川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制：基于小膠質(zhì)細(xì)胞與信號(hào)通路的研究一、引言1.1研究背景與意義在全球范圍內(nèi)，抑郁癥已成為一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有3.5億人飽受抑郁癥的折磨，每年因抑郁而自殺的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，其造成的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)1萬(wàn)億美元。在中國(guó)，情況同樣不容樂(lè)觀，2019年中國(guó)精神衛(wèi)生調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)每年大約有4500萬(wàn)人飽受抑郁癥困擾，而最新的中國(guó)精神衛(wèi)生調(diào)查（TheChinaMentalHealthSurvey，CMHS）結(jié)果更是顯示，中國(guó)可能有超過(guò)5400萬(wàn)人患有抑郁癥，然而其中僅有9.5%的患者接受治療，且僅0.5%的患者得到充分治療。抑郁癥是一種以抑郁心境為主要表現(xiàn)的疾病，臨床癥狀復(fù)雜多樣，通常以情緒低落、興趣或樂(lè)趣缺乏、持續(xù)性疲勞為主要特征，還常伴有思維活動(dòng)減慢、意志缺乏、自我評(píng)價(jià)下降、自責(zé)自罪等癥狀，患者的飲食、睡眠也會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。并且，抑郁癥具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高自殺率和低識(shí)別率、低就診率、低治療率的特點(diǎn)，預(yù)測(cè)到2020年，抑郁癥已成為僅次于癌癥的威脅人類健康的第二大致殘因素。當(dāng)前，抑郁癥的治療主要以“藥物+心理治療”為主，配合物理治療、康復(fù)治療等綜合方式。其中，藥物治療是重要手段之一，但市售的單胺類抗抑郁藥物存在諸多局限性。一方面，這類藥物有效率較低，對(duì)約三分之一的患者沒(méi)有效果；另一方面，其副作用明顯，如可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、失眠、性功能障礙等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。此外，藥物治療還存在起效緩慢的問(wèn)題，往往需要數(shù)周甚至數(shù)月才能見到明顯的療效，這對(duì)于急需緩解癥狀的患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的煎熬。而且，許多患者在停藥后容易復(fù)發(fā)，使得抑郁癥的治療成為一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的過(guò)程。因此，開發(fā)更有效、副作用更少的抗抑郁藥物迫在眉睫。傳統(tǒng)中藥在抗抑郁藥物研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其毒副作用較小，且來(lái)源天然，越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。從天然藥物中尋找理想的抗抑郁藥物并闡明其作用機(jī)理已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為中藥續(xù)斷的主要活性成分之一，近年來(lái)逐漸進(jìn)入科研人員的視野。已有研究表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有較好的抗炎和神經(jīng)保護(hù)功效，且初步證實(shí)其具有抗抑郁功效，但其抗抑郁的具體作用機(jī)制尚不清楚。深入研究川續(xù)斷皂苷Ⅵ在抗抑郁中的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，不僅有助于揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，為抑郁癥的治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型抗抑郁藥物提供潛在的靶點(diǎn)和方向，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1川續(xù)斷皂苷Ⅵ的研究進(jìn)展川續(xù)斷皂苷Ⅵ（AsperosaponinⅥ）作為中藥續(xù)斷（DipsacusasperoidesC.Y.ChengetT.M.Ai）的主要活性成分之一，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷。近年來(lái)，對(duì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的研究不斷深入，涵蓋了其化學(xué)性質(zhì)、藥理活性等多個(gè)方面。在化學(xué)性質(zhì)方面，科研人員對(duì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的結(jié)構(gòu)鑒定、提取分離工藝進(jìn)行了大量研究。目前，已通過(guò)多種現(xiàn)代分析技術(shù)，如核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等，明確了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，不斷優(yōu)化的提取分離方法，提高了川續(xù)斷皂苷Ⅵ的純度和得率，使其能夠更方便地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床開發(fā)。藥理活性研究方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ展現(xiàn)出了廣泛的生物活性。已有研究表明，其具有顯著的抗炎作用，能夠抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)組織的損傷。在心血管系統(tǒng)方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可通過(guò)調(diào)節(jié)血脂、抑制血小板聚集、抗氧化等多種機(jī)制，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用，改善心臟功能。此外，在骨代謝調(diào)節(jié)方面，它能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的活性，有利于維持骨量平衡，對(duì)骨質(zhì)疏松等疾病具有潛在的治療價(jià)值。在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)研究中，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，它能夠減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。在一些神經(jīng)損傷模型中，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可改善神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。然而，其在抑郁癥治療領(lǐng)域的研究相對(duì)較少，且主要集中在初步的藥效學(xué)驗(yàn)證和簡(jiǎn)單的機(jī)制探討。1.2.2抑郁癥神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展隨著對(duì)抑郁癥研究的不斷深入，神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制逐漸成為研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制主要聚焦于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)，認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生與大腦中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平降低有關(guān)。然而，近年來(lái)大量的研究表明，神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)異常在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，炎癥反應(yīng)與抑郁癥密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者體內(nèi)炎癥因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等水平明顯升高，且炎癥因子水平與抑郁癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，可成功建立炎癥性抑郁模型，表現(xiàn)出典型的抑郁樣行為，如快感缺失、行為絕望等，進(jìn)一步證實(shí)了炎癥在抑郁癥發(fā)病中的重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的固有免疫細(xì)胞，在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，對(duì)維持大腦的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。當(dāng)大腦受到炎癥刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，可分化為兩種不同的表型：經(jīng)典激活型（M1型）和替代激活型（M2型）。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，參與炎癥反應(yīng)，過(guò)度激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥損傷，破壞神經(jīng)元的正常功能；而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如IL-10、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）等，具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。在抑郁癥患者和動(dòng)物模型中，均觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活和表型失衡，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增多，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞減少，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)加劇，神經(jīng)元損傷，進(jìn)而引發(fā)抑郁癥狀。此外，色氨酸代謝途徑的異常也與抑郁癥的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在炎癥狀態(tài)下，吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）被激活，催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝，生成大量的犬尿氨酸及其代謝產(chǎn)物，如喹啉酸等。喹啉酸具有神經(jīng)毒性，可損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，同時(shí)，色氨酸代謝途徑的異常還會(huì)導(dǎo)致5-HT合成減少，進(jìn)一步加重抑郁癥狀。1.2.3現(xiàn)有研究不足盡管目前對(duì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ和抑郁癥神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足。在川續(xù)斷皂苷Ⅵ的研究方面，雖然已證實(shí)其具有多種藥理活性，但在抑郁癥治療領(lǐng)域的研究還處于起步階段，其具體的抗抑郁作用機(jī)制尚未完全明確?，F(xiàn)有研究多集中在對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)上，對(duì)于其是否通過(guò)其他神經(jīng)免疫相關(guān)途徑發(fā)揮抗抑郁作用，如對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能的影響，以及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)可塑性等方面的作用，還缺乏深入的研究。在抑郁癥神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中，雖然炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活在抑郁癥發(fā)病中的作用已得到廣泛認(rèn)可，但其中涉及的具體信號(hào)通路和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。例如，小膠質(zhì)細(xì)胞激活和表型轉(zhuǎn)換的精確調(diào)控機(jī)制，以及炎癥因子如何通過(guò)神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)影響神經(jīng)遞質(zhì)代謝和神經(jīng)元功能等問(wèn)題，尚未完全明確。此外，目前的研究大多基于動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)，在人體中的研究相對(duì)較少，這限制了對(duì)抑郁癥神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的全面理解和臨床應(yīng)用。同時(shí)，將川續(xù)斷皂苷Ⅵ與抑郁癥神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相結(jié)合的研究更為匱乏。目前還不清楚川續(xù)斷皂苷Ⅵ是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)來(lái)改善抑郁癥患者的癥狀，以及其作用的靶點(diǎn)和分子機(jī)制是什么。因此，深入研究川續(xù)斷皂苷Ⅵ在抗抑郁中的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型抗抑郁藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究川續(xù)斷皂苷Ⅵ在抗抑郁中的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，具體研究目的如下：明確川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)抑郁模型動(dòng)物行為學(xué)的影響：通過(guò)構(gòu)建多種抑郁癥動(dòng)物模型，如慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激（CUMS）模型、脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥性抑郁模型等，觀察川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后動(dòng)物的抑郁樣行為變化，包括快感缺失、行為絕望等核心癥狀的改善情況，采用蔗糖偏愛實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)等經(jīng)典行為學(xué)測(cè)試方法，量化評(píng)估川續(xù)斷皂苷Ⅵ的抗抑郁效果。揭示川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)免疫相關(guān)細(xì)胞及因子的調(diào)節(jié)作用：研究川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能和表型的影響，檢測(cè)其對(duì)炎癥因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）、抗炎因子（如IL-10等）以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（如BDNF等）表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，明確川續(xù)斷皂苷Ⅵ在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用環(huán)節(jié)。闡明川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如Westernblot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化等，研究川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制作用，如Toll樣受體4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）信號(hào)通路等，揭示其抗抑郁作用的分子機(jī)制。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：實(shí)驗(yàn)研究：選用SPF級(jí)C57BL/6小鼠或SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、川續(xù)斷皂苷Ⅵ低、中、高劑量組以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組。通過(guò)慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激、脂多糖腹腔注射等方法建立抑郁癥動(dòng)物模型，川續(xù)斷皂苷Ⅵ各劑量組給予相應(yīng)濃度的藥物灌胃，陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予臨床常用抗抑郁藥物，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水。在造模及給藥過(guò)程中，定期進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，觀察動(dòng)物的行為變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，采集腦組織、血液等樣本，用于后續(xù)的指標(biāo)檢測(cè)。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)血清和腦組織中炎癥因子、抗炎因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量；采用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)和表型變化；通過(guò)Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)水平。文獻(xiàn)綜述法：系統(tǒng)檢索國(guó)內(nèi)外關(guān)于川續(xù)斷皂苷Ⅵ、抑郁癥神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及相關(guān)領(lǐng)域的研究文獻(xiàn)，對(duì)已有研究成果進(jìn)行全面梳理和分析，總結(jié)當(dāng)前研究的現(xiàn)狀、熱點(diǎn)和不足，為本研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路，同時(shí)，通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)的綜合分析，進(jìn)一步完善本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)路線，確保研究的科學(xué)性和創(chuàng)新性。二、川續(xù)斷皂苷Ⅵ與抑郁癥概述2.1川續(xù)斷皂苷Ⅵ的基本特性川續(xù)斷皂苷Ⅵ主要來(lái)源于川續(xù)斷科植物川續(xù)斷（DipsacusasperoidesC.Y.ChengetT.M.Ai）的干燥根。川續(xù)斷在我國(guó)分布廣泛，資源豐富，其根作為傳統(tǒng)中藥，具有悠久的應(yīng)用歷史。川續(xù)斷皂苷Ⅵ是川續(xù)斷的主要活性成分之一，在川續(xù)斷中含量相對(duì)較高，通常為0.5%-2%左右，但含量會(huì)因川續(xù)斷的產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法等因素而有所波動(dòng)。例如，生長(zhǎng)于四川、云南等地的川續(xù)斷，其皂苷Ⅵ含量可能會(huì)高于其他地區(qū)；秋季采收的川續(xù)斷，其有效成分含量往往相對(duì)較高。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，川續(xù)斷皂苷Ⅵ屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷，其分子式為C47H76O18，分子量為929.10。其化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包含一個(gè)五環(huán)三萜的母核，以及多個(gè)糖基通過(guò)糖苷鍵連接在母核上。這種結(jié)構(gòu)賦予了川續(xù)斷皂苷Ⅵ獨(dú)特的理化性質(zhì)。在溶解性方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有機(jī)溶劑，在水中也有一定的溶解度，1g川續(xù)斷皂苷Ⅵ可熔于87ml水、3ml沸水，但幾乎不溶于苯、氯仿及石油醚等非極性有機(jī)溶劑。其熔點(diǎn)為235-240°C（分解），性狀通常為白色結(jié)晶粉末。在提取方面，目前常用的方法有溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等。溶劑提取法是利用川續(xù)斷皂苷Ⅵ在不同溶劑中的溶解性差異，采用合適的溶劑進(jìn)行提取，常用的溶劑有甲醇、乙醇等。超聲輔助提取法則是在溶劑提取的基礎(chǔ)上，利用超聲波的空化作用、機(jī)械振動(dòng)等效應(yīng)，加速川續(xù)斷皂苷Ⅵ從藥材細(xì)胞中溶出，提高提取效率，縮短提取時(shí)間。微波輔助提取法同樣是借助微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，使藥材細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)快速釋放，從而實(shí)現(xiàn)高效提取。例如，有研究采用超聲輔助乙醇提取法，以乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間為考察因素，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明在乙醇濃度70%、料液比1:20（g/ml）、超聲時(shí)間30min的條件下，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取率可達(dá)1.56%。提取得到的川續(xù)斷皂苷Ⅵ粗提物，還需要進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，以獲得高純度的產(chǎn)品。常用的分離方法有硅膠柱色譜法、大孔吸附樹脂法、高速逆流色譜法等。硅膠柱色譜法利用硅膠對(duì)不同化合物吸附能力的差異進(jìn)行分離，通過(guò)選擇合適的洗脫劑，可逐步將川續(xù)斷皂苷Ⅵ與其他雜質(zhì)分離。大孔吸附樹脂法是利用大孔吸附樹脂對(duì)不同分子大小和極性的化合物具有不同的吸附和解吸性能，實(shí)現(xiàn)對(duì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的富集和純化。高速逆流色譜法則是一種基于液-液分配原理的分離技術(shù)，無(wú)需固體支撐體，避免了樣品的不可逆吸附和污染，能夠高效地分離出高純度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ。例如，采用大孔吸附樹脂AB-8對(duì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)行分離純化，先用水洗脫除去糖類等水溶性雜質(zhì)，再用50%乙醇洗脫得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其純度可達(dá)90%以上。對(duì)于川續(xù)斷皂苷Ⅵ的鑒定，常采用多種現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的方法。其中，核磁共振（NMR）技術(shù)是確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)的重要手段，通過(guò)1H-NMR、13C-NMR等譜圖，可以準(zhǔn)確地解析出分子中各原子的連接方式和空間構(gòu)型。質(zhì)譜（MS）技術(shù)則可用于測(cè)定其分子量和分子式，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜圖中碎片離子的分析，還能進(jìn)一步推斷分子的結(jié)構(gòu)信息。此外，紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）等也可用于輔助鑒定，通過(guò)特征吸收峰來(lái)判斷分子中所含的官能團(tuán)。例如，通過(guò)NMR分析，確定川續(xù)斷皂苷Ⅵ分子中各碳、氫原子的化學(xué)位移和耦合常數(shù)，結(jié)合MS測(cè)定的分子量，從而準(zhǔn)確地確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。2.2抑郁癥的現(xiàn)狀與危害抑郁癥作為一種常見的精神障礙，其發(fā)病率和患病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類身心健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)，全球抑郁癥的患病率約為5%，這意味著每20個(gè)人中就可能有1人患有抑郁癥。而在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，由于社會(huì)壓力大、生活節(jié)奏快等因素，抑郁癥的患病率可能更高，如美國(guó)的抑郁癥患病率約為7%-10%。在中國(guó)，抑郁癥的患病率也不容小覷。北京大學(xué)第六醫(yī)院黃悅勤教授等在《柳葉刀?精神病學(xué)》發(fā)表的中國(guó)精神衛(wèi)生調(diào)查（CMHS）結(jié)果顯示，中國(guó)抑郁癥的終身患病率為6.9%，12個(gè)月患病率為3.6%，患者超過(guò)9500萬(wàn)。2019年中國(guó)精神衛(wèi)生調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)每年大約有4500萬(wàn)人飽受抑郁癥困擾，而最新的研究更是表明，中國(guó)可能有超過(guò)5400萬(wàn)人患有抑郁癥。抑郁癥給患者帶來(lái)了巨大的身心痛苦。患者常常陷入持久的情緒低落狀態(tài)，對(duì)以往感興趣的事物失去興趣，感到極度的疲勞和乏力，即使經(jīng)過(guò)充分休息也難以緩解。他們的思維變得遲緩，注意力難以集中，記憶力下降，決策能力也受到影響。許多患者還會(huì)出現(xiàn)睡眠障礙，表現(xiàn)為入睡困難、多夢(mèng)、早醒等，嚴(yán)重影響睡眠質(zhì)量。在食欲方面，患者可能出現(xiàn)食欲不振或暴飲暴食的情況，導(dǎo)致體重明顯波動(dòng)。更為嚴(yán)重的是，抑郁癥患者常常伴有自殺念頭和行為，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因抑郁而自殺的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，自殺已成為抑郁癥患者最嚴(yán)重的后果之一。抑郁癥不僅對(duì)患者自身造成傷害，也給家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)?；颊叩募彝コ蓡T需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力照顧患者，不僅要關(guān)心患者的日常生活起居，還要關(guān)注其心理健康狀況，給予心理支持和安慰。這往往會(huì)導(dǎo)致家庭成員身心疲憊，影響家庭的正常生活秩序。同時(shí)，抑郁癥患者的治療費(fèi)用也是一筆不小的開支，包括藥物治療、心理治療、康復(fù)治療等費(fèi)用，給家庭帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)壓力。從社會(huì)層面來(lái)看，抑郁癥造成的危害同樣不容忽視。抑郁癥患者由于病情的影響，工作能力和生產(chǎn)效率下降，甚至無(wú)法正常工作，這不僅導(dǎo)致患者自身收入減少，也給企業(yè)和社會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估算，全球每年因抑郁癥導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1萬(wàn)億美元，包括醫(yī)療費(fèi)用、生產(chǎn)力下降、缺勤等方面的損失。此外，抑郁癥患者的高自殺率也給社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)面影響，增加了社會(huì)的不安定因素。2.3抑郁癥的發(fā)病機(jī)制2.3.1神經(jīng)遞質(zhì)紊亂抑郁癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，其中神經(jīng)遞質(zhì)紊亂被認(rèn)為是重要的發(fā)病機(jī)制之一。在眾多神經(jīng)遞質(zhì)中，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA），在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。5-羥色胺最早于血清中被發(fā)現(xiàn)，故又名血清素。大量研究表明，抑郁癥患者血清中吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）呈現(xiàn)過(guò)激表達(dá)，這使得色氨酸（Trp）分解速率加快，進(jìn)而抑制了色氨酸合成5-HT，導(dǎo)致突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)5-HT水平顯著降低，加速了抑郁的發(fā)生。5-HT在情緒調(diào)節(jié)、睡眠、食欲等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其水平的降低會(huì)影響患者的情緒狀態(tài)，導(dǎo)致情緒低落、焦慮、失眠等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦中突觸間隙及突觸后膜5-HT受體數(shù)量明顯降低，這進(jìn)一步削弱了5-HT的神經(jīng)傳遞功能，使得患者對(duì)情緒的調(diào)節(jié)能力下降。去甲腎上腺素主要參與維持睡眠與覺(jué)醒行為，同時(shí)對(duì)情緒的調(diào)節(jié)也有重要影響。有研究顯示，抑郁癥患者存在外周交感神經(jīng)興奮性增高的情況，血漿NE濃度顯著高于正常對(duì)照組，但血漿NE濃度與抑郁嚴(yán)重程度并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，而是與焦慮嚴(yán)重程度相關(guān)。當(dāng)NE功能降低時(shí)，可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)情緒低落、疲勞、注意力不集中等癥狀。此外，NE能神經(jīng)元遭到破壞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，影響NE的藥物（如去甲丙咪嗪）對(duì)抑郁癥具有一定的治療效果，這也進(jìn)一步證實(shí)了NE在抑郁癥發(fā)病中的作用。多巴胺在行為動(dòng)機(jī)的強(qiáng)化和正向獎(jiǎng)勵(lì)功能方面發(fā)揮核心作用。當(dāng)處于歡愉情緒時(shí)，DA分泌顯著升高；而在抑郁狀態(tài)下，DA分泌則會(huì)減少。精神運(yùn)動(dòng)減慢的抑郁癥患者，其體內(nèi)DA減少，中樞DA受體敏感性降低。并且，抑郁癥患者多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）濃度明顯升高，高濃度的DAT使突觸末梢DA回收率升高，導(dǎo)致突觸間隙DA的水平下降，從而誘發(fā)抑郁癥產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者紋狀體中123I標(biāo)記的碘苯甲酰胺示蹤劑（IBZM）與多巴胺D2受體結(jié)合增加，這也表明抑郁癥患者存在DA功能的異常。除了上述單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，其他神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸等也與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，抑郁癥患者大腦中GABA水平降低，可能導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性增加，進(jìn)而影響情緒調(diào)節(jié)。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其功能失調(diào)可能導(dǎo)致神經(jīng)毒性，損傷神經(jīng)元，參與抑郁癥的發(fā)病過(guò)程。神經(jīng)遞質(zhì)之間相互作用，形成復(fù)雜的神經(jīng)遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)著大腦的功能和情緒狀態(tài)。當(dāng)這些神經(jīng)遞質(zhì)的平衡被打破時(shí)，就可能引發(fā)抑郁癥的發(fā)生。2.3.2神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中也扮演著重要角色，其中下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA軸）的異常是抑郁癥神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)的核心表現(xiàn)。正常情況下，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激時(shí)，下丘腦會(huì)分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），CRH作用于垂體，促使垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），ACTH再作用于腎上腺皮質(zhì)，使其分泌皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素。皮質(zhì)醇通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)下丘腦和垂體的功能，從而維持HPA軸的平衡。然而，在抑郁癥患者中，HPA軸的調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)紊亂，表現(xiàn)為CRH分泌增加，ACTH和皮質(zhì)醇水平升高，且皮質(zhì)醇的晝夜節(jié)律消失。長(zhǎng)期處于高皮質(zhì)醇水平會(huì)對(duì)大腦產(chǎn)生多種不良影響。皮質(zhì)醇具有神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致海馬體神經(jīng)元萎縮、凋亡，使海馬體體積減小，進(jìn)而影響患者的記憶力和學(xué)習(xí)能力。海馬體在情緒調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，其功能受損會(huì)導(dǎo)致情緒調(diào)節(jié)失常，加重抑郁癥狀。高皮質(zhì)醇水平還會(huì)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，減少神經(jīng)發(fā)生，影響大腦的自我修復(fù)和可塑性。HPA軸的異常還會(huì)影響其他神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。例如，甲狀腺軸功能也常受到影響，抑郁癥患者可能出現(xiàn)甲狀腺激素水平異常，表現(xiàn)為甲狀腺素（T3、T4）水平降低，促甲狀腺激素（TSH）水平升高。甲狀腺激素對(duì)大腦的發(fā)育和功能維持至關(guān)重要，其水平異常會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成和代謝，進(jìn)一步加重抑郁癥的癥狀。此外，HPA軸與生殖內(nèi)分泌軸之間也存在相互作用。在女性抑郁癥患者中，常出現(xiàn)月經(jīng)周期紊亂、性激素水平異常等情況，這可能與HPA軸的失調(diào)導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌軸功能紊亂有關(guān)。性激素在情緒調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著一定作用，其水平的改變會(huì)影響女性患者的情緒狀態(tài)，增加抑郁癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和癥狀嚴(yán)重程度。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的失調(diào)與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、神經(jīng)免疫異常等發(fā)病機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展。2.3.3神經(jīng)免疫異常近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明神經(jīng)免疫異常在抑郁癥的發(fā)病中起著重要作用，神經(jīng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞活化是神經(jīng)免疫異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者體內(nèi)炎癥因子水平明顯升高，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥因子可以通過(guò)多種途徑影響大腦的功能。炎癥因子可以破壞血腦屏障的完整性，使外周的免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)更容易進(jìn)入大腦，引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。炎癥因子還可以直接作用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成、代謝和釋放，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。IL-6可以抑制色氨酸羥化酶的活性，減少5-HT的合成，從而加重抑郁癥狀。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的固有免疫細(xì)胞，在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，對(duì)維持大腦的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。當(dāng)大腦受到炎癥刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，可分化為兩種不同的表型：經(jīng)典激活型（M1型）和替代激活型（M2型）。在抑郁癥患者和動(dòng)物模型中，均觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活和表型失衡，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增多，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞減少。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，參與炎癥反應(yīng)，過(guò)度激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥損傷，破壞神經(jīng)元的正常功能。而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如IL-10、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）等，具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生增加，如一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）等，這些物質(zhì)會(huì)損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。此外，色氨酸代謝途徑的異常也與抑郁癥的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在炎癥狀態(tài)下，吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）被激活，催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝，生成大量的犬尿氨酸及其代謝產(chǎn)物，如喹啉酸等。喹啉酸具有神經(jīng)毒性，可損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，同時(shí)，色氨酸代謝途徑的異常還會(huì)導(dǎo)致5-HT合成減少，進(jìn)一步加重抑郁癥狀。神經(jīng)免疫異常與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)相互影響，形成惡性循環(huán)，共同促進(jìn)抑郁癥的發(fā)展。三、川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1動(dòng)物模型建立選用SPF級(jí)C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重20-25g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。小鼠在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。采用慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立小鼠抑郁癥模型。CUMS刺激包括禁食（24h）、禁水（24h）、潮濕環(huán)境（將小鼠飼養(yǎng)籠底部鋪上浸濕的濾紙，持續(xù)24h）、晝夜顛倒（將正常的光照/黑暗周期顛倒，持續(xù)24h）、夾尾（用止血鉗輕輕夾住小鼠尾巴尖端1/3處，持續(xù)1min，每天3次，每次間隔30min）、搖晃（將小鼠置于搖床中，以150r/min的速度搖晃30min）等，每天隨機(jī)選擇1-2種刺激，連續(xù)進(jìn)行21天。同時(shí)，將小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，以增強(qiáng)應(yīng)激效果。正常對(duì)照組小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中正常飼養(yǎng)，不接受任何應(yīng)激刺激。為驗(yàn)證模型的成功建立，在造模結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。采用蔗糖偏愛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的快感缺失情況，實(shí)驗(yàn)前先讓小鼠適應(yīng)1%蔗糖溶液24h，然后將小鼠置于兩個(gè)裝有等量1%蔗糖溶液和純水的瓶子前，自由飲用1h，記錄小鼠對(duì)蔗糖溶液和純水的攝入量，計(jì)算蔗糖偏愛率（蔗糖偏愛率=蔗糖溶液攝入量/（蔗糖溶液攝入量+純水?dāng)z入量）×100%）。正常小鼠的蔗糖偏愛率通常在70%以上，而抑郁癥模型小鼠的蔗糖偏愛率會(huì)顯著降低。采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的行為絕望程度，將小鼠放入水深15cm、水溫（25±1）℃的玻璃缸中，游泳6min，記錄后4min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間，抑郁癥模型小鼠的不動(dòng)時(shí)間會(huì)明顯增加。通過(guò)上述行為學(xué)測(cè)試，篩選出蔗糖偏愛率低于50%且強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間大于120s的小鼠，作為成功建模的抑郁癥小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.2分組及給藥方式將成功建模的抑郁癥小鼠隨機(jī)分為模型組、川續(xù)斷皂苷Ⅵ低劑量組（20mg/kg）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ中劑量組（40mg/kg）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ高劑量組（80mg/kg）以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組（鹽酸氟西汀，10mg/kg），每組10只。另設(shè)正常對(duì)照組10只，給予等量生理鹽水。川續(xù)斷皂苷Ⅵ用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成相應(yīng)濃度的混懸液，鹽酸氟西汀用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液。各給藥組小鼠每天上午9：00-10：00按10ml/kg的體積進(jìn)行灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組給予等量的0.5%CMC-Na溶液或生理鹽水，連續(xù)給藥21天。在給藥期間，每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、飲水、活動(dòng)、毛發(fā)等情況，并記錄體重變化。3.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法在給藥結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行一系列指標(biāo)檢測(cè)，以探究川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用。行為學(xué)測(cè)試：在給藥第21天，再次對(duì)小鼠進(jìn)行蔗糖偏愛實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，評(píng)估川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)小鼠抑郁樣行為的改善情況。同時(shí)，增加懸尾實(shí)驗(yàn)，將小鼠尾巴距末端1cm處用膠帶固定懸掛于離臺(tái)面30cm高的橫桿上，使其呈倒掛狀態(tài)，記錄6min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間，進(jìn)一步檢測(cè)小鼠的行為絕望程度。血清和腦組織炎癥因子、抗炎因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子檢測(cè)：行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，小鼠禁食12h，然后用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3000r/min離心15min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的含量，具體操作按照ELISA試劑盒（購(gòu)自[試劑盒供應(yīng)商名稱]）說(shuō)明書進(jìn)行。取血后迅速斷頭處死小鼠，取出腦組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，分離海馬組織，稱重后加入適量的RIPA裂解液，冰上勻漿，4℃、12000r/min離心15min，取上清，采用ELISA法檢測(cè)海馬組織中上述炎癥因子、抗炎因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量。小膠質(zhì)細(xì)胞活化及表型分析：取部分新鮮的海馬組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，厚度為4μm。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba1）的表達(dá)，以評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。用兔抗小鼠Iba1多克隆抗體（1:200稀釋，購(gòu)自[抗體供應(yīng)商名稱]）作為一抗，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。同時(shí)，采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)海馬組織中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶-1（Arg-1）的表達(dá)，以分析小膠質(zhì)細(xì)胞的表型。用兔抗小鼠iNOS多克隆抗體（1:200稀釋）和鼠抗小鼠Arg-1單克隆抗體（1:200稀釋）作為一抗，分別用AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，DAPI染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析iNOS陽(yáng)性細(xì)胞（M1型小膠質(zhì)細(xì)胞）和Arg-1陽(yáng)性細(xì)胞（M2型小膠質(zhì)細(xì)胞）的比例。色氨酸代謝途徑相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：取海馬組織，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)檢測(cè)色氨酸（Trp）、犬尿氨酸（Kyn）和喹啉酸（QA）的含量。將海馬組織勻漿后，加入適量的甲醇，渦旋振蕩，4℃、12000r/min離心15min，取上清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。色譜柱為[具體色譜柱型號(hào)]，流動(dòng)相為[具體流動(dòng)相組成]，流速為[具體流速]，柱溫為[具體柱溫]。質(zhì)譜條件為[具體質(zhì)譜條件]，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算各物質(zhì)的含量。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織中吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）和犬尿氨酸酶（KAT）的mRNA表達(dá)水平。用Trizol試劑提取海馬組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下：IDO上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；KAT上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)：取海馬組織，采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法（HPLC-ECD）檢測(cè)5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）的含量。將海馬組織勻漿后，加入適量的0.1mol/L高氯酸溶液，渦旋振蕩，4℃、12000r/min離心15min，取上清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-ECD分析。色譜柱為[具體色譜柱型號(hào)]，流動(dòng)相為[具體流動(dòng)相組成]，流速為[具體流速]，柱溫為[具體柱溫]。電化學(xué)檢測(cè)器的工作電位為[具體電位]，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算各神經(jīng)遞質(zhì)的含量。3.2川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)抑郁樣行為的改善作用行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的蔗糖偏愛率顯著降低（P<0.01），表明模型組小鼠出現(xiàn)明顯的快感缺失癥狀，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P<0.01），說(shuō)明模型組小鼠的行為絕望程度明顯加重，成功建立了抑郁癥小鼠模型。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠的蔗糖偏愛率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中高劑量組的蔗糖偏愛率升高最為明顯，接近正常對(duì)照組水平。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效緩解小鼠的快感缺失癥狀，提高其對(duì)愉悅刺激的感受性。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，川續(xù)斷皂苷Ⅵ低、中、高劑量組小鼠的不動(dòng)時(shí)間均顯著縮短（P<0.05或P<0.01），懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似，各劑量組小鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯減少（P<0.05或P<0.01），說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠顯著改善小鼠的行為絕望程度，增強(qiáng)其應(yīng)對(duì)困境的能力。陽(yáng)性藥物對(duì)照組鹽酸氟西汀也能明顯改善小鼠的抑郁樣行為，與模型組相比，蔗糖偏愛率升高，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間縮短（P<0.01），且川續(xù)斷皂苷Ⅵ高劑量組的抗抑郁效果與鹽酸氟西汀相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效改善抑郁模型小鼠的抑郁樣行為，對(duì)快感缺失和行為絕望等核心癥狀具有顯著的緩解作用，具有潛在的抗抑郁應(yīng)用價(jià)值。3.3川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)炎癥的抑制作用3.3.1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響神經(jīng)炎癥在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，而小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的固有免疫細(xì)胞，其激活與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。在本研究中，通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色技術(shù)，深入探究了川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)抑郁模型小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba1）的表達(dá)顯著增加（P<0.01），這表明模型組小鼠海馬組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活。而給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中Iba1的表達(dá)均明顯降低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性，其中高劑量組的降低效果最為顯著。這說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效抑制抑郁模型小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。進(jìn)一步采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)海馬組織中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶-1（Arg-1）的表達(dá)，以分析小膠質(zhì)細(xì)胞的表型變化。結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中iNOS陽(yáng)性的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），Arg-1陽(yáng)性的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例顯著減少（P<0.01），表明模型組小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的表型向促炎的M1型偏移。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中iNOS陽(yáng)性的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.05或P<0.01），Arg-1陽(yáng)性的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例均顯著增加（P<0.05或P<0.01），且高劑量組的表型調(diào)節(jié)作用最為明顯。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠調(diào)節(jié)抑郁模型小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的表型，促進(jìn)其向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化，從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并調(diào)節(jié)其表型，減少促炎型M1小膠質(zhì)細(xì)胞，增加抗炎型M2小膠質(zhì)細(xì)胞，從而減輕神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這可能是其抗抑郁的重要機(jī)制之一。3.3.2對(duì)炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子在神經(jīng)炎癥和抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，檢測(cè)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)抑郁模型小鼠血清和海馬組織中炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清和海馬組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子的含量顯著升高（P<0.01）。而給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠血清和海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性，高劑量組的降低效果最為顯著。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效抑制抑郁模型小鼠體內(nèi)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。研究還檢測(cè)了白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎細(xì)胞因子的含量。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清和海馬組織中IL-10的含量顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠血清和海馬組織中IL-10的含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且高劑量組的升高幅度最大。這說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠促進(jìn)抑郁模型小鼠體內(nèi)抗炎細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的抗炎能力。綜合以上結(jié)果，川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的平衡，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的分泌，從而減輕神經(jīng)炎癥，這可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的重要機(jī)制之一。其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，小膠質(zhì)細(xì)胞在受到川續(xù)斷皂苷Ⅵ的作用后，表型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而分泌更多的抗炎細(xì)胞因子，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放。此外，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能還通過(guò)其他途徑，如調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能、影響炎癥信號(hào)通路等，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。3.4川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用3.4.1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，而川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的修復(fù)作用，這對(duì)于改善抑郁癥患者的神經(jīng)功能具有重要意義。在本研究中，通過(guò)對(duì)抑郁模型小鼠海馬組織的觀察和分析，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠海馬組織中的神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核固縮、尼氏體減少等。而給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中的神經(jīng)元損傷得到明顯改善，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，細(xì)胞核清晰，尼氏體數(shù)量增加。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效修復(fù)抑郁模型小鼠海馬組織中的神經(jīng)細(xì)胞損傷。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)作用可能與其抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。通過(guò)TUNEL染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠海馬組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明細(xì)胞凋亡明顯增多。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著減少，且呈劑量依賴性，高劑量組的減少效果最為顯著。這說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠抑制抑郁模型小鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，采用BrdU標(biāo)記法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著增加。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠促進(jìn)抑郁模型小鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)作用還體現(xiàn)在對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)上。研究表明，抑郁癥患者存在神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)水平降低。本研究中，通過(guò)高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法（HPLC-ECD）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠海馬組織中5-HT、NE和DA的含量顯著低于正常對(duì)照組。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中5-HT、NE和DA的含量均顯著升高，且高劑量組的升高效果最為明顯。這說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠調(diào)節(jié)抑郁模型小鼠海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)的水平，改善神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)。3.4.2對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活和功能維持中起著至關(guān)重要的作用，其中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是研究最為廣泛的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，深入探究了川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)抑郁模型小鼠海馬組織中BDNF表達(dá)的促進(jìn)作用。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織中BDNF的含量顯著降低（P<0.01）。而給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中BDNF的含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性，高劑量組的升高效果最為顯著。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效促進(jìn)抑郁模型小鼠海馬組織中BDNF的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與ELISA結(jié)果一致，模型組小鼠海馬組織中BDNFmRNA的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中BDNFmRNA的表達(dá)水平均顯著升高。這進(jìn)一步證實(shí)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠在基因水平上促進(jìn)BDNF的表達(dá)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ促進(jìn)BDNF表達(dá)的作用具有重要意義。BDNF可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增加神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)，促進(jìn)突觸的形成和可塑性。在抑郁癥患者和動(dòng)物模型中，BDNF水平的降低會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生減少，突觸功能受損，進(jìn)而加重抑郁癥狀。而川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過(guò)促進(jìn)BDNF的表達(dá)，能夠增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化能力，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)，修復(fù)受損的突觸，從而改善神經(jīng)功能，發(fā)揮抗抑郁作用。BDNF還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和代謝，與5-HT、NE等神經(jīng)遞質(zhì)相互作用，共同維持大腦的正常功能。川續(xù)斷皂苷Ⅵ促進(jìn)BDNF的表達(dá)，有助于調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的平衡，改善抑郁癥患者的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。四、川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制4.1PPAR-γ信號(hào)通路的介導(dǎo)作用4.1.1PPAR-γ的結(jié)構(gòu)與功能過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）屬于核激素受體超家族成員，是一類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。PPAR-γ基因可產(chǎn)生5’端序列不同的3種mRNA，即PPAR-γ1、PPAR-γ2和PPAR-γ3。其中，PPAR-γ1和PPAR-γ3mRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)完全相同，故PPAR-γ主要包括PPAR-γ1和PPAR-γ2兩種亞型，其差別在于PPAR-γ2蛋白的N末端多出了30個(gè)氨基酸序列。PPAR-γ1在脂肪組織、脾臟、肝臟、單核/巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及動(dòng)脈粥樣硬化病灶等部位均有表達(dá)，其中在脂肪組織中大量表達(dá)，在其他組織中少量表達(dá)。PPAR-γ2則主要在脂肪及平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ1還可在人和鼠類的T細(xì)胞上表達(dá)，參與免疫調(diào)節(jié)功能。不同的組織分布表明PPAR-γ亞型具有不同的生物學(xué)作用。PPAR-γ在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用，其中抗炎作用是其關(guān)鍵功能之一。當(dāng)PPAR-γ被激活后，它能與視黃醇類X受體（RXR）結(jié)合形成異二聚體，該異二聚體可與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPRE）結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在炎癥反應(yīng)中，PPAR-γ通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗炎作用。它可以抑制核因子-κB（NF-κB）的活性，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，被激活后可促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。PPAR-γ通過(guò)與NF-κB的亞基相互作用，阻止NF-κB的活化和核轉(zhuǎn)位，從而抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。PPAR-γ還可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，該通路參與細(xì)胞的增殖、分化和炎癥反應(yīng)等過(guò)程。PPAR-γ的激活可抑制MAPK的磷酸化，減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)。4.1.2川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)PPAR-γ信號(hào)通路的激活為了探究川續(xù)斷皂苷Ⅵ是否通過(guò)激活PPAR-γ信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)了抑郁模型小鼠海馬組織中PPAR-γ的表達(dá)及磷酸化水平。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織中PPAR-γ蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.01），且磷酸化水平也明顯下降（P<0.01）。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中PPAR-γ蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性，其中高劑量組的升高效果最為顯著。同時(shí)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ各劑量組小鼠海馬組織中PPAR-γ的磷酸化水平也顯著增加（P<0.05或P<0.01），同樣呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效提高抑郁模型小鼠海馬組織中PPAR-γ的表達(dá)及磷酸化水平，激活PPAR-γ信號(hào)通路。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致。模型組小鼠海馬組織中PPAR-γmRNA的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中PPAR-γmRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且高劑量組的升高幅度最大。這進(jìn)一步證實(shí)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ在基因水平上促進(jìn)了PPAR-γ的表達(dá)，從而激活PPAR-γ信號(hào)通路。研究還發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)PPAR-γ信號(hào)通路的激活作用具有一定的時(shí)間依賴性。在給藥早期，PPAR-γ的表達(dá)及磷酸化水平雖有升高趨勢(shì)，但差異不顯著；隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，PPAR-γ的表達(dá)及磷酸化水平逐漸升高，在給藥后期達(dá)到顯著差異。這提示川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)PPAR-γ信號(hào)通路的激活作用可能需要一定的時(shí)間積累。4.1.3阻斷PPAR-γ信號(hào)通路的驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁作用是否依賴于PPAR-γ信號(hào)通路，本研究采用PPAR-γ特異性拮抗劑GW9662進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。在川續(xù)斷皂苷Ⅵ給藥前30分鐘，給予小鼠腹腔注射GW9662（1mg/kg），連續(xù)處理21天。行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，與川續(xù)斷皂苷Ⅵ單獨(dú)給藥組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ聯(lián)合GW9662處理組小鼠的蔗糖偏愛率顯著降低（P<0.01），強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P<0.01）。這表明阻斷PPAR-γ信號(hào)通路后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)抑郁模型小鼠抑郁樣行為的改善作用被明顯抑制，小鼠的快感缺失和行為絕望癥狀加重。在神經(jīng)免疫相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方面，與川續(xù)斷皂苷Ⅵ單獨(dú)給藥組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ聯(lián)合GW9662處理組小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba1）的表達(dá)顯著增加（P<0.01），表明小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度增強(qiáng)。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01），M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶-1（Arg-1）陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞的表型向促炎的M1型偏移。血清和海馬組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著升高（P<0.01），抗炎細(xì)胞因子IL-10的含量顯著降低（P<0.01），神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的含量也顯著降低（P<0.01）。這表明阻斷PPAR-γ信號(hào)通路后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)炎癥的抑制作用、對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的促進(jìn)作用均被明顯削弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阻斷PPAR-γ信號(hào)通路后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的抗抑郁效果被同步廢止，其對(duì)神經(jīng)免疫相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用也受到顯著影響。這充分說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過(guò)激活PPAR-γ信號(hào)通路，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎表型，抑制神經(jīng)炎癥，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗抑郁作用，PPAR-γ信號(hào)通路在川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。4.2TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用4.2.1TLR4/NF-κB信號(hào)通路概述Toll樣受體4（TLR4）是Toll樣受體家族的重要成員，在先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TLR4主要表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，也在一些非免疫細(xì)胞如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。其結(jié)構(gòu)包含胞外富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)Toll/白細(xì)胞介素-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域。胞外LRR結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS），以及損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等。當(dāng)TLR4識(shí)別相應(yīng)配體后，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88通過(guò)其TIR結(jié)構(gòu)域與TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，形成MyD88依賴的信號(hào)復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，包括IRAK1、IRAK4等。IRAK4首先被激活，進(jìn)而磷酸化IRAK1，激活的IRAK1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）結(jié)合，促使TRAF6發(fā)生自身泛素化，激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1可激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，IKK由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。IKKβ磷酸化抑制性κB（IκB），使其發(fā)生泛素化并被蛋白酶體降解。IκB的降解使得核因子-κB（NF-κB）得以釋放，NF-κB由p50和p65等亞基組成，活化的NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)一系列基因的轉(zhuǎn)錄，如促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。在神經(jīng)炎癥中，TLR4/NF-κB信號(hào)通路同樣發(fā)揮著重要作用。當(dāng)大腦受到損傷或炎癥刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的固有免疫細(xì)胞，其表面的TLR4被激活，通過(guò)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，激活NF-κB，促進(jìn)炎癥因子的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。過(guò)度激活的TLR4/NF-κB信號(hào)通路會(huì)引發(fā)持續(xù)的神經(jīng)炎癥，損傷神經(jīng)元，破壞神經(jīng)遞質(zhì)平衡，影響神經(jīng)可塑性，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化癥以及抑郁癥等。在抑郁癥患者和動(dòng)物模型中，均觀察到TLR4/NF-κB信號(hào)通路的異常激活，這表明該信號(hào)通路在抑郁癥的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。4.2.2川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的抑制為了探究川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)了抑郁模型小鼠海馬組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)變化。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、p-IKKβ、p-NF-κBp65蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.01），表明TLR4/NF-κB信號(hào)通路在抑郁癥模型小鼠中被過(guò)度激活。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、p-IKKβ、p-NF-κBp65蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性，高劑量組的降低效果最為顯著。這表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠有效抑制抑郁模型小鼠海馬組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而抑制該信號(hào)通路的激活。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致。模型組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且高劑量組的降低幅度最大。這進(jìn)一步證實(shí)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ在基因水平上抑制了TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的抑制作用可能與它對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)有關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中TLR4的主要表達(dá)細(xì)胞之一，川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型，抑制其向促炎的M1型轉(zhuǎn)化，減少炎癥因子的釋放，從而間接抑制了TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活。此外，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能直接作用于TLR4或其下游信號(hào)分子，阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，從而發(fā)揮對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。4.2.3相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用，本研究進(jìn)行了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)色氨酸代謝的影響。在炎癥狀態(tài)下，TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活會(huì)誘導(dǎo)吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）的表達(dá)，IDO催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝，導(dǎo)致色氨酸水平降低，犬尿氨酸及其代謝產(chǎn)物如喹啉酸等生成增加。喹啉酸具有神經(jīng)毒性，可損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，同時(shí)色氨酸代謝途徑的異常還會(huì)導(dǎo)致5-HT合成減少，進(jìn)一步加重抑郁癥狀。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)檢測(cè)了抑郁模型小鼠海馬組織中色氨酸、犬尿氨酸和喹啉酸的含量。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織中色氨酸含量顯著降低（P<0.01），犬尿氨酸和喹啉酸含量顯著升高（P<0.01）。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，各劑量組小鼠海馬組織中色氨酸含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），犬尿氨酸和喹啉酸含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性，高劑量組的調(diào)節(jié)效果最為顯著。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了海馬組織中IDO的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中IDOmRNA的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）。給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后，各劑量組小鼠海馬組織中IDOmRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且高劑量組的降低幅度最大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少IDO的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)色氨酸代謝，降低犬尿氨酸和喹啉酸的生成，減輕神經(jīng)毒性，改善神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，發(fā)揮抗抑郁作用。這進(jìn)一步驗(yàn)證了川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)制。4.3其他可能的作用機(jī)制探討除了PPAR-γ信號(hào)通路和TLR4/NF-κB信號(hào)通路外，川續(xù)斷皂苷Ⅵ在抗抑郁過(guò)程中可能還涉及其他作用機(jī)制，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響便是其中之一。神經(jīng)遞質(zhì)在大腦的神經(jīng)傳遞和情緒調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，而抑郁癥患者往往存在神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的紊亂。研究表明，抑郁癥患者大腦中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平降低，這與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些神經(jīng)遞質(zhì)的水平來(lái)發(fā)揮抗抑郁作用。在對(duì)抑郁模型小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ干預(yù)后，小鼠海馬組織中5-HT、NE和DA的含量均有所升高。這可能是因?yàn)榇ɡm(xù)斷皂苷Ⅵ影響了神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放或再攝取過(guò)程。從合成角度來(lái)看，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)合成酶的活性，促進(jìn)5-HT、NE和DA的合成。色氨酸羥化酶是5-HT合成的關(guān)鍵酶，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能通過(guò)某種機(jī)制提高色氨酸羥化酶的活性，增加5-HT的合成。在釋放方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能作用于神經(jīng)末梢，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使其能夠更好地傳遞信號(hào)，調(diào)節(jié)情緒。對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能抑制相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，減少神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取，從而提高突觸間隙中神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，增強(qiáng)神經(jīng)傳遞效率。川續(xù)斷皂苷Ⅵ還可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)和功能，來(lái)改善抑郁癥患者的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能。在抑郁癥模型中，神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)和功能往往出現(xiàn)異常，如5-HT受體、NE受體和DA受體的數(shù)量和親和力發(fā)生改變，影響了神經(jīng)遞質(zhì)與受體的結(jié)合，進(jìn)而影響神經(jīng)傳遞和情緒調(diào)節(jié)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些受體的表達(dá)和功能，使其恢復(fù)正常水平，增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮抗抑郁作用。它可能促進(jìn)5-HT1A受體的表達(dá)，增強(qiáng)5-HT與該受體的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)情緒和行為。除單胺類神經(jīng)遞質(zhì)外，γ-氨基丁酸（GABA）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其水平和功能的改變也與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者大腦中GABA水平降低，GABA能神經(jīng)元功能受損。川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能通過(guò)調(diào)節(jié)GABA的合成、釋放和代謝，以及調(diào)節(jié)GABA受體的功能，來(lái)改善GABA能神經(jīng)系統(tǒng)的功能。川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能促進(jìn)谷氨酸脫羧酶的活性，增加GABA的合成，從而增強(qiáng)GABA能神經(jīng)傳遞，抑制神經(jīng)元的過(guò)度興奮，對(duì)抑郁癥的治療起到積極作用。川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用可能是其抗抑郁的重要機(jī)制之一，通過(guò)調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的水平、受體表達(dá)和功能，改善神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的紊亂，從而發(fā)揮抗抑郁效果。然而，目前對(duì)于川續(xù)斷皂苷Ⅵ調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的具體分子機(jī)制和作用靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步深入研究，以全面揭示其在抗抑郁中的作用機(jī)制。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究通過(guò)構(gòu)建慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的抑郁癥小鼠模型，系統(tǒng)地探究了川續(xù)斷皂苷Ⅵ在抗抑郁中的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，取得了一系列重要研究成果。行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠顯著改善抑郁模型小鼠的抑郁樣行為。與模型組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ各劑量組小鼠的蔗糖偏愛率顯著升高，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短，且呈劑量依賴性，其中高劑量組的效果最為明顯，接近正常對(duì)照組水平，表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)快感缺失和行為絕望等核心癥狀具有顯著的緩解作用，具有良好的抗抑郁效果。在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ展現(xiàn)出多方面的調(diào)節(jié)能力。在神經(jīng)炎癥方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，其能顯著降低海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba1）的表達(dá)，減少經(jīng)典激活型（M1型）小膠質(zhì)細(xì)胞的比例，增加替代激活型（M2型）小膠質(zhì)細(xì)胞的比例，從而調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型。同時(shí)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ還能顯著降低血清和海馬組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子的含量，升高白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎細(xì)胞因子的含量，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的平衡，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞具有修復(fù)作用。通過(guò)對(duì)海馬組織的觀察發(fā)現(xiàn)，其能改善神經(jīng)元的形態(tài)，增加尼氏體數(shù)量，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖。同時(shí)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ還能顯著升高海馬組織中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)的含量，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，改善神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。此外，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能有效促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，無(wú)論是在蛋白水平還是基因水平，各劑量組小鼠海馬組織中BDNF的含量和mRNA表達(dá)水平均顯著升高，且呈劑量依賴性，這有助于促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，修復(fù)受損的突觸，改善神經(jīng)功能。在機(jī)制研究方面，本研究揭示了川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗抑郁的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，