(21)申請(qǐng)?zhí)?02010314636.9C12NC12R(71)申請(qǐng)人中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所地址410000湖南省長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)咸嘉湖西路348號(hào)(72)發(fā)明人謝純良彭源德周映君朱作華龔文兵嚴(yán)理胡鎮(zhèn)修(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11227代理人劉猛A61K8/9789(2017.01)A61Q19/00(2006.A61Q19/08(2006.(54)發(fā)明名稱一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法和應(yīng)用(57)摘要本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述方法將茯苓和/或靈芝制備種子液，將種子液中的菌體接種至大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中進(jìn)行培養(yǎng)，然后向培養(yǎng)后的固體中加入乙醇進(jìn)行醇提，所得的醇提液為抗氧化提取物。本發(fā)明選用在食品和化妝品目錄中的茯苓和靈芝兩種微生物菌對(duì)大麻花葉或其提取CBD后的廢渣進(jìn)行處理，使包裹在大麻花葉和大麻花葉廢渣內(nèi)部的抗氧化活性物質(zhì)暴露出來(lái)，再結(jié)合醇提方式從而提高了活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率；相比根霉、米曲霉的處理方式以及單純醇提方式，本發(fā)明方法能夠獲得更高抗氧化活性21.一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法，其特征在于，將茯苓和/或靈芝制備種子液，將種子液中的菌體接種至大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿后加入乙醇進(jìn)行醇提，所得的醇提液為抗氧化提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述種子液為二級(jí)種子液。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述制備種子液的培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L,發(fā)酵麥芽浸粉20g/L,大豆蛋白胨1g/L,發(fā)酵酵母浸粉1g/L,硫酸鎂0.05g/L,磷酸二氫鉀0.1g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)為在20-30℃下恒溫培養(yǎng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述醇提在50-70℃下提取。6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述方法提取的抗氧化提取物。7.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述方法或權(quán)利要求6所述抗氧化提取物在制備化妝品中的應(yīng)用。8.茯苓和/或靈芝在從大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中提取抗氧化成分的應(yīng)3一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]大麻(Hewp)屬于木蘭綱(magnoliopsida)蕁麻目(Urticales)大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(Cannabis)大麻種(CannabissativaL)的一年生草本植物，又稱漢麻、線麻、火麻、寒麻、魁麻等。大麻中四氫大麻酚((THC)含量低于0.3%的大麻稱為工業(yè)大麻，也是目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大麻。超純大麻二酚(CBD)是工業(yè)大麻核心成分，能有效助愈合皮膚損傷等功效。除了CBD以外，花葉中還含有三萜類化合物、黃酮類化合物以及生物堿類。[0003]大麻花葉活性物質(zhì)傳統(tǒng)的提取方法是醇提，乙醇屬于親水性有機(jī)溶劑，對(duì)各類化學(xué)成分的溶解度都較好，提取成分全面。目前常用醇提的乙醇濃度是70%,但是醇提轉(zhuǎn)化率普遍為40%-50%,而且乙醇提取時(shí)間多為5-6小時(shí)，提取時(shí)間長(zhǎng)，且醇提轉(zhuǎn)化率不高，抗氧化活性成分含量普遍較低，另外乙醇容易著火，對(duì)工廠防火防爆要求較高。發(fā)明內(nèi)容[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法，使得所述方法獲得的提取物具備較高的抗氧化活性；[0005]本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供上述方法提取的抗氧化提取物；[0006]本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供茯苓和/或靈芝在從大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中提取抗氧化成分的應(yīng)用；[0007]本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供上述方法或抗氧化提取物在制備化妝品中的應(yīng)[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)[0009]一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法，將茯苓和/或靈芝制備種子液，將種子液中的菌體接種至大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿后(一般為14±2天)直接加入乙醇進(jìn)行醇提，所得的醇提液為抗氧化提取物。[0010]針對(duì)目前大麻花葉醇提效果不佳的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)微生物先期處理而后再醇提的方法，獲得了較多的抗氧化活性物質(zhì)，在DP總還原力上具備更高的活性。[0011]作為優(yōu)選，所述菌體的接種量在10%±2%,所述大麻花葉或大麻花葉廢渣的含水量為60-70%。[0012]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述靈芝購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)ACCC50088;所述茯苓購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)ACCC50876。4[0013]作為優(yōu)選，所述種子液為二級(jí)種子液，即利用種子液的培養(yǎng)基將菌種培養(yǎng)兩次，培養(yǎng)環(huán)境為30℃下?lián)u床培養(yǎng)3-7天，種子液的培養(yǎng)基如下：[0014]葡萄糖20g/L,發(fā)酵麥芽浸粉20g/L,大豆蛋白胨1g/L,發(fā)酵酵母浸粉1g/L,硫酸鎂0.05g/L,磷酸二氫鉀0.1g/L。[0015]具體地二級(jí)種子液制備過(guò)程為，在茯苓和靈芝各自的平板培養(yǎng)基上挑取兩塊1平方厘米大小菌塊于滅菌過(guò)的一級(jí)種子液(300ml規(guī)格錐形瓶，100ml裝液量)內(nèi)，30攝氏度、150r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)7天，取一級(jí)種子液5ml至二級(jí)種子液(300ml規(guī)格，95ml裝液量)內(nèi)，30攝氏度、150r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)第3-4天即可用于接種。養(yǎng)基(1L)制備過(guò)程如下：[0017]取200g新鮮的馬鈴薯切塊煮沸，紗布過(guò)濾，取其濾液，與20.0g葡萄糖，15～20g瓊脂混合溶解，溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶定容1000mL,115℃滅菌30min,倒平板。[0018]作為優(yōu)選，所述靈芝的平板培養(yǎng)基為MEA培養(yǎng)基；在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述菌30min,倒平板。[0020]作為優(yōu)選，所述菌體接種至大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中進(jìn)行培養(yǎng)為在20-30℃下恒溫培養(yǎng)，所述醇提在50-70℃下提取。所述乙醇選擇為≥50%濃度的乙醇；在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)后長(zhǎng)滿菌絲的固體培養(yǎng)基與乙醇的質(zhì)量體積比為1:15-1:30,優(yōu)選為1:20,所述醇提附加超聲波提取。[0021]本發(fā)明分別選擇靈芝、茯苓、根霉和米曲霉四種微生物對(duì)大麻花葉及其大麻花葉渣進(jìn)行處理，而后再醇提；結(jié)果顯示，無(wú)論在大麻花葉中還是在大麻花葉提取CBD后的廢渣中，采用靈芝和茯苓處理的試驗(yàn)組相比其他微生物菌種處理的試驗(yàn)組以及單獨(dú)進(jìn)行醇提的表明本發(fā)明所述方法能夠獲得活性更高的抗氧化提取物。[0022]因此，本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述方法提取的抗氧化提取物；同時(shí)還提供了所述方法或所述抗氧化提取物在制備化妝品中的應(yīng)用，所述化妝品主要應(yīng)用于抗氧化方[0023]此外，從本發(fā)明的對(duì)比試驗(yàn)可以看出，僅在微生物菌種不同的區(qū)別下，茯苓和靈芝均能夠從大麻花葉或其廢渣中提取到更多的抗氧化成分，因此本發(fā)明還提出了茯苓和/或靈芝在從大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣中提取抗氧化成分的應(yīng)用；所述應(yīng)用中，茯苓和/或靈芝在與大麻花葉或提取CBD后的大麻花葉廢渣共培養(yǎng)后再進(jìn)行醇提。[0024]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選用在食品和化妝品目錄中的茯苓和靈芝兩種微生物菌對(duì)大麻花葉或其提取CBD后的廢渣進(jìn)行處理，使包裹在大麻花葉和大麻花葉廢渣內(nèi)部的抗氧化活性物質(zhì)暴露出來(lái)，再結(jié)合醇提方式從而提高了活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率；相比根霉、米曲霉的處理方式以及單純醇提方式，本發(fā)明方法能夠獲得更高抗氧化活性的抗氧化提取物，可最大程度上的利用大麻花葉資源。5和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技[0026]在具體實(shí)施例中，對(duì)比試驗(yàn)中除應(yīng)有的技術(shù)區(qū)別外，其余所用原料、試劑等試驗(yàn)環(huán)境保持一致；[0027]以下就本發(fā)明所提供的一種利用微生物從大麻花葉中提取抗氧化成分的方法和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。[0028]實(shí)施例1:不同微生物處理大麻花葉[0030]將購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的茯苓ACCC50876、靈芝ACCC50088、根霉ACCC30416和米曲霉ACCC30323進(jìn)行平板培養(yǎng)，茯苓、米曲霉和根霉平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，靈芝平板培養(yǎng)基為MEA培養(yǎng)基。[0032]從長(zhǎng)勢(shì)正常的茯苓、靈芝、米曲霉和根霉平板培養(yǎng)基上挑取兩塊1平方厘米大小菌塊于滅菌過(guò)的一級(jí)種子液(300ml規(guī)格錐形瓶，100ml裝液量)內(nèi)，待30攝氏度、150r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)7天，取一級(jí)種子液5ml至二級(jí)種子液(300ml規(guī)格，95ml裝液量)內(nèi)，30攝氏度、150r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)第3-4天即可用于接種。[0033]3、處理大麻花葉[0034]取大麻花葉、大麻渣各3g,分別加入長(zhǎng)圓柱瓶?jī)?nèi)(圓柱瓶平放),加入7ml去離子水，攪拌均勻。分別接種茯苓、靈芝、米曲霉和根霉，接種時(shí)用滅過(guò)菌且剪過(guò)口的5ml規(guī)格槍頭吸取5ml茯苓、靈芝、米曲霉和根霉的二級(jí)種子液于滅過(guò)菌的10ml離心管內(nèi)(菌體接種量在10%±2%),6000r/min離心后去除上清，將固體均勻打入長(zhǎng)圓柱瓶?jī)?nèi)，封口后，放至30℃恒溫箱培養(yǎng)，在14d停止對(duì)茯苓、靈芝、米曲霉和根霉固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行醇提處理；[0035]醇提處理(單獨(dú)醇提同此方式):[0036]固體培養(yǎng)基：醇液=1:20(質(zhì)量體積比),于50攝氏度水浴和超聲輔助下60min,每10min搖勻一次。醇提三次，每次需離心后回收固體重新加入50%乙醇，最后將3次醇提液匯合再定容。[0037]上述每種處理組做3組，后續(xù)測(cè)定結(jié)果取均值。[0038]4、指標(biāo)的測(cè)定方法[0040]A.準(zhǔn)備2mlEP管。實(shí)驗(yàn)組加入1ml樣液+1ml0.2mmol/L的DPPH。對(duì)照組加入1ml樣液+1ml無(wú)水乙醇。空白組加入1ml無(wú)水乙醇+1ml0.2mmol/L的DPPH。[0041]B.于517nm下，測(cè)定實(shí)驗(yàn)組吸光度，記為Ai。測(cè)定對(duì)照組吸光度，記為Aj.記空白組為Ao。[0042]C.公式為：DPPH清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%6[0043](2)超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定法[0044]A.取10mlEP管，加入5.7ml的50mmol/LpH8.2的Tris-HC1緩沖液，后加入0.2ml樣液，混勻后于25℃保溫10min。[0045]B.在25℃下預(yù)熱10mmol/L的鄰苯三酚溶液，加入0.1ml于EP管中。[0046]迅速搖勻，在320nm波長(zhǎng)記錄其處1min內(nèi)吸光度的增加值(As)。用等體積純水替代樣液，測(cè)定其在320nm波長(zhǎng)下1min內(nèi)吸光度的增加值(Ao)。[0047]注：同時(shí)迅速測(cè)量第一次吸光度，后接連測(cè)量3次吸光度。需消耗3min+。[0048]C.公式：超氧陰離子自由基清除率(%)=(Ao-As)/Ao或1-As/Ao[0049](3)總還原力的測(cè)定法[0050]A.取用10mlEP管。吸取1ml待測(cè)液(空白組用蒸餾水),依次加入2.5ml0.2ml/L的PBS(pH=6.6)溶液和2.5ml1%的鐵氰化鉀溶液。[0051]B.混合溶液置于50℃水浴鍋保溫20min。[0052]C.加入2.5ml10%的三氯乙酸。[0053]D.若產(chǎn)生渾濁，則將混合液于室溫3500r/min離心10min,吸取2.5ml上清液，后吸取2.5ml純水。若不產(chǎn)生沉淀，則直接吸取2.5ml上清液，加入2.5ml純水。[0054]E.最后加入0.5ml0.1%的FeCl?溶液，混勻反應(yīng)10min。[0055]吸取300ul,于波長(zhǎng)700nm下測(cè)其吸光度，吸光度與還原能力成正比；[0057]見(jiàn)表1-表3。[0058]表1DPPH自由基清除率處理/樣品14d大麻花葉大麻花葉渣茯苓靈芝根霉米曲霉直接醇提茯苓/花葉靈芝/花葉根霉/花葉米曲霉/花葉茯苓/花葉渣靈芝/