流式細胞術原理及實驗方案設計BD

bioscience

Judyy_Review?

流式基本概念?

流式細胞儀的結構?

流式細胞儀的工作原理流式的檢測信號流式的對照設置數(shù)據(jù)存儲與分析?

如何計劃一個流式實驗流式基本概念流式細胞術（Flow

Cytometry,

簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個細胞的多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術，同時可以對特定群體加以分選。流式細胞儀（Flow

Cytometer）集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。流式細胞術流式細胞術的特點檢測速度快，分析樣本量大

在極短時間內(nèi)可分析大量細胞，這是流式不同于其他細胞分析儀器的主要特點，可以每秒鐘上萬個細胞的速率進行測量?？赏瑫r分析單個細胞的多種特征

使用不同熒光素標記的單克隆抗體或熒光染料對細胞進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，可獲得單細胞的多種信息。流式細胞術檢測樣本可檢測的樣本種類多樣各種細胞（如外，骨髓，細針穿刺，灌洗液，實體組織，懸浮或貼壁培養(yǎng)的細胞），微生物，人工合成微球。樣本制備單細胞懸液（天然，機械研磨/消化），5×105

～1×107cells/ml，約0.5

ml，300目篩網(wǎng)過濾。流式細胞儀的檢測范圍

細胞結構?

細胞大小?

細胞顆粒度?

細胞表面積?

核漿比例?

DNA含量與細胞周

期?

RNA含量?

蛋白質含量?

……?????????細胞功能

細胞表面/胞漿/核的特異性抗原

細胞活性

細胞內(nèi)/外的細胞因子

激素結合位點、細胞受體

蛋白磷酸化

pH值

鈣離子濃度

細胞膜電位、線粒體膜電位

……在上述信息基礎上的細胞分選流式細胞儀的結構液流系統(tǒng)聚焦細胞以供檢測光學系統(tǒng)激發(fā)和收集光信號電子系統(tǒng)將光信號轉化為某著名企業(yè)號，并使其數(shù)字化以供分析流式細胞儀的結構1.液流系統(tǒng)

液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處?

流動室?

液流驅動系統(tǒng)Injector

TipSheath

fluid

Fluorescence

signals

Focused

laser

beam鞘液作用1.

避免堵塞噴孔2.

約束樣本位于噴嘴中心、提高測量精度3.

保持細胞活性流動室對靈敏度要求不是很苛刻的實驗，可調高樣本進樣速率，從而提高采樣分析速度。2.光學系統(tǒng)激發(fā)光學系統(tǒng)–

激光器（C6：488nm

&

640nm）–

透鏡和反射鏡接收光學系統(tǒng)–

濾光片如何將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光波長范圍。460500540460500540460500540SP

500LP

500BP500/50ShortpassBandpassLongpassVoltageVoltageVoltage3.電子系統(tǒng)LaserLaserLaserTimeTimeTime-將模擬信號轉化為數(shù)字信號-計算每個脈沖峰的高度，寬度和面積-和計算機連接以傳出數(shù)據(jù)Review流式細胞儀的工作原理1-1.散射光信號前向角散射光（FSC）FALS

SensorLaser當細胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。FSC一般表征細胞相對大小及其表面積。側向角散射光（SSC）FALS

Sensor90LS

SensorLaser與激光束垂直的稱為側向角散射光信號（SSC）。SSC一般表征細胞粒度及細胞內(nèi)相對復雜性。散射光信號

Right

Angle

Light

Detector

Cellplexity

SSCForward

Light

Detector

Cell

Surface

Area

FSCIncident

Light

Source前向角散射光（FSC,

Forward

Scatter）

細胞相對大小及其表面積側向角散射光（SSC,

Side

Scatter）

細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性散射光信號，散點圖（Dot

Plot）使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量1-2.熒光信號熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜激發(fā)光譜（Excitation，Ex）-

是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。-

我們一般標注的是吸收波峰，也就是最大吸收波長：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）-

是指熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。所有熒光都是寬譜發(fā)射。-

一般標注的是發(fā)射波峰，即最大發(fā)射波長：Em-Max熒光素的使用-

選擇正確的激光器（488nm&640nm。。。）-

確定所需探測器（PMT）400

nmWavelengthFITC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料FITC可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：525nm，可以用530/30接收通道來接受熒光信號。

Excitation

Emission300

nm400

nm500

nm

500

nm600

nm600

nm700

nm

700

nm500

nm600

nm700

nmExcitationEmission300

nm

400

nm400

nm500

nm600

nm700

nmPI的激發(fā)與發(fā)射光譜

常用染料PI同樣可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：625nm，

所以配用不同的585/42接收通道Excitation

Emission300

nm400

nm500

nm600

nm700

nmAPC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料APC可被640nm激光激發(fā)，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道。2-1.流式對照設置?

陰性對照

–

空白對照

?

自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的

熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。一般說來，細胞成分中能

產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細胞色素等）的含量越高，

自發(fā)熒光越強，如腫瘤細胞、粒細胞等；樣本死細胞比例越

高自發(fā)熒光越強–

實驗樣本

?

特異熒光，即抗體F(ab’)2段與細胞抗原特異結合上的熒光

染料受光照發(fā)出的熒光

?

非特異熒光，即抗體Fc段與細胞表面的Fc受體非特異結合上

的熒光染料受光照發(fā)出的熒光

?

自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光–

同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）合適？?

同型對照（Isotype

Control）

：–

與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同，

F(ab’)2段不同）–

與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來–

用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色–

例如，標記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標記PE

的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應用相同濃度

和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（γ1）和IgG2a（

γ2a

），并分別標記FITC和PE同型對照—PE滲漏到FITC通道的信號

FL1-x%FL2—FITC滲漏到PE通道的信號

FL2-x%FL1補償對照熒光補償pensation）是指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectral

overlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號補償調節(jié)在雙色染色的實驗中（1）先用陰性管調電壓

陰性管：細胞加上IgG1

FITC,IgG1

PE（2）再用單染管調補償

單染管：細胞+抗體A

FITC

or

抗體B

PE分析類型管功能加入的抗體雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2pensation1A-FITCγ2a-PE3pensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫Mouse血清純化而來1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PE?

補償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時）–

熒光補償pensation）–

使用單種熒光素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應的同型對照抗體分別進行染色※幾色分析需要制備幾個補償對照管熒光染色對照的設置2-2.條件調節(jié)電壓

-

尋找目標細胞群,根據(jù)陰性對照管來調節(jié)-

信號放大方式：log、linear閾值

-

閾值以下的信號不存儲，減少背景信號補償

-

減去干擾信號，根據(jù)單染對照管來調節(jié)樣本收集及處理流式細胞術操作流程免疫熒光染色上機檢測數(shù)據(jù)分析制備單細胞懸液數(shù)據(jù)的存儲與分析數(shù)據(jù)存儲

常以列表模式（LIST

MODE)：將每個細胞的每

個檢測參量依次排列順序存儲

FITC/PE雙染樣本FSC

SSCFL1

FL2Event

13060638

840Event

2100

16024585Event

3300

650160

720數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點圖（Dot

Plot）等高線圖（Contour

Plot）密度圖（Density）三維圖（3D

Plot）等直方圖(Distribution

Histogram)–

橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度，可以是線性或對數(shù)坐標。–

縱坐標一般是相對細胞數(shù)。散點圖(Dot

Plot)–

X坐標為該細胞一參數(shù)相對含量，Y坐標為該細胞另一參數(shù)的含量，可以將細胞亞群分開。等高線圖和密度圖Review電壓閾值補償獲得數(shù)據(jù)畫圖設門統(tǒng)計如何計劃一個流式實驗一個典型流式實驗的設計Nature

Rev

Immunol.

;

2012(3):

191–200.計劃流式實驗~~1，首先，了解目標抗原1）細胞表面抗原2）細胞內(nèi)或是核內(nèi)抗原（固定、透膜步驟）3）以上兩者兼?zhèn)?。先標記表面抗原，固定后，破膜標記胞?nèi)抗原。4）細胞內(nèi)細胞因子的測定。使用細胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑，如monensin、BFA，使得細胞因子不能分泌到細胞外。（活化、固定、透膜）2，了解熒光染料及其工作原理，做出準確的選擇。熒光染料的選擇1.

儀器配置：有哪些激光器與接收通道2.

多色實驗中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—

如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補償不好調。如何正確選擇與使用熒光染料1.

儀器配置：有哪些激光器與接收通道2.

多色實驗中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—

如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補償不好調。3.盡量選擇應用廣、亮度高的熒光素—

熒光素的強弱用Stain

Index染色指數(shù)來表示，數(shù)值越大，信噪比越高。4.多色實驗中，亮度高的熒光素搭配表達量低的目標抗原（強弱搭配）—

例如，PE，

APC這類大分子蛋白相對亮度高。如何正確選擇與使用熒光染料3.

盡量選擇應用廣、亮度高的熒光素—

熒光素的強弱用Stain

Index染色指數(shù)來表示，數(shù)值越大，信噪比越高。4.

多色實驗中，亮度高的熒光素搭配表達量低的目標抗原—

例如，PE，

APC這類大分子蛋白相對亮度高。5.

避免使用串聯(lián)染料，不穩(wěn)定，可能發(fā)生降解。如何正確選擇與使用熒光染料常用的熒光素組合49

The

importance

ofThe

staining

patterns

of

twomercially

available

clones

of

human

CD38-specificantibody

are

very

different,

despite

the

fact

that

both

antibodies

we