(10)授權(quán)公告號(hào)CN1109232(65)同一申請(qǐng)的已公布的文獻(xiàn)號(hào)(73)專利權(quán)人廈門梓蔓生物科技有限公司地址361000福建省廈門市中國(福建)自由貿(mào)易試驗(yàn)區(qū)廈門片區(qū)海景東路18號(hào)4樓A13之3(72)發(fā)明人劉圓圓張熠平呂素娟(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙)11489A01H5/00(2018.01)A01H6/28(2018.01)al..TetrahydrocannabinolicAcidPsychoactivity,isSStorageCavityofthe卷(第9期),姜穎等.大麻THCAPhysiol.》.2005,第46合成酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析.《山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》.2017,第37卷(第5期),M.DavidMarksetal..IdentifofcandidategenesaffectitetrahydrocannabinolbiosynthesisinCannabissativa.《JournalofExperimentalBotany》.2009,第60卷(第13期),PREDICTED:CannabissativaresponsivetranscriptionfactorRAP2-1-like(LOC115712195),mRNA.《Genbank》.2019,一種大麻腺毛中分離的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1及其應(yīng)用本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1及其應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次從植物大麻腺毛中分離了轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1,其核苷酸序列IDNO:2所示。本發(fā)明經(jīng)過功能性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1能夠與THCA合成酶(THCAS)基因啟動(dòng)子相互作用，從而在大麻素類化合物的合成中發(fā)揮激活作用，能夠有效實(shí)現(xiàn)對(duì)大麻素類化合物合成的調(diào)控作用。21.大麻腺毛中分離的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因在調(diào)控大麻THCA合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因能夠與編碼THCA合成酶基因的啟動(dòng)子結(jié)合而正調(diào)控THCA合成酶(THCAS)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中，所述轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因的多核苷酸序列如(a)或(b)所示：(a)、SEQIDNO:1所示的多核苷酸；或(b)、編碼SEQIDNO:2所示氨基酸的多核苷酸。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于植物基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大麻腺毛中分離的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1及其應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]大麻(Cannabissativa)是大麻科大麻屬一年生草本植物，雌雄異株，是人類最早麻的花、葉和根，可以提取其中的藥用成分用于制藥，也可以用作土壤肥料，起到殺蟲防病及增加土壤有機(jī)質(zhì)的功效；韌皮纖維可制成高檔衣服，稈芯纖維可以用作造紙和建筑材料；子?？勺鳛槭称泛惋暳希コ龅挠涂梢宰魃锊裼?。隨著大麻的價(jià)值被深入挖掘，受到越來越多學(xué)科的關(guān)注，更多的國家也加入到大麻的研發(fā)中。中國是全球最大的大麻生產(chǎn)國之一，種植面積已達(dá)全球50%。[0003]大麻素(Cannabinoid)是大麻植物中特有的次生代謝產(chǎn)物，其主要成分是THC和CBD,二者互為同分異構(gòu)體，其中THC具有致幻成癮性，CBD則無致幻成癮性。此外大麻植物包括至少120種大麻素，如大麻酚(CBN),大麻環(huán)萜酚(CBC),四氫大麻酚(THCV)以及大麻萜酚疫調(diào)節(jié)和抗炎抗氧化等方面具有重要的藥用價(jià)值。此外，研究還發(fā)現(xiàn)大麻素具有治療多種制藥公司研制的Epidiolex(CBD含量高達(dá)98%)成為首個(gè)獲FDA批準(zhǔn)大麻藥物，用于治療兒國、加拿大等國家批準(zhǔn)用于治療疾病。CBD不僅引發(fā)了藥品研發(fā)，同時(shí)它膚品、普通飲料和功能性飲料等方面的適用性，吸引著多家跨界巨頭探索新型合作模式。然而，國內(nèi)大麻主要應(yīng)用于紡織纖維領(lǐng)域，大麻素藥用研究幾乎一片空白。中國的工業(yè)大麻主要集中于種植與CBD提純，且提純的CBD主要用于出口。目前，我國關(guān)于包括CBD在內(nèi)的大麻素等大麻活性成分合成及調(diào)控機(jī)制的研究相比于歐美發(fā)達(dá)國家還相差甚遠(yuǎn)。[0004]轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)是廣大生物研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5`端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。轉(zhuǎn)錄因子可以形成一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成所需的基因表達(dá)的時(shí)間、幅度和空間分布。近年來，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)節(jié)大麻素類化合物合成的轉(zhuǎn)錄因子，但還是有很多重要的轉(zhuǎn)錄因子尚未發(fā)現(xiàn)，而且轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定難度較大，研究轉(zhuǎn)錄因子參與基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)過程具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明首次從植物大麻腺毛中分離了轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明經(jīng)過功能性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)錄因4[0006]第一方面，本發(fā)明提供了一種大麻腺毛中分離的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因，所述轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因的多核苷酸序列如(a)、(b)、或(c)所示：[0009](c)、與SEQIDNO:1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)具有CsAPL1轉(zhuǎn)錄因子功能。[0010]第二方面，本發(fā)明提供了所述轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因編碼的氨基酸，序列如SEQ[0011]第三方面，本發(fā)明提供了一種含有權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步地，所述重組表達(dá)載體是重組植物表達(dá)載體。[0012]同時(shí)，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。[0013]第四方面，本發(fā)明提供了所述的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因在調(diào)控植物中大麻類化合物合成中的應(yīng)用。[0015]進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因能夠與順式作用元件結(jié)合而啟動(dòng)植物大[0016]進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因能夠與順式作用元件結(jié)合而正調(diào)控植物大麻中的THCA合成酶(THCAS)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。[0017]本發(fā)明首先對(duì)實(shí)驗(yàn)材料-大麻進(jìn)行種植，等到其成熟后對(duì)雌性大麻的腺毛進(jìn)行分離，以及進(jìn)行RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr。在顯微鏡下觀察分離的懸液，以確定腺毛與花的分離程度。[0018]轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定包括構(gòu)建大麻植株雌花的酵母單雜交cDNA文庫方法、共轉(zhuǎn)化誘餌菌株方法、同源重組篩選出THCAS啟動(dòng)子的上游轉(zhuǎn)錄因子方法、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法、體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證方法、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr(qRT-PCR)方法及生物化學(xué)檢測(cè)方法(如高效液相色譜UPLC),等其他方法進(jìn)一步鑒定控制大麻素類化合物合成的轉(zhuǎn)錄因子。[0019]酵母單雜交(Yeastone-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)道基因表達(dá)的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎(chǔ)是：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由物理和功能上獨(dú)立的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-bindingdomainBD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(ActivationdomainAD)組成，因此可構(gòu)建各種基因與AD的融合表達(dá)載體，在酵母中表達(dá)為融合蛋白時(shí)，根據(jù)報(bào)道基因的表達(dá)情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測(cè)中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。[0020]cDNA文庫(cDNAlibrary):是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的m形成的CDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。CDNA文庫與基因組文庫的最主要的區(qū)別是，基因組文庫含有而CDNA文庫不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列(重復(fù)序列等)。CDNA文庫便于克隆和大量擴(kuò)增，可以從中篩選到所需目的基因，并用于表達(dá)。不論是由細(xì)胞總DNA建立5行篩選，直到獲得目的基因。以mRNA為模的載體(常用噬菌體或質(zhì)粒載體)連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA,并能繁殖庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細(xì)胞特異性。[0021]驗(yàn)證實(shí)施例：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(luciferaseassay)是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。其原理簡(jiǎn)述如下：(1)構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。(2)將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。(3)加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。[0022]進(jìn)一步地，本發(fā)明公開了一種通過體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證的方法技術(shù)鑒定該轉(zhuǎn)錄因子[0023]體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證(Transientexpression):外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，未整合進(jìn)受體細(xì)胞基因組而立即轉(zhuǎn)錄，出現(xiàn)基因產(chǎn)物。體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證是一種快速的研究基因表達(dá)、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及基因間互作的一種重要手段，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因相比，瞬時(shí)表達(dá)不生物安全性高。進(jìn)一步地，本發(fā)明公開了一種通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr(qRT-PCR)方法檢測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1的的表達(dá)情況。[0024]實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr(qRT-PCR)方法是對(duì)mRNA進(jìn)行定量的方法。該方法可用于對(duì)內(nèi)源性基因表達(dá)的mrna進(jìn)行定量檢測(cè)，并可用于基因表達(dá)的定量研究，該方法是目前最行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)[0025]進(jìn)一步，實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr(qRT-PCR)方法的步驟是：(1)提取大麻腺毛中的[0026]高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又稱“高壓法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1編碼基因與大麻中大麻素類化合物的合成具有很密切的關(guān)系，可用于調(diào)節(jié)大麻中大麻素的合成。附圖說明[0028]圖1實(shí)施例1中不同的植物器官對(duì)GUS報(bào)告基因的表達(dá)分析圖，其中圖a:6天大的幼6[0029]圖2實(shí)施例2中酵母雜交圖，其中Pro53和ProTHCAS-P53分別為陽性對(duì)照及陰性對(duì)[0030]圖3實(shí)施例3中Pro35S:APL1-EYFP以及Pro35S:EYFP的細(xì)胞定位圖。[0031]圖4實(shí)施例4中CsAPL1轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證，其中4a為載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)示意圖，圖b為基因表達(dá)量檢測(cè)柱狀圖。[0032]圖5實(shí)施例5中CsAPL1與植物中的THCAS啟動(dòng)子相互作用驗(yàn)證結(jié)果圖，其中圖5a為載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)示意圖，圖5b為基因表達(dá)量檢測(cè)柱狀圖。[0033]圖6實(shí)施例6中大麻植物7周齡雌花不同生長發(fā)育時(shí)期檢測(cè)圖。[0034]圖7實(shí)施例7中不同階段發(fā)育中的花中THCAS,CsAPL1表達(dá)量柱狀圖，以及不同階段發(fā)育中的花中THCA,大麻二酸(CBDA),大麻具體實(shí)施方式[0035]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。[0036]為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的實(shí)施例是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些實(shí)施例獲得其他的實(shí)施方式。其中，所使用的化學(xué)試劑除非有特別說明，其均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解常規(guī)使用試劑。[0038]用基因特異性引物對(duì)548bp的THCAS啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建雙元基因株系進(jìn)行分析。用不同的植物器官對(duì)GUS報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行了組織化學(xué)分析，結(jié)果如的毛狀體中檢測(cè)到GUS活性(圖1g,h)。[0040]利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)靶向結(jié)合序列進(jìn)行篩選，在酵母載體pAbAi中AUR1-C基因上游的MCS(KpnI(5’)和XhoI(3’)中克隆了用于GUS表達(dá)測(cè)定的相同THCAS啟動(dòng)子片段。AUR1-C基因是一種抗真菌抗生素耐藥性基因。構(gòu)建的載體結(jié)構(gòu)為ProTHCAS-AbA,通過BstBI酶進(jìn)行消化切割，并根據(jù)說明書使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化為Y1HGold酵母菌株。以pAbAi的URA3基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，將其整合到Y(jié)1HGold酵母菌株的無功能的ura3位點(diǎn)中。在缺乏合成葡萄糖培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，并在菌落PCR中進(jìn)行驗(yàn)證。以Y1HGold-ProTHCAS-ABA為材從圖中可以看出CsAPL1可以與THCAS啟動(dòng)子相互作用。[0042]為了確定CsAPL1的亞細(xì)胞定位，將全長CsAPL1編碼區(qū)與全長增強(qiáng)型黃色熒光蛋白7(EYFP)融合在一起。CsAPL1-EYFP融合構(gòu)建體以及EYFP芥葉中分離的原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。僅在細(xì)胞核中觀察到了CsAPL1-EYFP(圖3),這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用是一致的。[0044]為了測(cè)試植物中CsAPL1的轉(zhuǎn)錄激活活性，采用了雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定法。將含有螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶基因(LUC)的報(bào)告質(zhì)粒在帶有GAL4結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子(ProGAL4:LUC)的控制下與效應(yīng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，Pro35S:GAL4結(jié)合域(GD,陰性對(duì)照)或GD與單純皰疹病毒VP16激活域的融合(GD-VP16,陽性對(duì)照)或7個(gè)全長CsAPL1(GD-CsAPL1)從擬南芥葉中共轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體(圖4a)。報(bào)告質(zhì)粒ProGAL4:LUC與效應(yīng)質(zhì)粒GD-VP16的共轉(zhuǎn)染引起強(qiáng)烈的LUC活性，而與僅含GD的效應(yīng)子的共轉(zhuǎn)染則導(dǎo)致LUC報(bào)告基因表達(dá)水平降低。ProGAL4:LUC與GD-CsAPL1的共轉(zhuǎn)染顯示出比單獨(dú)的GD更強(qiáng)的LUC活性(圖4b)。這表明當(dāng)被[0046]為了確定CsAPL1是否影響植物中的THCAS啟動(dòng)子，我們將原生質(zhì)體與ProTHCAS:LUC報(bào)告質(zhì)粒和Pro35S:GFP-CsAPL1或Pro35S;GFP效應(yīng)質(zhì)粒和瞬時(shí)熒光素酶活性。相對(duì)于陰性對(duì)照，Pro35S:GFP,GFP-CsAPL1的表達(dá)引起了ProTHCAS定向的熒光素酶活性的增加(圖[0048]在大麻營養(yǎng)生長過程中，在24±2℃光照下生長18h,然后轉(zhuǎn)移到24±2℃光光周期中誘導(dǎo)開花。在大麻植株生長的不同階段中，腺毛的種類和其中大麻素類化合物的含量也會(huì)有所不同。腺毛種類的觀察和腺毛中大麻素類化合物含量的檢測(cè)，對(duì)于研究調(diào)控大麻素類化合物的轉(zhuǎn)錄因子以及定向調(diào)節(jié)大麻素的合成具有重大的意義。因此，根據(jù)大麻腺毛數(shù)量，對(duì)大麻植株的不同生長階段做出了區(qū)別，并用尼康SMZ18型立體顯微鏡對(duì)7周齡雌花進(jìn)A-F=1mm,花萼大小的增加說明了新出現(xiàn)的花蕾向完全成熟的花的發(fā)育。[0049]通過定量RT-PCR測(cè)量在六個(gè)階段的每個(gè)階段中發(fā)育中的花中THCAS,CsAPL1的表超高效液相色譜(UPLC)分析。隨著雌花的成熟，檢測(cè)到THCA和大麻二酸(CBDA)的增加(圖7c、7d),而在此過程中大麻二酚(CBGA)的含量降低(圖7e)。[0050]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。CN110923242B序列表1/2頁8[0002]<110>廈門梓蔓生物科技有限公司[0003]<120>一種大麻腺毛中分離的轉(zhuǎn)錄因子CsAPL1及其應(yīng)用[0010]<213>大麻(Cannabissativa)[0012]atggaagga[0013]cggaagt[0015]gatgatgatcagaagagccgaccgta[0016]gtggcagagattagggagccaaacaagaggtctcggattt[0017]ccaatagcagcggcacgcgcttacgacacc[0018]cggctaaact[0020]accgcccaagctgata[0021]tcgtttaaggccgacctaaaccagtacccggaccccgatgattccga[0026]<213>大麻(Cannabissativa)