2025年高頻純化崗位面試題及答案請簡要說明高效液相色譜（HPLC）與快速蛋白液相色譜（FPLC）在純化應用中的核心差異，以及選擇FPLC時通常需要重點關(guān)注的參數(shù)。HPLC與FPLC的核心差異體現(xiàn)在應用場景、壓力范圍和目標分子特性三方面。HPLC通常使用高壓（>100bar）驅(qū)動流動相，適用于小分子（如藥物中間體、多肽）的高分辨率分離，其填料粒徑?。?-5μm），柱效高但對大分子（如蛋白質(zhì)、抗體）易造成剪切損傷。FPLC（現(xiàn)多稱AKTA系統(tǒng)）工作壓力較低（<50bar），采用大粒徑（10-30μm）軟膠或剛性填料，專為生物大分子設(shè)計，可保持蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定。選擇FPLC時需重點關(guān)注：1.泵的流量精度（生物大分子純化通常在0.1-10mL/min范圍，需±1%以內(nèi)的流量誤差）；2.檢測器靈敏度（UV檢測波長需覆蓋280nm/260nm雙波長，基線噪聲應<±0.001AU）；3.系統(tǒng)兼容性（是否支持多模式色譜柱切換，如親和、離子交換、疏水相互作用色譜的在線聯(lián)用）；4.自動化功能（梯度洗脫程序的編程靈活性，是否支持無人值守運行）。若在抗體純化過程中，ProteinA親和層析后洗脫峰出現(xiàn)拖尾，且目標蛋白回收率僅65%（正常應>85%），請列出可能的原因及排查步驟?？赡茉蚣芭挪椴襟E如下：1.填料性能下降：ProteinA填料長期使用后配基脫落或污染，導致結(jié)合容量降低。需檢查填料使用次數(shù)（常規(guī)ProteinA填料壽命約100-200次），通過空白運行（僅緩沖液過柱）觀察柱壓是否異常升高（正常<0.5MPa），或取少量填料進行結(jié)合容量測試（如用已知濃度的抗體溶液上樣，檢測未結(jié)合部分的濃度計算結(jié)合量）。2.上樣條件不當：上樣緩沖液pH或離子強度偏離最佳范圍（通常pH7.0-8.0，電導率<10mS/cm），導致抗體與ProteinA結(jié)合不充分。需復測上樣液pH（誤差應<0.1）和電導率（誤差<0.5mS/cm），并與工藝驗證時的條件對比。3.洗脫條件不合適：洗脫液pH過低（如<2.5）可能導致抗體部分變性，在柱內(nèi)聚集；或洗脫時間不足（接觸時間<3min）導致洗脫不徹底。需檢查洗脫液pH（推薦pH2.8-3.2），并通過分段收集洗脫液（每1CV收集1管）分析蛋白濃度分布，確認洗脫峰是否完全洗脫。4.柱床裝填問題：層析柱裝填不勻（如存在溝流或塌陷）導致流動相分布不均?？赏ㄟ^柱效測試（如用丙酮作為示蹤劑測理論塔板數(shù)，正常應>2000/m）判斷，若塔板數(shù)下降>30%需重新裝柱。5.樣品預處理不足：樣品中存在顆粒雜質(zhì)（如細胞碎片）堵塞填料孔道，影響傳質(zhì)。需檢查上樣前的澄清步驟（如離心轉(zhuǎn)速是否≥8000g，或深層過濾膜孔徑是否≤0.45μm），并通過顯微鏡觀察樣品是否有可見顆粒。連續(xù)色譜技術(shù)（如多柱捕獲系統(tǒng)MCS）相較于傳統(tǒng)批次色譜，在單抗純化中具有哪些優(yōu)勢？實際應用時需重點控制哪些參數(shù)以保證工藝穩(wěn)定性？連續(xù)色譜的優(yōu)勢體現(xiàn)在三方面：1.生產(chǎn)效率提升：通過多柱交替上樣、洗脫，設(shè)備利用率從批次色譜的~30%提升至>80%，相同產(chǎn)能下設(shè)備體積可縮小50%以上；2.緩沖液消耗降低：連續(xù)模式下洗脫峰重疊部分少，緩沖液用量減少30%-40%；3.工藝一致性增強：恒定的上樣負荷和洗脫條件可減少批次間差異。實際應用時需重點控制：1.柱間一致性：多根色譜柱的填料裝填密度（誤差需<2%）、柱效（理論塔板數(shù)偏差<5%）需高度一致，否則會導致各柱結(jié)合容量不均；2.切換時間精度：上樣-洗脫-再生的切換時間需精確到秒級（誤差<2s），否則可能導致目標蛋白穿透或洗脫峰重疊；3.在線監(jiān)測靈敏度：需配置高精度UV檢測器（基線噪聲<±0.0005AU）和電導率傳感器（響應時間<0.5s），實時監(jiān)控各柱的結(jié)合飽和點（通常以UV280nm達到上樣液濃度的5%作為穿透點）；4.壓力波動控制：多柱切換時系統(tǒng)壓力波動需<0.1MPa，否則可能導致填料壓縮或柱床塌陷；5.清洗驗證：連續(xù)模式下各柱交替使用，需驗證再生后填料的結(jié)合容量恢復率（應>95%），避免污染物累積影響后續(xù)批次。在重組蛋白純化工藝開發(fā)中，如何通過實驗設(shè)計（DOE）優(yōu)化離子交換色譜的洗脫條件？請描述具體的實驗因素、響應變量及關(guān)鍵分析方法?；贒OE優(yōu)化離子交換色譜（IEX）洗脫條件的步驟如下：實驗因素選擇：根據(jù)IEX類型（陽離子/陰離子）確定關(guān)鍵參數(shù)，通常包括洗脫鹽濃度（NaCl，范圍0.1-1.0M）、洗脫pH（范圍±1.0單位，如目標蛋白pI為7.0則pH6.0-8.0）、洗脫流速（0.5-3.0CV/h）、梯度斜率（線性梯度時間10-40CV）。若為疏水電荷誘導色譜（HCIC），還需考慮洗脫劑（如精氨酸）濃度（0.2-1.0M）。響應變量設(shè)定：核心指標為目標蛋白回收率（%）、純度（HPLC-SEC或SDS檢測）、宿主細胞蛋白（HCP）殘留量（ELISA）、宿主DNA殘留量（qPCR）。次要指標包括洗脫峰體積（影響后續(xù)濃縮步驟）、柱壓（反映填料耐受性）。實驗設(shè)計與實施：采用Box-Behnken設(shè)計或中心復合設(shè)計，設(shè)置3水平（低、中、高），總實驗次數(shù)約15-20次。例如，對于4因素（鹽濃度、pH、流速、梯度時間），選擇中心復合設(shè)計（CCD），包含8個角點、6個軸向點和6個中心點。每次實驗需嚴格控制上樣量（固定為填料結(jié)合容量的80%）、平衡緩沖液（pH與上樣液一致，電導率<5mS/cm）。數(shù)據(jù)分析方法：通過統(tǒng)計軟件（如JMP、MODDE）擬合二次多項式模型，計算各因素對響應變量的主效應、交互效應及曲率效應。例如，若模型顯示鹽濃度與pH的交互作用對HCP殘留有顯著影響（p<0.05），則需重點分析兩者的協(xié)同作用。通過響應面分析確定最優(yōu)區(qū)域（如回收率>90%、純度>98%、HCP<100ppm的重疊區(qū)域），并進行驗證實驗（3次重復）確認模型預測的準確性。最終確定的洗脫條件需滿足工藝魯棒性（±10%參數(shù)波動下，關(guān)鍵質(zhì)量屬性偏差<5%）。請說明在疫苗佐劑（如鋁佐劑）純化過程中，如何通過超濾-滲濾（UFDF）工藝去除游離鋁離子？需重點監(jiān)控哪些參數(shù)以避免佐劑顆粒聚集？超濾-滲濾去除游離鋁離子的關(guān)鍵在于利用膜截留分子量（MWCO）與鋁佐劑顆粒尺寸的匹配性。鋁佐劑通常為納米級顆粒（50-200nm），需選擇MWCO遠小于顆粒尺寸的膜（如陶瓷膜，截留孔徑50nm），確保佐劑被截留，而游離鋁離子（以Al3+或Al(OH)?+形式存在，尺寸<1nm）隨透過液排出。具體步驟：1.預處理：調(diào)整料液pH至佐劑穩(wěn)定范圍（通常pH5.5-7.0，避免pH<4.0導致顆粒溶解），添加0.01-0.1%吐溫-20防止顆粒吸附膜表面；2.濃縮：通過超濾將料液體積濃縮至初始體積的1/5-1/10，降低后續(xù)滲濾體積；3.滲濾：用無鋁緩沖液（如PBS，pH6.8）進行diafiltration，滲濾體積為5-10倍濃縮體積，確保游離鋁離子充分洗出；4.清洗：用0.1MNaOH溶液循環(huán)清洗膜組件（30min），去除膜表面吸附的佐劑顆粒。重點監(jiān)控參數(shù)：1.跨膜壓（TMP）：控制在0.5-1.5bar，TMP過高會導致顆粒在膜表面堆積（濃差極化），加劇聚集；2.錯流速度（CFV）：保持2-4m/s，通過剪切力減少顆粒在膜面的沉積；3.顆粒尺寸分布（PSD）：在線用動態(tài)光散射（DLS）監(jiān)測，若平均粒徑增大>20%（如從100nm增至120nm），需降低TMP或提高CFV；4.鋁離子濃度：透過液中Al3+濃度需<10ppm（通過電感耦合等離子體光譜ICP-OES檢測），若連續(xù)3次檢測>10ppm，需延長滲濾體積；5.佐劑活性：滲濾后檢測佐劑的蛋白吸附能力（如與模型蛋白BSA孵育后，離心取上清測蛋白濃度，吸附率應>90%），若吸附率下降，可能因顆粒表面電荷改變（需調(diào)整緩沖液離子強度）。若純化車間的超純水系統(tǒng)（UPW）電阻率突然從18.2MΩ·cm降至15MΩ·cm，且TOC（總有機碳）從<5ppb升至50ppb，可能的原因有哪些？作為純化工程師應如何快速排查并恢復系統(tǒng)？可能原因及排查步驟：1.預處理單元失效：活性炭過濾器吸附飽和（正常更換周期3-6個月），無法有效去除原水中的有機物（如腐殖酸），導致后續(xù)RO膜負荷過高。需檢查活性炭過濾器的壓差（正常<0.1MPa，若>0.2MPa需更換），并取活性炭層出水測余氯（應<0.1ppm，若>0.5ppm說明吸附飽和）。2.反滲透（RO）膜污染：RO膜被微生物（如假單胞菌）或無機鹽（如碳酸鈣）污染，脫鹽率下降。需檢測RO膜進水與產(chǎn)水的電導率，計算脫鹽率（正常>98%，若<95%需清洗）；取RO膜產(chǎn)水測微生物總數(shù)（應<10CFU/mL，若>100CFU/mL提示生物污染）。3.電去離子（EDI）模塊故障：EDI的離子交換樹脂失效或電極結(jié)垢，導致除鹽能力下降。需檢查EDI的工作電壓（正常100-200V）和電流（正常1-3A），若電壓升高但電流降低，可能是樹脂失效；取EDI產(chǎn)水測硅含量（應<1ppb，若>5ppb說明樹脂無法去除硅酸根）。4.循環(huán)管路污染：超純水儲存罐或分配管路內(nèi)壁滋生生物膜（常見于死角或流速<1m/s的區(qū)域），釋放有機物。需檢查循環(huán)泵的流速（應>1.5m/s），取儲罐排水口、使用點（如純化設(shè)備進水口）的水樣測TOC，若使用點TOC顯著高于儲罐出水，說明管路污染?？焖倩謴痛胧?.立即切換至備用超純水系統(tǒng)（若有），保證生產(chǎn)連續(xù)性；2.對預處理單元：更換活性炭過濾器，并用1%次氯酸鈉溶液浸泡30min消毒；3.對RO膜：若為生物污染，用0.1%氫氧化鈉+0.05%十二烷基硫酸鈉溶液循環(huán)清洗（35℃，2h）；若為無機鹽污染，用1%檸檬酸溶液清洗（pH3.0，25℃，1h）；4.對EDI模塊：若樹脂失效，需再生（用5%鹽酸和5%氫氧化鈉溶液分別沖洗陰陽極室）；若電極結(jié)垢，用1%草酸溶液浸泡2h去除鈣鎂沉積；5.對循環(huán)管路：用80℃熱水循環(huán)消毒（60min），或用0.3%過氧化氫溶液浸泡4h，之后沖洗至TOC<5ppb；6.恢復后連續(xù)監(jiān)測3天，每2h記錄電阻率、TOC、微生物指標，確認系統(tǒng)穩(wěn)定性。在基因治療載體（如AAV）純化中，空殼與完整病毒顆粒的分離是關(guān)鍵難點。請說明常用的分離技術(shù)（至少3種）及其原理，并分析各自的適用場景。AAV空殼（無基因組）與完整顆粒（含基因組）的分離技術(shù)及適用場景：1.離子交換色譜（IEX）：基于兩者表面電荷差異。完整顆粒因包裹負電荷的基因組（~4.7kbDNA），表面負電荷密度高于空殼（僅衣殼蛋白）。使用陰離子交換色譜（如QSepharose），在低離子強度（電導率<5mS/cm）下上樣，完整顆粒與填料結(jié)合更強，需更高鹽濃度（0.3-0.5MNaCl）洗脫，空殼則在0.1-0.3MNaCl洗脫。適用于小規(guī)模工藝（<10L收獲液），但需優(yōu)化pH（通常pH7.5-8.5）以放大電荷差異，且對AAV血清型（如AAV2vsAAV9）的電荷異質(zhì)性敏感。2.密度梯度離心（DGC）：利用兩者密度差異（完整顆粒密度1.33-1.35g/cm3，空殼1.29-1.31g/cm3）。常用碘克沙醇（OptiPrep）梯度（15%-40%w/v），在150,000g下離心2-4h，完整顆粒沉降至高密度區(qū)（~35%碘克沙醇），空殼在低密度區(qū)（~25%）。適用于高純度制備（如臨床樣品），但設(shè)備成本高（需超速離心機），處理量?。▎未?lt;10mL），且碘克沙醇殘留需后續(xù)去除。3.親和色譜（AC）：利用配基與完整顆粒的特異性結(jié)合。例如，單鏈抗體（scFv）可識別衣殼蛋白與基因組結(jié)合后的構(gòu)象表位，僅結(jié)合完整顆粒；或使用肝素親和填料（AAV2等血清型通過肝素硫酸鹽受體感染細胞），完整顆粒因基因組導致衣殼構(gòu)象變化，與肝素的結(jié)合力更強。適用于大規(guī)模工藝（>100L收獲液），但需開發(fā)高特異性配基（避免與空殼交叉反應），且洗脫條件（如低pH或高鹽）需確保病毒活性（感染滴度保留>80%）。4.尺寸排阻色譜（SEC）：基于兩者hydrodynamicsize差異（完整顆粒直徑~25nm，空殼~23nm）。使用高分辨率SEC填料（如Superose6Increase），在低流速（0.1-0.3mL/min）下分離，完整顆粒因體積大先流出。適用于分析級分離（如質(zhì)量控制），但制備級SEC處理量極低（<1%柱體積），難以用于生產(chǎn)。實際選擇時，臨床級生產(chǎn)多采用IEX與AC聯(lián)用（如親和捕獲后IEX精純），兼顧收率（>70%）與純度（完整顆粒占比>95%）；研發(fā)階段常用DGC作為金標準驗證分離效果；SEC主要用于放行檢測（如HPLC-SEC檢測空殼/完整顆粒比例）。若純化后的重組酶制劑在儲存2周后酶活下降30%（初始活為5000U/mg），可能的降解機制有哪些？請設(shè)計實驗驗證主要原因并提出改進措施?？赡艿慕到鈾C制及驗證實驗：1.蛋白酶污染：純化過程中殘留宿主細胞蛋白酶（如大腸桿菌的Lon蛋白酶），在儲存條件下（4℃）緩慢降解目標酶。驗證實驗：取降解后的樣品進行SDS，觀察是否出現(xiàn)目標條帶（如60kDa）的斷裂條帶（如40kDa+20kDa）；用蛋白酶抑制劑雞尾酒（含PMSF、EDTA、E-64）處理樣品，儲存2周后測酶活，若抑制后酶活僅下降5%，則確認蛋白酶污染。2.氧化失活：酶分子中的巰基（-SH）或甲硫氨酸殘基被氧化，導致構(gòu)象改變。驗證實驗：用5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB）檢測巰基含量（正常酶含2個游離巰基，若降至0.5個提示氧化）；用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS）分析甲硫氨酸氧化產(chǎn)物（分子量增加16Da）。3.聚集沉淀：酶分子在高濃度（如>10mg/mL）下發(fā)生不可逆聚集，形成無活性的沉淀。驗證實驗：用動態(tài)光散射（DLS）檢測粒徑分布（正常單峰~10nm，若出現(xiàn)>100nm的峰提示聚集）；離心樣品（10,000g，10min）取上清測酶活，若上清酶活僅為原樣品的60%，說明沉淀導致活性損失。4.緩沖液不匹配：儲存緩沖液的pH偏離酶的穩(wěn)定范圍（如酶最適pH7.0，儲存液pH6.0），導致構(gòu)象不穩(wěn)定。驗證實驗：用圓二色譜（CD）檢測二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋含量從50%降至35%提示構(gòu)象變化）；更換不同pH緩沖液（6.5-7.5）儲存，2周后比較酶活保留率。改進措施（以蛋白酶污染為例）：1.優(yōu)化純化工藝：在親和色譜后增加陰離子交換色譜（如DEAESepharose），利用蛋白酶（通常pI<5.0）與目標酶（pI7.0）的電荷差異去除殘留蛋白酶；2.添加抑制劑：在儲存緩沖液中加入0.1mMPMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑）和1mMEDTA（金屬蛋白酶抑制劑），抑制殘留蛋白酶活性；3.降低儲存溫度：將儲存溫度從4℃降至-20℃（添加10%甘油防凍結(jié)），減緩酶促反應速率；4.縮短儲存時間：驗證酶在4℃的半衰期（如從2周延長至4周），制定有效期（如2周內(nèi)使用）。若需將實驗室規(guī)模（50mL柱體積）的陽離子交換色譜工藝放大至生產(chǎn)規(guī)模（5L柱體積），需遵循哪些放大原則？關(guān)鍵工藝參數(shù)（如線速度、停留時間）應如何轉(zhuǎn)換？放大原則及參數(shù)轉(zhuǎn)換方法：放大需遵循“幾何相似性”和“動力學相似性”原則，確保小規(guī)模與生產(chǎn)規(guī)模的傳質(zhì)、流體分布一致。關(guān)鍵步驟如下：1.柱尺寸比例放大：保持柱高（H）與直徑（D）的比例（H/D）一致（實驗室柱H=20cm，D=5cm，H/D=4；生產(chǎn)柱D=20cm，則H=80cm），避免因柱高/直徑比變化導致的溝流或壁效應。2.線速度（cm/h）保持恒定：線速度=體積流速（mL/h）/(π×(D/2)2)。實驗室規(guī)模線速度通常為150-300cm/h（對應體積流速=150×π×(5/2)2≈2945mL/h），生產(chǎn)規(guī)模需維持相同線速度（150cm/h），則體積流速=150×π×(20/2)2≈47,124mL/h（47L/h）。3.停留時間（min）保持恒定：停留時間=柱體積（CV）/體積流速×60。實驗室柱體積50mL，體積流速2945mL/h，停留時間=50/2945×60≈1.02min；生產(chǎn)柱體