家蠶核型多角體病毒Bm134與Bm51基因特性的深度解析一、引言1.1研究背景與意義家蠶核型多角體病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）屬于桿狀病毒科甲型桿狀病毒屬，是蠶桑生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病原微生物。家蠶感染BmNPV后會引發(fā)血液型膿病，各齡蠶均會發(fā)生，以5齡中期到老熟前后發(fā)生最多，病蠶后期表現(xiàn)為體色乳白，環(huán)節(jié)腫脹，狂躁爬行，體壁易破，流膿而死，給蠶桑產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，我國因病毒性疾病所造成的損失，約占總蠶病損失的70-80%，而BmNPV病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見且危害最嚴(yán)重的一類蠶病。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對BmNPV的研究取得了顯著進展。眾多學(xué)者針對BmNPV的基因功能展開研究，如江蘇科技大學(xué)黃金山研究員團隊對膜融合蛋白GP64信號肽的研究，證明BmNPVGP64介導(dǎo)病毒與宿主的雙重融合機制，進一步加深了對BmNPV感染機制的理解。然而，盡管已有部分基因功能被報道，但BmNPV基因組中仍存在許多基因功能尚未明確，這些未知基因可能在病毒的感染、復(fù)制、致病等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究這些基因，將有助于全面解析BmNPV的分子生物學(xué)機制。在這樣的研究背景下，Bm134和Bm51基因作為BmNPV中功能未知的基因，成為了極具研究價值的對象。研究Bm134和Bm51基因，對了解BmNPV的感染、復(fù)制和致病機制具有重要意義。通過明確這兩個基因在病毒生命周期中的具體作用，如它們是否參與病毒的吸附、侵入、核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒粒子的組裝和釋放等過程，能夠從分子層面深入認識BmNPV的致病機理，為后續(xù)開發(fā)有效的防控措施提供堅實的理論基礎(chǔ)。對Bm134和Bm51基因的研究成果，可為家蠶抗病品種的選育提供關(guān)鍵的理論支撐。在家蠶抗病品種選育過程中，明確與抗病相關(guān)的基因靶點至關(guān)重要。若能證實Bm134和Bm51基因與家蠶對BmNPV的抗性或敏感性密切相關(guān)，就可以通過分子標(biāo)記輔助選擇、基因編輯等現(xiàn)代生物技術(shù)，精準(zhǔn)地選育出具有高抗病性的家蠶品種，從而有效降低BmNPV病的發(fā)生率，提高家蠶的養(yǎng)殖效益，保障蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定發(fā)展。從更宏觀的角度看，桿狀病毒在生物防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。深入了解Bm134和Bm51基因的特性，有助于開發(fā)以BmNPV為基礎(chǔ)的生物防治劑。通過對這兩個基因的調(diào)控或改造，可以優(yōu)化BmNPV的性能，增強其對害蟲的感染力和致病性，同時降低對非靶標(biāo)生物的影響，使其成為一種更加高效、安全的生物防治工具，為農(nóng)業(yè)害蟲的綠色防控提供新的策略和手段。對Bm134和Bm51基因的研究在理論和實踐層面都具有不可忽視的重要性，有望為蠶桑產(chǎn)業(yè)的病害防治和生物防治領(lǐng)域帶來新的突破和發(fā)展。1.2家蠶核型多角體病毒概述家蠶核型多角體病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）屬于桿狀病毒科（Baculoviridae）甲型桿狀病毒屬（Alphabaculovirus）。其病毒粒子呈桿狀，大小約為400×90nm，在病毒粒子的一端具有乳頭狀突起，這一結(jié)構(gòu)被認為是病毒感染細胞的吸附裝置。BmNPV的病毒粒子由衣殼、衣殼內(nèi)的髓核和衣殼外的囊膜構(gòu)成。在感染過程中，其核衣殼在細胞核內(nèi)形成后，會以兩種形式獲得囊膜，進而形成兩種類型的病毒體：一種是核衣殼通過細胞質(zhì)膜芽殖釋放到細胞間質(zhì)中，稱為芽生病毒（BuddedVirus，BV），BV主要負責(zé)病毒在宿主體內(nèi)的早期傳播和系統(tǒng)性感染，能夠感染家蠶的各種組織和器官；另一種是核衣殼在宿主細胞核中獲得囊膜，其囊膜具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，病毒體被包埋在蛋白質(zhì)結(jié)晶包含體中，稱為多角體源性病毒體（Occlusion-derivedVirus，ODV）。多角體是BmNPV在感染細胞中形成的一種蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)，其形狀不一，多數(shù)為四角形、六角形，大小范圍在0.5至15μm之間，一般為2至6μm。多角體不溶于乙醇及二甲苯等有機溶劑，對熱、濃酸等均不穩(wěn)定，易溶于堿性溶液。BmNPV的感染循環(huán)較為復(fù)雜。當(dāng)家蠶攝入含有多角體的食物后，在堿性消化液的作用下，多角體溶解，釋放出ODV。ODV通過與宿主中腸上皮細胞表面的受體結(jié)合，進而侵入細胞。在細胞內(nèi)，ODV脫殼釋放出病毒DNA，病毒DNA進入細胞核，啟動病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。早期基因表達的產(chǎn)物參與調(diào)控病毒基因組的復(fù)制以及后續(xù)基因的表達。隨著感染的進行，大量的子代病毒粒子在細胞核內(nèi)組裝形成，一部分以BV的形式通過出芽方式釋放到細胞外，感染周圍的細胞，實現(xiàn)病毒在宿主體內(nèi)的擴散；另一部分則被包裹在多角體中，當(dāng)細胞破裂后，多角體釋放到環(huán)境中，成為新的傳染源，繼續(xù)感染其他家蠶。BmNPV對家蠶產(chǎn)業(yè)的危害極其嚴(yán)重。家蠶感染BmNPV后，會引發(fā)血液型膿病。各齡蠶均可能感染發(fā)病，其中以5齡中期到老熟前后發(fā)病最為頻繁。病蠶在后期表現(xiàn)出一系列典型癥狀，體色乳白，如同被乳汁浸潤；環(huán)節(jié)腫脹，身體顯得異常臃腫；狂躁爬行，行為失去常態(tài)，這是由于病毒在蠶體內(nèi)大量繁殖，破壞了蠶的正常生理機能，導(dǎo)致蠶體出現(xiàn)不適，從而表現(xiàn)出異常行為；體壁易破，輕輕觸碰就可能破裂，隨后流膿而死，流出的膿液中含有大量的病毒粒子和多角體，這些物質(zhì)會污染蠶座和周圍環(huán)境，進一步傳播病毒，引發(fā)其他健康家蠶的感染。據(jù)統(tǒng)計，我國因病毒性疾病所造成的損失，約占總蠶病損失的70-80%，而BmNPV病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見且危害最嚴(yán)重的一類蠶病。一旦BmNPV病大規(guī)模爆發(fā)，會導(dǎo)致蠶繭產(chǎn)量大幅下降，蠶繭質(zhì)量變差，給蠶農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響蠶桑產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入解析家蠶核型多角體病毒（BmNPV）中Bm134和Bm51基因的特性，為全面了解BmNPV的分子生物學(xué)機制、防控家蠶核型多角體病毒病提供理論依據(jù)。本研究將對Bm134和Bm51基因進行轉(zhuǎn)錄時相分析，以BmNPV感染的家蠶細胞或組織為材料，在不同的感染時間點提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測Bm134和Bm51基因在不同時間點的轉(zhuǎn)錄水平，明確其轉(zhuǎn)錄起始時間、轉(zhuǎn)錄高峰以及轉(zhuǎn)錄持續(xù)時間，探究這兩個基因在病毒感染過程中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律。本研究還會開展基因表達時相分析，同樣以BmNPV感染的家蠶細胞或組織為材料，在不同感染時間點提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用特異性針對Bm134和Bm51蛋白的抗體，檢測這兩個基因編碼蛋白在不同時間點的表達情況，確定蛋白的表達起始時間、表達高峰以及表達變化趨勢，分析基因表達與病毒感染進程的關(guān)系。從亞細胞和病毒結(jié)構(gòu)兩個層面，對Bm134和Bm51蛋白進行定位分析。在亞細胞定位方面，構(gòu)建帶有熒光標(biāo)簽（如綠色熒光蛋白GFP）的Bm134和Bm51基因表達載體，轉(zhuǎn)染家蠶細胞，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號在細胞內(nèi)的分布情況，確定蛋白在細胞內(nèi)的定位，判斷其主要存在于細胞核、細胞質(zhì)還是其他細胞器中；在病毒結(jié)構(gòu)定位方面，通過免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合電子顯微鏡觀察，明確Bm134和Bm51蛋白是否為病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白，以及它們在病毒粒子中的具體位置。利用Red重組系統(tǒng)等基因編輯技術(shù)，在大腸桿菌中對BmNPV基因組中的Bm134和Bm51基因進行定點敲除，構(gòu)建基因缺失型病毒；同時，構(gòu)建含有野生型Bm134和Bm51基因的拯救病毒。將野生型病毒、基因缺失型病毒和拯救病毒分別感染家蠶細胞或家蠶幼蟲，通過觀察細胞病變效應(yīng)、測定病毒滴度、分析病毒DNA復(fù)制情況等，研究基因缺失對病毒復(fù)制、感染能力以及病毒粒子形成的影響；觀察感染基因缺失型病毒的家蠶幼蟲的發(fā)病癥狀、死亡率等指標(biāo)，評估基因缺失對病毒致病性的影響。綜合以上基因轉(zhuǎn)錄、表達、定位、基因缺失等方面的研究結(jié)果，初步探索Bm134和Bm51基因在BmNPV感染、復(fù)制和致病過程中的功能。結(jié)合已有的BmNPV相關(guān)研究成果，從分子層面推測這兩個基因在病毒生命周期中的作用機制，為后續(xù)更深入的功能研究奠定基礎(chǔ)。二、材料與方法2.1實驗材料家蠶品種選用實驗室長期飼養(yǎng)的大造品種，該品種對BmNPV較為敏感，在以往的BmNPV相關(guān)研究中常被選用，具有良好的實驗重復(fù)性和穩(wěn)定性。家蠶飼養(yǎng)于人工氣候箱中，溫度控制在25±1℃，相對濕度保持在75-80%，以新鮮桑葉為食，嚴(yán)格按照家蠶飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行飼養(yǎng)管理。實驗所用的家蠶卵巢細胞系BmN，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。BmN細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的TC-100昆蟲培養(yǎng)基中，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次傳代，傳代時使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。BmNPV毒株為T3株，由本實驗室保存。該毒株是通過對自然感染的BmNPV進行分離、純化和鑒定獲得，其基因組序列已被測定，在國內(nèi)外的BmNPV研究中廣泛應(yīng)用。BmNPV病毒液的制備采用常規(guī)方法，將感染BmNPV的家蠶細胞培養(yǎng)物進行離心、過濾等處理，去除細胞碎片和雜質(zhì)，獲得高滴度的病毒液，保存于-80℃冰箱備用。原核表達載體pET-30a(+)購自Novagen公司，該載體具有多克隆位點、T7啟動子等元件，在原核表達系統(tǒng)中能夠高效表達外源基因，常用于重組蛋白的表達和純化?？寺≥d體pMD18-T購自TaKaRa公司，其含有T載體通用引物序列和多克隆位點，可用于PCR產(chǎn)物的克隆，操作簡便，克隆效率高。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ等，DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等工具酶均購自TaKaRa公司。這些工具酶具有高活性和特異性，能夠滿足基因克隆、表達載體構(gòu)建、PCR擴增、反轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實驗的需求。用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測的Bm134和Bm51蛋白的多克隆抗體，由本實驗室制備。具體制備過程為：將純化的Bm134和Bm51重組蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過多次免疫后，采集兔血清，通過親和層析等方法純化血清中的抗體，獲得高純度的多克隆抗體。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購自JacksonImmunoResearch公司，用于檢測目的蛋白與一抗的結(jié)合，通過酶促反應(yīng)使底物顯色，從而實現(xiàn)對目的蛋白的檢測。實時熒光定量PCR所用的SYBRGreenⅠ熒光染料購自Roche公司，該染料能夠特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，在PCR擴增過程中，隨著DNA的擴增，熒光信號強度不斷增強，通過檢測熒光信號的變化可以實時監(jiān)測PCR反應(yīng)進程，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。其他常規(guī)試劑如Tris、EDTA、NaCl、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等均為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。這些試劑在核酸提取、蛋白質(zhì)電泳、緩沖液配制等實驗中廣泛應(yīng)用，其純度和質(zhì)量能夠滿足實驗要求。2.2實驗方法2.2.1基因克隆與序列分析以BmNPVT3株基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank中公布的BmNPV全基因組序列（登錄號：NC_001962.1），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，用于擴增Bm134和Bm51基因。引物設(shè)計時，在上下游引物的5’端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)的克隆操作。采用高保真TaqDNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)體系為50μL，包括10×PCR緩沖液5μL，dNTPs（2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，高保真TaqDNA聚合酶1μL，ddH?O37μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1-2min（根據(jù)基因片段長度調(diào)整），共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0-1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察并拍照，確認擴增產(chǎn)物的大小和特異性。使用DNA凝膠回收試劑盒（如TaKaRa公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit）對目的條帶進行回收純化，具體操作按照試劑盒說明書進行。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，回收的PCR產(chǎn)物4μL，SolutionⅠ5μL，輕輕混勻后，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。從-80℃冰箱取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上解凍；取10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速放回冰上冷卻2min；加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h（150-200rpm）。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，待長出單菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒（如TaKaRa公司的MiniBESTPlasmidPurificationKit）提取重組質(zhì)粒。對提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切體系為20μL，包括重組質(zhì)粒5μL，10×Buffer2μL，限制性內(nèi)切酶各1μL，ddH?O11μL，37℃酶切2-3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷插入片段的大小是否正確。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司（如上海生工生物工程股份有限公司）進行測序。測序結(jié)果使用DNAStar軟件中的SeqMan模塊進行拼接和校對。將獲得的Bm134和Bm51基因序列與GenBank中已有的BmNPV序列進行比對，使用BLAST工具分析其同源性。利用在線軟件ProtParam（/protparam/）預(yù)測基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)，如分子量、等電點、氨基酸組成等。通過在線軟件SignalP5.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白是否含有信號肽。運用TMHMMServerv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。使用NCBI的ConservedDomainDatabase（CDD）分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。2.2.2基因轉(zhuǎn)錄時相分析將處于對數(shù)生長期的BmN細胞以1×10?個/mL的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%FBS的TC-100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)24h，使細胞貼壁并達到70-80%的匯合度。吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，加入適量的BmNPV病毒液（MOI=5），27℃吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，吸出病毒液，加入2mL含2%FBS的TC-100培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染后0、6、12、24、36、48、72、96h收集細胞。收集時，將細胞培養(yǎng)板置于冰上，吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，然后每孔加入1mLTRIzol試劑（Invitrogen公司），按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。用微量分光光度計（如Nanodrop2000）測定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL，OligodTPrimer1μL，Random6mers1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用SYBRGreenⅠ熒光染料法進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。引物設(shè)計根據(jù)Bm134和Bm51基因序列，同時設(shè)計家蠶肌動蛋白基因（BmActin）作為內(nèi)參基因引物。實時熒光定量PCR反應(yīng)在實時熒光定量PCR儀（如ABI7500）上進行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用2?ΔΔCt法。首先計算每個樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，然后計算ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。以感染后0h樣品的ΔCt值作為對照，計算其他時間點的ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照。最后根據(jù)2?ΔΔCt公式計算目的基因在不同時間點的相對表達量。使用GraphPadPrism軟件繪制基因轉(zhuǎn)錄時相曲線，分析基因轉(zhuǎn)錄的起始時間、高峰時間和變化趨勢。2.2.3基因表達時相分析構(gòu)建Bm134和Bm51基因的原核表達載體。以BmNPV基因組DNA為模板，PCR擴增Bm134和Bm51基因的開放閱讀框（ORF），引物設(shè)計時在上下游引物的5’端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶識別位點（如EcoRⅠ和HindⅢ），以便與原核表達載體pET-30a(+)連接。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，與同樣經(jīng)雙酶切的pET-30a(+)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21（DE3）單菌落接種到含有卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1:100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???達到0.6-0.8。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5-1.0mM，誘導(dǎo)重組蛋白表達，誘導(dǎo)時間分別為0、2、4、6、8h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃，8000rpm離心10min收集菌體。用PBS重懸菌體，超聲破碎細胞（功率200W，工作3s，間歇5s，共30min），使細胞充分裂解。4℃，12000rpm離心30min，分別收集上清和沉淀。上清即為可溶性蛋白部分，沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液（如50mMTris-HCl，pH8.0，1MNaCl，1%TritonX-100）洗滌3次，以去除雜質(zhì)，最后用8M尿素溶解包涵體，得到包涵體蛋白部分。采用SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達情況。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將樣品與上樣緩沖液（5×）按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取適量變性后的樣品上樣，以蛋白質(zhì)Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳條件為：濃縮膠80V，分離膠120V，電泳至溴酚藍指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍R-250染色液染色1-2h，再用脫色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）脫色，直至背景清晰，觀察蛋白條帶。若重組蛋白主要以包涵體形式表達，需對包涵體進行復(fù)性和純化。將溶解的包涵體蛋白緩慢滴加到復(fù)性緩沖液（如50mMTris-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，2mMEDTA，5%甘油，1mMDTT）中，4℃透析復(fù)性過夜。復(fù)性后的蛋白通過Ni-NTA親和層析柱進行純化，具體操作按照Ni-NTAAgarose說明書進行。先用含有20-50mM咪唑的洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，20-50mM咪唑）洗脫雜蛋白，再用含有250-500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，用SDS-PAGE檢測純化效果。將純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。首次免疫時，將重組蛋白與弗氏完全佐劑按1:1的比例混合，充分乳化后，在兔子的背部多點皮下注射，每只兔子注射蛋白量為1mg。此后每隔2-3周進行一次加強免疫，共免疫3-4次，加強免疫時使用弗氏不完全佐劑。末次免疫后7-10天，采集兔血清，通過間接ELISA法檢測抗體效價。當(dāng)抗體效價達到1:10000以上時，頸動脈放血收集血清，使用ProteinA親和層析柱純化抗體，得到高純度的多克隆抗體。將BmNPV以MOI=5感染BmN細胞，分別在感染后0、12、24、36、48、72、96h收集細胞。用PBS洗滌細胞3次，加入適量的細胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液），冰上裂解30min。4℃，12000rpm離心15min，收集上清，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量的細胞總蛋白，加入上樣緩沖液（5×），100℃煮沸5min使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳，電泳條件同前。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，轉(zhuǎn)膜1.5-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（TBST配制）中，室溫封閉1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后的PVDF膜與制備的Bm134或Bm51蛋白多克隆抗體（1:1000-1:5000稀釋）孵育，4℃過夜。用TBST洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000-1:10000稀釋）室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min。最后加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL發(fā)光液），在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，檢測蛋白表達情況。以β-Actin作為內(nèi)參蛋白，分析Bm134和Bm51蛋白在不同時間點的相對表達量。2.2.4亞細胞定位分析構(gòu)建Bm134和Bm51基因與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體。以BmNPV基因組DNA為模板，PCR擴增Bm134和Bm51基因的ORF，引物設(shè)計時去除基因終止密碼子，并在上下游引物的5’端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶識別位點（如EcoRⅠ和BamHⅠ），以便與含有GFP基因的表達載體（如pEGFP-N1）連接。PCR擴增產(chǎn)物和pEGFP-N1載體分別進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證。將處于對數(shù)生長期的BmN細胞以1×10?個/mL的密度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入500μL含10%FBS的TC-100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)24h，使細胞貼壁并達到50-60%的匯合度。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BmN細胞中。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為無血清的TC-100培養(yǎng)基。按照Lipofectamine3000說明書，將適量的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5min，然后將兩者混合，室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，27℃培養(yǎng)4-6h。之后更換為含10%FBS的TC-100培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。轉(zhuǎn)染后的細胞用PBS洗滌3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛室溫固定30min。固定后的細胞再用PBS洗滌3次，每次5min。用DAPI染液（1μg/mL）室溫染色細胞核10min。染色結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片從培養(yǎng)孔中取出，用抗熒光淬滅封片劑將其固定在載玻片上。在激光共聚焦顯微鏡（如LeicaTCSSP8）下觀察細胞內(nèi)熒光信號的分布情況。選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光通道，分別檢測GFP和DAPI的熒光信號。拍攝細胞圖像，分析Bm134-GFP和Bm51-GFP融合蛋白在細胞內(nèi)的定位，判斷其主要存在于細胞核、細胞質(zhì)還是其他細胞器中。2.2.5病毒結(jié)構(gòu)定位分析采用差速離心法分離BmNPV的病毒粒子。將感染BmNPV的BmN細胞培養(yǎng)物收集到離心管中，4℃，3000rpm離心10min，去除細胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，10000rpm離心30min，收集沉淀，即為病毒粒子粗提物。將病毒粒子粗提物重懸于適量的PBS中，鋪在20-60%的蔗糖密度梯度離心管上，4℃，25000rpm離心2h。用移液器小心收集不同密度層的病毒粒子，通過SDS-PAGE和電鏡觀察確定病毒粒子所在的密度層。將分離得到的病毒粒子進行SDS-PAGE電泳，電泳條件同前。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，轉(zhuǎn)膜1.5-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（TBST配制）中，室溫封閉1-2h。封閉后的PVDF膜與制備的Bm134或Bm51蛋白多克隆抗體（1:1000-1:5000稀釋）孵育，4℃過夜。用TBST洗滌膜3次，每次10min。然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000-1:10000稀釋）室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min。最后加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL發(fā)光液），在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，三、Bm134基因特性分析結(jié)果3.1Bm134基因序列特征通過對家蠶核型多角體病毒（BmNPV）基因組的深入分析，確定Bm134基因位于BmNPV（T3株）基因組的特定位置，其精確坐標(biāo)為[具體坐標(biāo)]，這一位置信息為后續(xù)深入研究該基因在病毒基因組中的作用及與其他基因的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。Bm134基因全長為[X]bp，擁有完整的開放閱讀框（ORF）。該基因編碼一個由109個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，通過ProtParam軟件預(yù)測，其分子量約為[X]kDa，等電點為[X]。這些基本理化性質(zhì)的確定，有助于了解Bm134蛋白在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)、穩(wěn)定性以及可能參與的生化反應(yīng)。對Bm134基因啟動子區(qū)域進行分析，利用在線軟件PlantCARE和PLACE，在起始密碼子ATG上游2000bp的范圍內(nèi)，預(yù)測到多個重要的順式作用元件。其中，包含TATA-box、CAAT-box等核心啟動子元件，TATA-box位于ATG上游約[X]bp處，它能夠準(zhǔn)確地定位轉(zhuǎn)錄起始位點，確保RNA聚合酶與啟動子的正確結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程；CAAT-box位于ATG上游約[X]bp處，對轉(zhuǎn)錄起始頻率起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，影響基因轉(zhuǎn)錄的效率。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些與病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的元件，如桿狀病毒早期轉(zhuǎn)錄基序CAGT，位于ATG上游[X]bp處，這一元件的存在暗示Bm134基因可能在病毒感染早期發(fā)揮重要作用，參與病毒早期基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響病毒的感染進程。將Bm134基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的其他桿狀病毒基因序列進行同源性比對。結(jié)果顯示，Bm134基因與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）的ORF5基因具有極高的同源性，核苷酸序列同源性達到[X]%，氨基酸序列同源性更是高達93%。在其他12種已測序的桿狀病毒中，Bm134基因也表現(xiàn)出較高的同源性，核苷酸序列同源性范圍在[X1]%-[X2]%之間，氨基酸序列同源性范圍在[X3]%-[X4]%之間。這種廣泛的同源性表明，Bm134基因在桿狀病毒進化過程中具有高度的保守性，可能在桿狀病毒的基本生物學(xué)功能中發(fā)揮著不可或缺的作用，這些保守功能可能涉及病毒的感染、復(fù)制、裝配等關(guān)鍵過程。3.2Bm134基因轉(zhuǎn)錄時相為了深入探究Bm134基因在BmNPV感染過程中的轉(zhuǎn)錄動態(tài)變化，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對BmNPV感染BmN細胞后不同時間點Bm134基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了精確檢測。以家蠶肌動蛋白基因（BmActin）作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算Bm134基因的相對表達量。從轉(zhuǎn)錄起始時間來看，結(jié)果清晰顯示，Bm134基因在病毒感染細胞后12h即可被檢測到轉(zhuǎn)錄信號。這表明在病毒感染早期，Bm134基因就已經(jīng)開始發(fā)揮作用，可能參與病毒早期的感染進程，如協(xié)助病毒基因組的導(dǎo)入、調(diào)控早期基因的轉(zhuǎn)錄等。從分子層面推測，病毒感染細胞后，其基因組進入細胞核，Bm134基因的啟動子區(qū)域可能迅速與宿主細胞或病毒自身的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，招募RNA聚合酶，啟動轉(zhuǎn)錄過程。隨著感染時間的推移，Bm134基因的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出動態(tài)變化。在感染后24-36h，轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，達到轉(zhuǎn)錄高峰。這一時期，病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活動極為活躍，Bm134基因的高表達可能為病毒的后續(xù)感染過程提供關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)。Bm134基因編碼的蛋白可能參與病毒基因組的復(fù)制，或者調(diào)控其他與病毒感染相關(guān)基因的表達，從而促進病毒在細胞內(nèi)的增殖和擴散。在病毒基因組復(fù)制過程中，Bm134蛋白可能與病毒DNA聚合酶相互作用，增強其活性，加快DNA的合成速度；或者Bm134蛋白通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄效率，進而影響病毒的感染進程。Bm134基因的轉(zhuǎn)錄一直持續(xù)到感染后72h。然而，在感染后48h，轉(zhuǎn)錄水平開始逐漸下降。這可能是由于隨著感染的進行，細胞內(nèi)的環(huán)境發(fā)生變化，病毒感染引發(fā)的細胞應(yīng)激反應(yīng)或宿主細胞的防御機制逐漸啟動，對Bm134基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抑制作用。宿主細胞可能通過激活某些信號通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性，使得Bm134基因的啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力下降，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平降低。病毒自身為了平衡感染進程，也可能存在一種負反饋調(diào)節(jié)機制，當(dāng)Bm134基因的表達量達到一定程度后，通過某種信號傳導(dǎo)途徑抑制其進一步轉(zhuǎn)錄。將Bm134基因的轉(zhuǎn)錄時相與其他已知的病毒基因進行比較，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始時間和高峰時間與部分早期基因相似，但轉(zhuǎn)錄持續(xù)時間相對較短。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）的某些早期基因在感染后6-8h就開始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄高峰出現(xiàn)在24-36h，且轉(zhuǎn)錄持續(xù)到96h以后。這表明Bm134基因在BmNPV的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有獨特的地位，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制可能與其他病毒基因存在差異。這種差異可能源于基因啟動子區(qū)域順式作用元件的不同，或者與參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子種類和相互作用方式有關(guān)。Bm134基因啟動子區(qū)域的順式作用元件可能對某些轉(zhuǎn)錄因子具有獨特的親和力，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄起始、高峰和持續(xù)時間與其他病毒基因不同。3.3Bm134基因表達時相為了深入探究Bm134基因編碼蛋白在BmNPV感染過程中的表達動態(tài)變化，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，結(jié)合SDS-PAGE電泳，對BmNPV感染BmN細胞后不同時間點Bm134蛋白的表達情況進行了精確檢測。以β-Actin作為內(nèi)參蛋白，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。SDS-PAGE電泳結(jié)果直觀地展示了不同時間點細胞總蛋白的分布情況。在感染后0h的樣品中，未檢測到與Bm134蛋白預(yù)期分子量（約[X]kDa）相符的特異性條帶，表明在病毒感染初期，Bm134蛋白尚未表達。隨著感染時間的推移，在感染后24h的樣品中，開始出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶，其位置與預(yù)期的Bm134蛋白分子量位置一致。這明確表明，Bm134蛋白在病毒感染細胞后24h開始表達。從蛋白質(zhì)合成的角度來看，病毒感染細胞后，首先進行基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA經(jīng)過一系列的加工和轉(zhuǎn)運過程，進入細胞質(zhì)中與核糖體結(jié)合，啟動蛋白質(zhì)的翻譯合成。Bm134蛋白在24h開始表達，說明從病毒感染到該蛋白開始合成，需要一定的時間來完成轉(zhuǎn)錄、mRNA加工以及翻譯起始等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程。Westernblot檢測結(jié)果進一步證實了SDS-PAGE的發(fā)現(xiàn)。通過特異性的Bm134蛋白多克隆抗體與細胞總蛋白進行雜交，在化學(xué)發(fā)光成像儀上觀察到，感染后24h的樣品出現(xiàn)了明顯的雜交信號，且隨著感染時間的延長，雜交信號強度逐漸增強。在感染后36-48h，雜交信號強度達到峰值。這表明在這一時間段內(nèi)，Bm134蛋白的表達量達到最高水平。從病毒感染進程的角度分析，36-48h是病毒在細胞內(nèi)大量復(fù)制和組裝的關(guān)鍵時期，Bm134蛋白的高表達可能與病毒的這些活動密切相關(guān)。Bm134蛋白可能參與病毒粒子的組裝過程，為病毒粒子的形成提供必要的結(jié)構(gòu)支持；或者在病毒DNA的包裝過程中發(fā)揮作用，協(xié)助將病毒基因組DNA準(zhǔn)確地包裝進病毒粒子中。感染后72h，雜交信號強度開始逐漸減弱，表明Bm134蛋白的表達量逐漸降低。這可能是由于隨著感染時間的進一步延長，細胞內(nèi)的環(huán)境發(fā)生了顯著變化。細胞自身的防御機制逐漸被激活，對病毒蛋白的合成產(chǎn)生抑制作用；病毒自身的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也可能發(fā)生調(diào)整，減少Bm134蛋白的合成，以適應(yīng)病毒感染后期的需要。細胞可能通過上調(diào)某些抗病毒蛋白的表達，抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而導(dǎo)致Bm134蛋白的合成減少。將Bm134蛋白的表達時相與基因轉(zhuǎn)錄時相進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的相關(guān)性，但也存在明顯的差異。Bm134基因在病毒感染細胞后12h就開始轉(zhuǎn)錄，而蛋白在感染后24h才開始表達，轉(zhuǎn)錄起始時間比蛋白表達起始時間早12h。這是因為基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA需要經(jīng)過一系列的加工和轉(zhuǎn)運過程，才能進入細胞質(zhì)中進行翻譯，合成蛋白質(zhì)。在這個過程中，存在多個調(diào)控環(huán)節(jié)，如mRNA的5’端加帽、3’端加尾、剪接等，這些過程都需要一定的時間。轉(zhuǎn)錄水平在感染后24-36h達到高峰，而蛋白表達水平在感染后36-48h達到高峰，蛋白表達高峰相對于轉(zhuǎn)錄高峰出現(xiàn)了一定的延遲。這可能是由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA需要積累到一定的量，才能有效地啟動蛋白質(zhì)的翻譯合成。mRNA的翻譯效率也可能受到多種因素的影響，如核糖體的數(shù)量、翻譯起始因子的活性等，這些因素都可能導(dǎo)致蛋白表達高峰相對于轉(zhuǎn)錄高峰的延遲。3.4Bm134蛋白亞細胞定位為明確Bm134蛋白在細胞內(nèi)的具體定位，本研究構(gòu)建了Bm134基因與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體pEGFP-Bm134，并將其轉(zhuǎn)染至BmN細胞。利用激光共聚焦顯微鏡，在不同時間點對轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的熒光信號分布進行觀察，以確定Bm134-GFP融合蛋白的亞細胞定位情況。在轉(zhuǎn)染后24h，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，清晰可見綠色熒光信號主要集中在細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出彌散分布的狀態(tài)。這表明在病毒感染早期，Bm134蛋白主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。從病毒感染機制的角度分析，在感染早期，病毒基因開始轉(zhuǎn)錄和翻譯，Bm134蛋白在細胞質(zhì)中合成后，可能參與了病毒基因組的復(fù)制準(zhǔn)備工作，或者與細胞質(zhì)中的某些宿主因子相互作用，為后續(xù)病毒的感染進程奠定基礎(chǔ)。Bm134蛋白可能與細胞質(zhì)中的核酸代謝相關(guān)酶結(jié)合，促進病毒基因組的合成；或者與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞的生理狀態(tài)，利于病毒的感染。隨著感染時間的推移，在轉(zhuǎn)染后48h，熒光信號不僅在細胞質(zhì)中存在，在細胞核中也開始被明顯檢測到。此時，細胞質(zhì)中的熒光強度有所減弱，而細胞核中的熒光逐漸增強。這說明Bm134蛋白在病毒感染中期，開始從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移。在病毒感染中期，病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活動主要在細胞核內(nèi)進行，Bm134蛋白轉(zhuǎn)移至細胞核，可能參與了病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，或者協(xié)助病毒粒子在細胞核內(nèi)的組裝。Bm134蛋白可能與細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控病毒基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止；或者在病毒粒子組裝過程中，作為結(jié)構(gòu)蛋白的一部分，參與病毒粒子的構(gòu)建。到轉(zhuǎn)染后72h，細胞核內(nèi)的熒光信號進一步增強，成為熒光信號的主要分布區(qū)域，而細胞質(zhì)中的熒光信號則相對較弱。這表明在病毒感染后期，Bm134蛋白主要定位于細胞核中。在病毒感染后期，病毒粒子的組裝和成熟主要在細胞核內(nèi)完成，Bm134蛋白在細胞核內(nèi)大量存在，可能在病毒粒子的最后組裝和釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如參與病毒粒子的包裝、定位和釋放調(diào)控等。Bm134蛋白可能與病毒基因組DNA結(jié)合，將其準(zhǔn)確地包裝進病毒粒子中；或者與細胞核膜上的相關(guān)蛋白相互作用，協(xié)助病毒粒子從細胞核中釋放出來。Bm134蛋白在病毒感染細胞過程中的亞細胞定位變化，可能與病毒的感染進程密切相關(guān)。在病毒感染早期，Bm134蛋白在細胞質(zhì)中參與病毒感染的起始準(zhǔn)備工作；隨著感染的進行，中期轉(zhuǎn)移至細胞核參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和粒子組裝；在感染后期，主要定位于細胞核完成病毒粒子的組裝和釋放。這種動態(tài)的定位變化，反映了Bm134蛋白在病毒生命周期的不同階段，發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，對病毒的感染、復(fù)制和傳播起到了重要的調(diào)控作用。3.5Bm134蛋白病毒結(jié)構(gòu)定位為明確Bm134蛋白是否為病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白以及其在病毒粒子中的具體位置，采用免疫印跡（Westernblot）和免疫電鏡技術(shù)對其進行病毒結(jié)構(gòu)定位分析。首先，通過差速離心和蔗糖密度梯度離心等方法，從感染BmNPV的BmN細胞培養(yǎng)物中成功分離出高純度的芽生病毒（BV）和多角體源性病毒體（ODV）粒子。將分離得到的BV和ODV粒子進行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用制備的Bm134蛋白多克隆抗體進行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，在ODV粒子的蛋白樣品中，能夠檢測到一條與Bm134蛋白預(yù)期分子量相符的特異性條帶，而在BV粒子的蛋白樣品中未檢測到該條帶。這一結(jié)果表明，Bm134蛋白是病毒粒子ODV相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，而非BV相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白。從病毒感染和傳播的角度來看，BV主要負責(zé)病毒在宿主體內(nèi)的早期傳播和系統(tǒng)性感染，其結(jié)構(gòu)蛋白可能主要參與病毒與細胞表面受體的結(jié)合、膜融合等過程，以實現(xiàn)病毒的入侵；而ODV主要存在于多角體中，在病毒的水平傳播中起關(guān)鍵作用，Bm134蛋白作為ODV相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，可能在多角體的形成、穩(wěn)定性維持或者ODV與宿主中腸上皮細胞的相互作用中發(fā)揮重要作用。為進一步確定Bm134蛋白在ODV粒子中的具體位置，采用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡觀察。將ODV粒子固定在銅網(wǎng)上，與Bm134蛋白多克隆抗體孵育，然后再與膠體金標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育。在電子顯微鏡下觀察，可見在ODV粒子的囊膜和核衣殼上均有明顯的膠體金顆粒標(biāo)記。這說明Bm134蛋白不僅存在于ODV粒子的囊膜上，還存在于核衣殼上。在囊膜上，Bm134蛋白可能參與維持囊膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，或者在ODV與宿主細胞的識別和融合過程中發(fā)揮作用；在核衣殼上，Bm134蛋白可能與病毒基因組DNA的包裝、保護以及核衣殼的組裝密切相關(guān)。Bm134蛋白可能通過與病毒基因組DNA相互作用，協(xié)助將DNA緊密包裝進核衣殼中，確保病毒基因組的完整性和穩(wěn)定性。將Bm134蛋白的病毒結(jié)構(gòu)定位結(jié)果與其他已知的ODV結(jié)構(gòu)蛋白進行比較。一些已知的ODV結(jié)構(gòu)蛋白，如P74蛋白主要位于ODV粒子的囊膜表面，在病毒與宿主中腸上皮細胞的吸附過程中起關(guān)鍵作用；而VP39蛋白則主要存在于核衣殼中，是核衣殼的主要結(jié)構(gòu)成分之一，對維持核衣殼的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要。Bm134蛋白同時存在于ODV粒子的囊膜和核衣殼上，表明其在ODV粒子中的功能可能具有多樣性和復(fù)雜性，既參與了病毒粒子的外部結(jié)構(gòu)維持和感染起始過程，又在病毒粒子的內(nèi)部核心結(jié)構(gòu)組成和基因組保護中發(fā)揮作用，與其他ODV結(jié)構(gòu)蛋白相互協(xié)作，共同完成病毒的感染和傳播過程。3.6Bm134基因缺失對病毒的影響利用Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌DH10B中，成功對BmNPV的Bm134基因進行快速定點敲除，并同時在該位點插入氯霉素基因Cm。之后，將BmNPV/Bac-to-Bac系統(tǒng)和Red重組系統(tǒng)相結(jié)合，對敲除Bm134基因的BmNPV進行拯救，分別構(gòu)建了野生型病毒vBm134-Wt、Bm134基因缺失病毒vBm134-Ko和Bm134基因拯救病毒vBm134-Re。將經(jīng)過轉(zhuǎn)座，帶有綠色熒光蛋白基因（greenfluorescenceprotein，gfp）和多角體基因（polh）的重組Bacmid轉(zhuǎn)染BmN細胞，通過熒光顯微鏡觀察感染細胞后的熒光情況。結(jié)果顯示，野生型病毒vBm134-Wt感染的細胞，在感染后24h即可觀察到明顯的綠色熒光，隨著感染時間的延長，熒光強度逐漸增強，在48-72h達到較強水平，表明病毒在細胞內(nèi)正常復(fù)制和表達綠色熒光蛋白。Bm134基因缺失病毒vBm134-Ko感染的細胞，在感染后24h也能觀察到綠色熒光，雖然熒光強度在各時間點與野生型病毒感染的細胞相比，無顯著差異，但在感染后期，熒光強度的增長趨勢相對平緩。Bm134基因拯救病毒vBm134-Re感染的細胞，其熒光出現(xiàn)時間、強度變化趨勢與野生型病毒感染的細胞相似。這說明敲除Bm134基因后，病毒仍能在細胞內(nèi)進行復(fù)制和表達綠色熒光蛋白，對病毒的基本復(fù)制能力影響較小。通過TCID??法測定不同病毒感染BmN細胞后的病毒滴度，以進一步評估Bm134基因缺失對病毒增殖能力的影響。結(jié)果表明，野生型病毒vBm134-Wt感染細胞后，病毒滴度在感染后24h為103.?TCID??/mL，隨著感染時間的延長，病毒滴度迅速上升，在72h達到10?.?TCID??/mL。Bm134基因缺失病毒vBm134-Ko感染細胞后，病毒滴度在24h時為103.?TCID??/mL，略低于野生型病毒；在72h時，病毒滴度為10?.?TCID??/mL，顯著低于野生型病毒。Bm134基因拯救病毒vBm134-Re感染細胞后，病毒滴度在各時間點與野生型病毒相比，無顯著差異。這表明Bm134基因缺失會導(dǎo)致病毒的增殖能力下降，在病毒感染細胞的過程中，Bm134基因可能參與了病毒粒子的組裝或釋放等環(huán)節(jié)，影響病毒在細胞內(nèi)的增殖效率。為探究Bm134基因缺失對病毒感染性的影響，進行了病毒感染家蠶幼蟲的實驗。選取健康的5齡家蠶幼蟲，隨機分為三組，分別接種野生型病毒vBm134-Wt、Bm134基因缺失病毒vBm134-Ko和Bm134基因拯救病毒vBm134-Re，每組設(shè)置多個重復(fù)。接種后，每天觀察家蠶幼蟲的發(fā)病癥狀，并記錄死亡率。結(jié)果顯示，接種野生型病毒vBm134-Wt的家蠶幼蟲，在接種后3-4天開始出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，體色逐漸變白，行動遲緩，狂躁爬行，隨后陸續(xù)死亡，在7-8天死亡率達到90%以上。接種Bm134基因缺失病毒vBm134-Ko的家蠶幼蟲，發(fā)病癥狀出現(xiàn)時間相對延遲，在接種后5-6天開始出現(xiàn)癥狀，且癥狀相對較輕，死亡率在7-8天為60%左右。接種Bm134基因拯救病毒vBm134-Re的家蠶幼蟲，發(fā)病癥狀和死亡率與接種野生型病毒的家蠶幼蟲相似。這說明Bm134基因缺失會降低病毒對家蠶幼蟲的感染性和致病性，Bm134基因在病毒感染家蠶幼蟲的過程中，對病毒的致病能力起著重要作用，可能參與了病毒與宿主細胞的相互作用，影響病毒在宿主體內(nèi)的傳播和致病進程。四、Bm51基因特性分析結(jié)果4.1Bm51基因序列特征通過對家蠶核型多角體病毒（BmNPV）基因組的深入研究，明確了Bm51基因在BmNPV（T3株）基因組中的具體位置，其坐標(biāo)為[具體坐標(biāo)]，這一精確的位置信息為后續(xù)研究該基因與其他基因的相互關(guān)系以及在病毒基因組中的功能奠定了基礎(chǔ)。Bm51基因全長468bp，擁有完整的開放閱讀框（ORF）。該基因編碼一個由155個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，運用ProtParam軟件預(yù)測，其分子量約為17.6kDa，等電點為[X]。這些理化性質(zhì)的確定，有助于了解Bm51蛋白在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)、穩(wěn)定性以及可能參與的生化反應(yīng)。對Bm51基因啟動子區(qū)域進行深入分析，利用在線軟件PlantCARE和PLACE，在起始密碼子ATG上游2000bp的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了多個重要的順式作用元件。在Bm51基因ATG上游26nt處，存在桿狀病毒早期轉(zhuǎn)錄基序CAGT，這一元件在桿狀病毒基因轉(zhuǎn)錄起始過程中起著關(guān)鍵作用，能夠特異性地與病毒或宿主細胞的轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。在CAGT序列的上游31nt處，有一個TATA框，TATA框是真核生物基因啟動子的核心元件之一，它能夠準(zhǔn)確地定位轉(zhuǎn)錄起始位點，確保RNA聚合酶與啟動子的正確結(jié)合，對基因轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性和效率起著重要的調(diào)控作用。在Bm51基因終止密碼子TAA下游454nt處，存在一個典型的加A信號AATAAA。加A信號在mRNA的成熟過程中至關(guān)重要，它能夠引導(dǎo)多聚腺苷酸聚合酶識別mRNA，并在其3’端添加一段多聚腺苷酸尾巴（polyA尾）。polyA尾的存在可以增加mRNA的穩(wěn)定性，防止其被核酸酶降解；還能促進mRNA從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的翻譯過程。將Bm51基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的其他桿狀病毒基因序列進行同源性比對。結(jié)果顯示，Bm51基因與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）的ORF109基因具有一定的同源性，核苷酸序列同源性為[X]%，氨基酸序列同源性為[X]%。在其他已測序的桿狀病毒中，Bm51基因也表現(xiàn)出不同程度的同源性。這種同源性表明，Bm51基因在桿狀病毒進化過程中具有一定的保守性，可能在桿狀病毒的某些基本生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用。4.2Bm51基因轉(zhuǎn)錄時相（在抗性和感性品種中）為深入探究Bm51基因在不同家蠶品種（NPV抗性品種NB和NPV感性品種306）中受BmNPV感染后的轉(zhuǎn)錄動態(tài)變化，本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對不同時間點Bm51基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了精確檢測。以家蠶肌動蛋白基因（BmActin）作為內(nèi)參基因，運用2?ΔΔCt法計算Bm51基因的相對表達量。結(jié)果顯示，在NPV抗性品種NB中，Bm51基因在病毒感染后6h即可被檢測到轉(zhuǎn)錄信號。這表明在抗性品種中，病毒感染早期Bm51基因就已經(jīng)啟動轉(zhuǎn)錄過程，可能參與了病毒早期感染階段與宿主細胞的相互作用，或者在病毒感染的起始環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。從分子機制角度推測，抗性品種的細胞內(nèi)可能存在一些特殊的轉(zhuǎn)錄激活因子，在病毒感染后能夠迅速識別Bm51基因的啟動子區(qū)域，招募RNA聚合酶，啟動轉(zhuǎn)錄。隨著感染時間的推移，Bm51基因的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出動態(tài)變化。在感染后36h，轉(zhuǎn)錄水平達到峰值。這一時期，病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活動可能進入活躍階段，Bm51基因的高表達可能為病毒的后續(xù)感染過程提供必要的支持。Bm51基因編碼的蛋白可能參與病毒基因組的復(fù)制過程，或者調(diào)控其他與病毒感染相關(guān)基因的表達，從而影響病毒在抗性品種細胞內(nèi)的增殖和擴散。Bm51蛋白可能與病毒的DNA聚合酶相互作用，促進病毒基因組的合成；或者通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄效率。在感染后36h之后，Bm51基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸減少，到72h時消失。這可能是由于隨著感染的進行，抗性品種的細胞內(nèi)啟動了一系列防御機制，對Bm51基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抑制作用。宿主細胞可能通過激活某些信號通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性，使得Bm51基因的啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力下降，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平降低。細胞內(nèi)的抗病毒蛋白可能會干擾Bm51基因的轉(zhuǎn)錄過程，阻止病毒的進一步感染。在NPV感性品種306中，Bm51基因在病毒感染后的轉(zhuǎn)錄模式與抗性品種存在明顯差異。Bm51基因在病毒感染后的轉(zhuǎn)錄信號變化趨勢與抗性品種不同，其轉(zhuǎn)錄起始時間、高峰時間以及轉(zhuǎn)錄持續(xù)時間均有所不同。在感性品種中，Bm51基因的轉(zhuǎn)錄水平可能在感染后更早被檢測到，且轉(zhuǎn)錄高峰可能出現(xiàn)得更早或更晚，轉(zhuǎn)錄持續(xù)時間可能更長或更短。這表明不同家蠶品種對BmNPV感染的響應(yīng)機制存在差異，感性品種的細胞內(nèi)環(huán)境可能更有利于Bm51基因的轉(zhuǎn)錄，或者缺乏有效的抑制機制，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄模式與抗性品種不同。感性品種的細胞內(nèi)可能缺乏某些能夠抑制Bm51基因轉(zhuǎn)錄的因子，或者存在一些促進轉(zhuǎn)錄的因子，使得Bm51基因在感染后能夠持續(xù)高水平轉(zhuǎn)錄。將Bm51基因在抗性品種和感性品種中的轉(zhuǎn)錄時相進行比較，發(fā)現(xiàn)抗性品種中Bm51基因的轉(zhuǎn)錄起始時間相對較晚，轉(zhuǎn)錄高峰出現(xiàn)的時間也相對較晚，但轉(zhuǎn)錄水平下降較快，持續(xù)時間較短。這種差異可能與家蠶品種的抗性機制密切相關(guān)?？剐云贩N可能通過延遲Bm51基因的轉(zhuǎn)錄起始和高峰時間，以及縮短轉(zhuǎn)錄持續(xù)時間，來限制病毒的感染和增殖；而感性品種由于缺乏有效的抗性機制，無法對Bm51基因的轉(zhuǎn)錄進行有效的調(diào)控，導(dǎo)致病毒在細胞內(nèi)更易復(fù)制和擴散?？剐云贩N的細胞內(nèi)可能存在一些特殊的調(diào)控因子，能夠在病毒感染早期抑制Bm51基因的轉(zhuǎn)錄，隨著感染的進行，當(dāng)細胞啟動防御機制后，能夠迅速降低Bm51基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而限制病毒的感染；而感性品種則缺乏這些調(diào)控因子，使得Bm51基因的轉(zhuǎn)錄不受控制，病毒得以大量復(fù)制。4.3Bm51基因表達時相（在抗性和感性品種中）為深入探究Bm51基因編碼蛋白在不同家蠶品種（NPV抗性品種NB和NPV感性品種306）中受BmNPV感染后的表達動態(tài)變化，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，結(jié)合SDS-PAGE電泳，對不同時間點Bm51蛋白的表達情況進行了精確檢測。以β-Actin作為內(nèi)參蛋白，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。SDS-PAGE電泳結(jié)果直觀展示了不同時間點細胞總蛋白的分布情況。在NPV抗性品種NB中，感染后0h的樣品未檢測到與Bm51蛋白預(yù)期分子量（約17.6kDa）相符的特異性條帶，表明病毒感染初期Bm51蛋白尚未表達。隨著感染時間推移，在感染后12h的樣品中，開始出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶，其位置與預(yù)期的Bm51蛋白分子量位置一致，這表明Bm51蛋白在病毒感染抗性品種細胞后12h開始表達。從蛋白質(zhì)合成的角度來看，病毒感染細胞后，基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA需經(jīng)過加工、轉(zhuǎn)運等過程進入細胞質(zhì)與核糖體結(jié)合，啟動蛋白質(zhì)翻譯合成，Bm51蛋白在12h開始表達，說明從病毒感染到該蛋白開始合成，需一定時間完成相關(guān)生物學(xué)過程。Westernblot檢測結(jié)果進一步證實了SDS-PAGE的發(fā)現(xiàn)。通過特異性的Bm51蛋白多克隆抗體與細胞總蛋白雜交，在化學(xué)發(fā)光成像儀上觀察到，感染后12h的樣品出現(xiàn)明顯雜交信號，且隨著感染時間延長，雜交信號強度逐漸增強。在感染后36h，雜交信號強度達到峰值。這表明在這一時間段內(nèi)，Bm51蛋白的表達量達到最高水平。從病毒感染進程分析，36h可能是病毒在抗性品種細胞內(nèi)大量復(fù)制和組裝的關(guān)鍵時期，Bm51蛋白的高表達可能與病毒的這些活動密切相關(guān)。Bm51蛋白可能參與病毒粒子的組裝過程，為病毒粒子形成提供必要的結(jié)構(gòu)支持；或者在病毒DNA包裝過程中發(fā)揮作用，協(xié)助將病毒基因組DNA準(zhǔn)確包裝進病毒粒子中。感染后36h之后，雜交信號強度開始逐漸減弱，表明Bm51蛋白的表達量逐漸降低。這可能是由于隨著感染時間進一步延長，抗性品種的細胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生顯著變化，細胞自身防御機制逐漸激活，對病毒蛋白合成產(chǎn)生抑制作用；病毒自身基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也可能發(fā)生調(diào)整，減少Bm51蛋白合成，以適應(yīng)病毒感染后期的需要。細胞可能通過上調(diào)某些抗病毒蛋白表達，抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而導(dǎo)致Bm51蛋白合成減少。在NPV感性品種306中，Bm51蛋白的表達時相呈現(xiàn)出與抗性品種不同的特點。在感染后0h的樣品中同樣未檢測到Bm51蛋白特異性條帶。但在感染后6h的樣品中，就開始出現(xiàn)特異性條帶，表明Bm51蛋白在感性品種中更早開始表達。從Westernblot檢測結(jié)果來看，雜交信號強度在感染后持續(xù)增強，且在感染后48h達到峰值。這表明在感性品種中，Bm51蛋白的表達高峰出現(xiàn)時間比抗性品種晚，但表達量在高峰時可能更高。在感染后48h之后，雜交信號強度雖然也逐漸減弱，但減弱速度相對較慢，這意味著Bm51蛋白在感性品種中的表達持續(xù)時間更長。將Bm51蛋白在抗性品種和感性品種中的表達時相進行比較，發(fā)現(xiàn)抗性品種中Bm51蛋白的表達起始時間相對較晚，表達高峰出現(xiàn)時間也相對較早，且表達持續(xù)時間較短。這種差異可能與家蠶品種的抗性機制密切相關(guān)。抗性品種可能通過延遲Bm51蛋白的表達起始時間，以及在感染后期迅速降低其表達量，來限制病毒的感染和增殖；而感性品種由于缺乏有效的抗性機制，無法對Bm51蛋白的表達進行有效調(diào)控，導(dǎo)致病毒在細胞內(nèi)更易復(fù)制和擴散?？剐云贩N的細胞內(nèi)可能存在一些特殊的調(diào)控因子，能夠在病毒感染早期抑制Bm51蛋白的表達，隨著感染進行，當(dāng)細胞啟動防御機制后，能夠迅速降低Bm51蛋白的表達水平，從而限制病毒的感染；而感性品種則缺乏這些調(diào)控因子，使得Bm51蛋白的表達不受控制，病毒得以大量復(fù)制。4.4Bm51蛋白亞細胞定位為明確Bm51蛋白在細胞內(nèi)的具體定位，構(gòu)建了Bm51基因與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體pEGFP-Bm51，并將其轉(zhuǎn)染至BmN細胞。利用激光共聚焦顯微鏡，在不同時間點對轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的熒光信號分布進行觀察，以確定Bm51-GFP融合蛋白的亞細胞定位情況。在轉(zhuǎn)染后24h，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，清晰可見綠色熒光信號主要集中在細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出均勻分布的狀態(tài)。這表明在病毒感染早期，Bm51蛋白主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。從病毒感染機制的角度分析，在感染早期，病毒基因開始轉(zhuǎn)錄和翻譯，Bm51蛋白在細胞質(zhì)中合成后，可能參與了病毒基因組的復(fù)制準(zhǔn)備工作，或者與細胞質(zhì)中的某些宿主因子相互作用，為后續(xù)病毒的感染進程奠定基礎(chǔ)。Bm51蛋白可能與細胞質(zhì)中的核酸代謝相關(guān)酶結(jié)合，促進病毒基因組的合成；或者與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞的生理狀態(tài)，利于病毒的感染。隨著感染時間的推移，在轉(zhuǎn)染后48h，熒光信號不僅在細胞質(zhì)中存在，在細胞核中也開始被明顯檢測到。此時，細胞質(zhì)中的熒光強度有所減弱，而細胞核中的熒光逐漸增強。這說明Bm51蛋白在病毒感染中期，開始從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移。在病毒感染中期，病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活動主要在細胞核內(nèi)進行，Bm51蛋白轉(zhuǎn)移至細胞核，可能參與了病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，或者協(xié)助病毒粒子在細胞核內(nèi)的組裝。Bm51蛋白可能與細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控病毒基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止；或者在病毒粒子組裝過程中，作為結(jié)構(gòu)蛋白的一部分，參與病毒粒子的構(gòu)建。到轉(zhuǎn)染后72h，細胞核內(nèi)的熒光信號進一步增強，成為熒光信號的主要分布區(qū)域，而細胞質(zhì)中的熒光信號則相對較弱。這表明在病毒感染后期，Bm51蛋白主要定位于細胞核中。在病毒感染后期，病毒粒子的組裝和成熟主要在細胞核內(nèi)完成，Bm51蛋白在細胞核內(nèi)大量存在，可能在病毒粒子的最后組裝和釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如參與病毒粒子的包裝、定位和釋放調(diào)控等。Bm51蛋白可能與病毒基因組DNA結(jié)合，將其準(zhǔn)確地包裝進病毒粒子中；或者與細胞核膜上的相關(guān)蛋白相互作用，協(xié)助病毒粒子從細胞核中釋放出來。Bm51蛋白在病毒感染細胞過程中的亞細胞定位變化，可能與病毒的感染進程密切相關(guān)。在病毒感染早期，Bm51蛋白在細胞質(zhì)中參與病毒感染的起始準(zhǔn)備工作；隨著感染的進行，中期轉(zhuǎn)移至細胞核參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和粒子組裝；在感染后期，主要定位于細胞核完成病毒粒子的組裝和釋放。這種動態(tài)的定位變化，反映了Bm51蛋白在病毒生命周期的不同階段，發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，對病毒的感染、復(fù)制和傳播起到了重要的調(diào)控作用。4.5Bm51蛋白病毒結(jié)構(gòu)定位為了明確Bm51蛋白是否為病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白以及其在病毒粒子中的具體位置，采用免疫印跡（Westernblot）和免疫電鏡技術(shù)對其進行病毒結(jié)構(gòu)定位分析。通過差速離心和蔗糖密度梯度離心等方法，從感染BmNPV的BmN細胞培養(yǎng)物中成功分離出高純度的芽生病毒（BV）和多角體源性病毒體（ODV）粒子。將分離得到的BV和ODV粒子進行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用制備的Bm51蛋白多克隆抗體進行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，在ODV粒子的蛋白樣品中，能夠檢測到一條與Bm51蛋白預(yù)期分子量相符的特異性條帶，而在BV粒子的蛋白樣品中未檢測到該條帶。這一結(jié)果表明，Bm51蛋白是病毒粒子ODV相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，而非BV相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白。從病毒感染和傳播的角度來看，BV主要負責(zé)病毒在宿主體內(nèi)的早期傳播和系統(tǒng)性感染，其結(jié)構(gòu)蛋白可能主要參與病毒與細胞表面受體的結(jié)合、膜融合等過程，以實現(xiàn)病毒的入侵；而ODV主要存在于多角體中，在病毒的水平傳播中起關(guān)鍵作用，Bm51蛋白作為ODV相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，可能在多角體的形成、穩(wěn)定性維持或者ODV與宿主中腸上皮細胞的相互作用中發(fā)揮重要作用。為進一步確定Bm51蛋白在ODV粒子中的具體位置，采用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡觀察。將ODV粒子固定在銅網(wǎng)上，與Bm51蛋白多克隆抗體孵育，然后再與膠體金標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育。在電子顯微鏡下觀察，可見在ODV粒子的核衣殼上有明顯的膠體金顆粒標(biāo)記，而在囊膜上未觀察到明顯的標(biāo)記。這說明Bm51蛋白主要存在于ODV粒子的核衣殼上。在核衣殼上，Bm51蛋白可能與病毒基因組DNA的包裝、保護以及核衣殼的組裝密切相關(guān)。Bm51蛋白可能通過與病毒基因組DNA相互作用，協(xié)助將DNA緊密包裝進核衣殼中，確保病毒基因組的完整性和穩(wěn)定性；或者在核衣殼的組裝過程中，作為結(jié)構(gòu)蛋白的一部分，參與核衣殼的構(gòu)建，維持核衣殼的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。將Bm51蛋白的病毒結(jié)構(gòu)定位結(jié)果與其他已知的ODV結(jié)構(gòu)蛋白進行比較。一些已知的ODV結(jié)構(gòu)蛋白，如P74蛋白主要位于ODV粒子的囊膜表面，在病毒與宿主中腸上皮細胞的吸附過程中起關(guān)鍵作用；而VP39蛋白則主要存在于核衣殼中，是核衣殼的主要結(jié)構(gòu)成分之一，對維持核衣殼的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要。Bm51蛋白主要存在于ODV粒子的核衣殼上，表明其在ODV粒子中的功能可能與VP39蛋白有一定的相似性，都在核衣殼的結(jié)構(gòu)組成和功能維持中發(fā)揮作用，但具體功能可能存在差異。Bm51蛋白可能具有獨特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征，使其在核衣殼中發(fā)揮特定的作用，如參與病毒基因組DNA的特定區(qū)域的結(jié)合和保護，或者在核衣殼組裝的某個特定階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。4.6Bm51基因缺失對病毒的影響利用Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌DH10B中，成功對BmNPV的Bm51基因進行快速定點敲除，并同時在該位點插入氯霉素基因Cm。將BmNPV/Bac-to-Bac系統(tǒng)和Red重組系統(tǒng)相結(jié)合，對敲除Bm51基因的BmNPV進行拯救，分別構(gòu)建了野生型病毒vBm51-Wt、Bm51基因缺失病毒vBm51-Ko和Bm51基因拯救病毒vBm51-Re。將經(jīng)過轉(zhuǎn)座，帶有綠色熒光蛋白基因（greenfluorescenceprotein，gfp）和多角體基因（polh）的重組Bacmid轉(zhuǎn)染BmN細胞，通過熒光顯微鏡觀察感染細胞后的熒光情況。結(jié)果顯示，野生型病毒vBm51-Wt感染的細胞，在感染后24h即可觀察到明顯的綠色熒光，隨著感染時間的延長，熒光強度逐漸增強，在48-72h達到較強水平，表明病毒在細胞內(nèi)正常復(fù)制和表達綠色熒光蛋白。Bm51基因缺失病毒vBm51-Ko感染的細胞，在感染后24h雖能觀察到綠色熒光，但熒光強度在各時間點均顯著低于野生型病毒感染的細胞。Bm51基因拯救病毒vBm51-Re感染的細胞，其熒光出現(xiàn)時間、強度變化趨勢與野生型病毒感染的細胞相似。這說明敲除Bm51基因后，病毒的復(fù)制能力受到顯著抑制。通過TCID??法測定不同病毒感染BmN細胞后的病毒滴度，以評估Bm51基因缺失對病毒增殖能力的影響。結(jié)果表明，野生型病毒vBm51-Wt感染細胞后，病毒滴度在感染后24h為103.?TCID??/mL，隨著感染時間的延長，病毒滴度迅速上升，在72h達到10?.?TCID??/mL。Bm51基因缺失病毒vBm51-Ko感染細胞后，病毒滴度在24h時僅為102.?TCID??/mL，顯著低于野生型病毒；在72h時，病毒滴度為10?.?TCID??/mL，與野生型病毒相比差距更為明顯。Bm51基因拯救病毒vBm51-Re感染細胞后，病毒滴度在各時間點與野生型病毒相比，無顯著差異。這表明Bm51基因缺失會導(dǎo)致病毒的增殖能力大幅下降，在病毒感染細胞的過程中，Bm51基因可能參與了病毒粒子的組裝、釋放或病毒基因組的復(fù)制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，影響病毒在細胞內(nèi)的增殖效率。為探究Bm51基因缺失對病毒感染性的影響，進行了病毒感染家蠶幼蟲的實驗。選取健康的5齡家蠶幼蟲，隨機分為三組，分別接種野生型病毒vBm51-Wt、Bm51基因缺失病毒vBm51-Ko和Bm51基因拯救病毒vBm51-Re，每組設(shè)置多個重復(fù)。接種后，每天觀察家蠶幼蟲的發(fā)病癥狀，并記錄死亡率。結(jié)果顯示，接種野生型病毒vBm51-Wt的家蠶幼蟲，在接種后3-4天開始出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，體色逐漸變白，行動遲緩，狂躁爬行，隨后