提取2-3次，每次回流提取1-3小時，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得乙醇提取濃縮液。[0006](2)待步驟(1)乙醇提取濃縮液冷卻至常溫后，加入一定量的正己烷萃取，將次大麻二酚萃取到有機(jī)溶劑相層中，收集合并有機(jī)溶劑相層，回收有機(jī)溶劑，得次大麻二酚萃取濃縮液。[0007](3)在步驟(2)的次大麻二酚萃取濃縮液中加入一定量的活性炭，升溫?cái)嚢?，靜置2分鐘后用玻砂漏斗過濾，濾液濃縮抽干，得到次大麻二酚粗膏。[0008](4)在步驟(3)的次大麻二酚粗膏中加入質(zhì)量濃度20-30%的乙醇，加熱攪拌形成混懸液，靜置冷卻后取上清液過聚酰胺樹脂柱，上樣完后用純凈水洗脫雜質(zhì)至流出液為無色，然后用質(zhì)量濃度30-42%乙醇溶液洗聚酰胺樹脂柱至流出液為無色，再用質(zhì)量濃度55-60%的乙醇溶液洗脫收集次大麻二酚，分瓶收集，薄層鑒別后合并含有次大麻二酚目標(biāo)物的洗脫4[0009](5)將步驟(4)聚酰胺層析次大麻二酚濃縮物用中性氧化鋁干法拌樣，上中性氧化鋁柱，干法上樣后，用氯仿-正己烷溶液洗脫除雜，然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺液洗脫次大麻二酚，收集含次大麻二酚目標(biāo)物洗脫液，濃縮得次大麻二酚半成品，含量大于60%。[0010](6)將步驟(5)次大麻二酚粗品用甲醇溶解，過氨基鍵合硅膠柱、氰基鍵合硅膠柱或苯基鍵合硅膠柱，加壓柱層析，鍵合硅膠柱用質(zhì)量濃度20%的甲醇溶液平衡后，使用質(zhì)量濃度30%-42%的甲醇溶液洗2-3個柱體積，然后用質(zhì)量濃度52-65%的甲醇溶液進(jìn)行次大麻二酚洗脫，薄層層析鑒別，洗脫到無次大麻二酚斑點(diǎn)為止，對濃度52-65%的甲醇洗脫液進(jìn)行薄層層析鑒別，合并含有次大麻二酚的洗脫液，濃縮得次大麻二酚純品。[0011](7)將步驟(6)中濃縮物用環(huán)己烷溶解，加入冰乙酸，混勻后靜置敞口放置結(jié)晶，抽濾，晶體低溫干燥得到次大麻二酚成品。[0012]所述步驟(1)中回流提取第一次提取添加原料質(zhì)量7-9倍的乙醇溶液，其余提取添加原料質(zhì)量4-5倍的乙醇溶液，濃縮溫度75-80℃,真空度0.06-0.078MPa,濃縮至1/10體積。[0013]所述步驟(2)加入正己烷萃取，正己烷加入量為乙醇提取濃縮液的2-3倍，萃取次數(shù)為2-3次，合并萃取液濃縮至乙醇提取濃縮液體積的1/5。[0014]所述步驟(3)加入活性炭的量為次大麻二酚萃取濃縮液的2-8%,升溫至40-50℃,攪拌15-20min。[0015]所述步驟(5)用正己烷一氯仿是正己烷、氯仿按體積比9:1溶液洗脫除雜；然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺溶液洗脫次大麻二酚，是氯仿、乙酸乙酯和乙醇胺按體積比9:1:2的比例混合制得。[0016]所述步驟(7)加入冰乙酸的量為0.8%。[0017]本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：本發(fā)明方法中采用醇提濃縮后，正己烷萃取，利用了目標(biāo)物極性低的特點(diǎn)，根據(jù)相似相溶的特性，將目標(biāo)物盡可能的萃取到正己烷中，同時將大部分雜質(zhì)留在水中，大大提高了粗提物的純度；在得到的萃取濃縮液中加入活性炭，使得萃取濃縮液中的色素和其他雜質(zhì)明顯減少，更加方便了后續(xù)的分離純化。采用聚酰胺樹脂柱層析純化基本不存在死吸附，樣品很少損失，而現(xiàn)有的硅膠工藝死吸附太大，樣品損失太多，并且用有機(jī)溶劑洗脫成本太高；利用中性氧化鋁對酚類物質(zhì)的死吸附，把目標(biāo)物死吸附在柱子，先溶劑過柱除雜再用堿性溶劑洗脫氧化鋁死吸附的大麻二酚，有效富集大麻二酚，達(dá)到較好的除雜效果；采用氨基、氰基等填料加壓快速閃式分離目標(biāo)產(chǎn)物，柱層析分離速度更快，載樣量更大些，分離度塔板數(shù)和所得樣品純度均高于C-18柱，和凝膠柱純化對比時發(fā)現(xiàn)，凝膠柱層析也能得到高純度化合物，然凝膠柱層析速度較慢；本發(fā)明方法操作簡單，目標(biāo)物質(zhì)在整個工藝中流失量具體實(shí)施方式[0018]為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。[0019]實(shí)施例1本次大麻二酚的提取分離方法步驟如下：5(1)以大麻的花葉部位為原料，粉碎制成40目顆粒，加入質(zhì)量濃度80%的乙醇溶液熱回一次提取添加原料質(zhì)量8倍的乙醇溶液，其余提取添加原料質(zhì)量4倍的乙醇溶液，濃縮溫度78℃,真空度0.06-0.078MPa。[0020](2)待步驟(1)乙醇提取濃縮液冷卻至常溫后，加入乙醇提取濃縮液的2倍的正己烷萃取，萃取2次，將次大麻二酚萃取到有機(jī)溶劑相層中，收集合并醇提取濃縮液體積的1/5,得次大麻二酚萃取濃縮液。[0021](3)在步驟(2)的次大麻二酚萃取濃縮液中加入次大麻二酚萃取濃縮液的8%的活性炭，升溫至42℃,攪拌20min,靜置2分鐘后用玻砂漏斗過濾，濾液濃縮抽干，得到次大麻二酚粗膏。[0022](4)在步驟(3)的次大麻二酚粗膏中加入質(zhì)量濃度20%的乙醇，加熱60℃攪拌形成混懸液，靜置冷卻后取上清液過聚酰胺樹脂柱，上樣完后用純凈水洗脫雜質(zhì)至流出液為無色，然后用質(zhì)量濃度30%乙醇溶液洗聚酰胺樹脂柱至流出液為無色，再用質(zhì)量濃度55%的乙醇溶液洗脫收集次大麻二酚，分瓶收集，薄層鑒別后合并含有次大麻二酚目標(biāo)物的洗脫液，減壓濃縮回收乙醇，得次大麻二酚濃粗品。[0023](5)將步驟(4)聚酰胺層析次大麻二酚濃縮物用中性氧化鋁干法拌樣，上中性氧化鋁柱，干法上樣后，用體積比9:1的正己烷、氯仿溶液洗脫除雜，然后用體乙酸乙酯-乙醇胺液洗脫次大麻二酚，收集含次大麻二酚目標(biāo)物洗脫液，濃縮得次大麻二酚[0024](6)將步驟(5)次大麻二酚粗品用甲醇溶解，過氨基鍵合硅膠柱、氰基鍵合硅膠柱或苯基鍵合硅膠柱，加壓柱層析，鍵合硅膠柱用質(zhì)量濃度20%的甲醇溶液平衡后，使用質(zhì)量濃度36%的甲醇溶液洗3個柱體積，然后用質(zhì)量濃度60%的甲醇溶液進(jìn)行次大麻二酚洗脫，薄層層析鑒別，洗脫到無次大麻二酚斑點(diǎn)為止，對濃度60%的甲醇洗脫液進(jìn)行薄層層析鑒別，合并含有次大麻二酚的洗脫液，濃縮得次大麻二酚純品，含量90%。[0025](7)將步驟(6)中次大麻二酚純品用環(huán)己烷溶解，加入0.8%的冰乙酸，混勻后靜置敞口放置結(jié)晶，抽濾，晶體低溫干燥得到白色次大麻二酚成品，含量[0026]實(shí)施例2本次大麻二酚的提取分離方法步驟如下：(1)以大麻的花葉部位為原料，粉碎制成40目顆粒，加入質(zhì)量濃度70%的乙醇溶液熱回一次提取添加原料質(zhì)量8倍的乙醇溶液，其余提取添加原料質(zhì)量4倍的乙醇溶液，濃縮溫度78℃,真空度0.06-0.078MPa。[0027](2)待步驟(1)乙醇提取濃縮液冷卻至常溫后，加入乙醇提取濃縮液的2倍的正己烷萃取，萃取2次，將次大麻二酚萃取到有機(jī)溶劑相層中，收集合并醇提取濃縮液體積的1/5,得次大麻二酚萃取濃縮液。[0028](3)在步驟(2)的次大麻二酚萃取濃縮液中加入次大麻二酚萃取濃縮液的6%的活性炭，升溫至42℃,攪拌20min,靜置2分鐘后用玻砂漏斗過濾，濾液濃縮抽干，得到次大麻二酚粗膏。[0029](4)在步驟(3)的次大麻二酚粗膏中加入質(zhì)量濃度20%的乙醇，加熱60℃攪拌形成6混懸液，靜置冷卻后取上清液過聚酰胺樹脂柱，上樣完后用純凈水洗脫雜質(zhì)至流出液為無色，然后用質(zhì)量濃度35%乙醇溶液洗聚酰胺樹脂柱至流出液為無色，再用質(zhì)量濃度55%的乙醇溶液洗脫收集次大麻二酚，分瓶收集，薄層鑒別后合并含有次大麻二酚目標(biāo)物的洗脫液，減壓濃縮回收乙醇，得次大麻二酚濃粗品。[0030](5)將步驟(4)聚酰胺層析次大麻二酚濃縮物用中性氧化鋁干法拌樣，上中性氧化鋁柱，干法上樣后，用體積比9:1的正己烷、氯仿溶液洗脫除雜，然后用體乙酸乙酯-乙醇胺液洗脫次大麻二酚，收集含次大麻二酚目標(biāo)物洗脫液，濃縮得次大麻二酚[0031](6)將步驟(5)次大麻二酚粗品用甲醇溶解，過氨基鍵合硅膠柱、氰基鍵合硅膠柱或苯基鍵合硅膠柱，加壓柱層析，鍵合硅膠柱用質(zhì)量濃度20%的甲醇溶液平衡后，使用質(zhì)量濃度38%的甲醇溶液洗3個柱體積，然后用質(zhì)量濃度62%的甲醇溶液進(jìn)行次大麻二酚洗脫，薄層層析鑒別，洗脫到無次大麻二酚斑點(diǎn)為止，對濃度60%的甲醇洗脫液進(jìn)行薄層層析鑒別，合并含有次大麻二酚的洗脫液，濃縮得次大麻二酚純品，含量92[0032](7)將步驟(6)中次大麻二酚純品用環(huán)己烷溶解，加入0.8%的冰乙酸，混勻后靜置敞口放置結(jié)晶，抽濾，晶體低溫干燥得到白色次大麻二酚成品，含量99.3%,提取率93%。本次大麻二酚的提取分離方法步驟如下：(1)以大麻的花葉部位為原料，粉碎制成40目顆粒，加入質(zhì)量濃度75%的乙醇溶液熱回一次提取添加原料質(zhì)量7倍的乙醇溶液，其余提取添加原料質(zhì)量5倍的乙醇溶液，濃縮溫度78℃,真空度0.06-0.078MPa。[0034](2)待步驟(1