2025年熒光分析法題庫及答案一、單項選擇題1.下列關(guān)于熒光產(chǎn)生的描述中，正確的是（）A.分子吸收光能后由基態(tài)單重態(tài)躍遷到激發(fā)單重態(tài)，再以輻射方式回到基態(tài)單重態(tài)B.分子吸收光能后由基態(tài)單重態(tài)躍遷到激發(fā)三重態(tài)，再以輻射方式回到基態(tài)單重態(tài)C.分子吸收光能后由基態(tài)三重態(tài)躍遷到激發(fā)單重態(tài)，再以非輻射方式回到基態(tài)D.分子吸收熱能后由基態(tài)單重態(tài)躍遷到激發(fā)單重態(tài)，再以輻射方式回到基態(tài)答案：A2.斯托克斯位移是指（）A.激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的差值（發(fā)射光波長更長）B.激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的差值（激發(fā)光波長更長）C.熒光壽命與磷光壽命的差值D.熒光量子產(chǎn)率與磷光量子產(chǎn)率的差值答案：A3.下列物質(zhì)中，通常不具有強熒光特性的是（）A.羅丹明BB.維生素B2C.苯D.熒光素鈉答案：C（苯的熒光較弱，多環(huán)芳烴或含共軛雙鍵的物質(zhì)熒光更強）4.熒光分析法中，激發(fā)光波長的選擇主要依據(jù)（）A.樣品的吸收光譜B.樣品的發(fā)射光譜C.儀器的最大輸出功率D.溶劑的透射光譜答案：A（激發(fā)光需被樣品吸收，故選擇吸收峰波長）5.熒光淬滅中，動態(tài)淬滅的主要機制是（）A.淬滅劑與熒光分子形成無熒光的絡(luò)合物B.淬滅劑通過碰撞轉(zhuǎn)移能量，加速非輻射躍遷C.淬滅劑吸收激發(fā)光，減少樣品吸收的光強D.淬滅劑改變?nèi)軇O性，影響熒光分子結(jié)構(gòu)答案：B6.熒光定量分析的前提是（）A.熒光強度與濃度呈嚴(yán)格線性關(guān)系B.樣品濃度越高，熒光強度越強C.激發(fā)光波長固定，發(fā)射光波長可變D.溶液中無任何淬滅劑存在答案：A（低濃度下符合F=Kc，高濃度會因自吸或自淬滅偏離）7.下列儀器部件中，熒光分光光度計特有的是（）A.光源B.檢測器C.發(fā)射單色器D.比色皿答案：C（熒光需同時控制激發(fā)和發(fā)射波長，故有雙單色器）8.熒光壽命是指（）A.熒光分子從激發(fā)到發(fā)射熒光的時間B.熒光強度衰減至初始值1/e所需的時間C.激發(fā)光持續(xù)照射的時間D.熒光信號被檢測器接收的響應(yīng)時間答案：B9.下列因素中，會導(dǎo)致熒光量子產(chǎn)率降低的是（）A.分子剛性增強（如形成環(huán)結(jié)構(gòu)）B.溶劑極性減小C.溫度升高D.溶液pH與分子最佳發(fā)光pH一致答案：C（溫度升高加劇分子碰撞，非輻射躍遷增加）10.內(nèi)濾效應(yīng)主要影響（）A.激發(fā)光的強度B.發(fā)射光的檢測C.樣品對激發(fā)光的吸收均勻性D.熒光分子的激發(fā)態(tài)壽命答案：C（高濃度或溶液中存在吸光物質(zhì)時，激發(fā)光在樣品池內(nèi)衰減，導(dǎo)致內(nèi)部樣品吸收的光強降低）11.時間分辨熒光分析法的主要優(yōu)勢是（）A.提高檢測靈敏度B.消除短壽命背景熒光干擾C.擴大線性范圍D.簡化儀器結(jié)構(gòu)答案：B（通過延遲檢測，排除樣品基質(zhì)中短壽命熒光的干擾）12.熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）發(fā)生的條件不包括（）A.供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有重疊B.供體與受體距離在1-10nm范圍內(nèi)C.供體與受體需通過共價鍵連接D.供體處于激發(fā)態(tài)答案：C（FRET依賴分子間距離，不要求共價連接）13.測定某樣品熒光強度時，若溶劑中含有少量熒光雜質(zhì)，會導(dǎo)致（）A.熒光強度測量值偏高B.熒光強度測量值偏低C.對結(jié)果無影響D.熒光壽命延長答案：A（雜質(zhì)產(chǎn)生額外熒光信號）14.下列關(guān)于磷光與熒光的區(qū)別，錯誤的是（）A.磷光的壽命比熒光長B.磷光發(fā)射來自激發(fā)三重態(tài)，熒光來自激發(fā)單重態(tài)C.磷光需要在低溫下檢測，熒光可在室溫下檢測D.磷光的強度通常比熒光強答案：D（磷光躍遷是禁阻的，強度通常弱于熒光）15.熒光分析法相比紫外-可見分光光度法的主要優(yōu)點是（）A.儀器成本更低B.適用于所有吸光物質(zhì)C.靈敏度更高（可達ng/mL級）D.不受溶液pH影響答案：C（熒光信號是發(fā)射光，背景干擾小，靈敏度比吸收法高2-3個數(shù)量級）二、填空題1.熒光分子從激發(fā)單重態(tài)S1回到基態(tài)S0時，以輻射方式釋放能量產(chǎn)生______；若先通過系間竄越到激發(fā)三重態(tài)T1，再回到S0時產(chǎn)生______。答案：熒光；磷光2.熒光量子產(chǎn)率φ=______，其值越大，物質(zhì)的熒光能力越______。答案：發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)；強3.熒光分光光度計中，激發(fā)單色器通常位于樣品池______，發(fā)射單色器位于樣品池______（填“前”或“后”）。答案：前；后4.常見的熒光淬滅劑包括______（至少列舉2種），其作用機制可分為______淬滅和______淬滅。答案：氧氣、碘離子、重金屬離子；動態(tài)（碰撞）；靜態(tài)（絡(luò)合）5.熒光定量分析的基本公式為F=Kc，其中K與______、______、______等因素有關(guān)（至少填3個）。答案：激發(fā)光強度、量子產(chǎn)率、摩爾吸光系數(shù)、光程6.斯托克斯位移的產(chǎn)生是由于分子在激發(fā)態(tài)發(fā)生______（如振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換），導(dǎo)致發(fā)射光能量______（填“高于”或“低于”）激發(fā)光。答案：非輻射躍遷；低于7.時間分辨熒光檢測中，通過控制______和______，可有效排除短壽命背景熒光的干擾。答案：延遲時間；門控時間8.內(nèi)濾效應(yīng)包括兩種類型：一種是樣品本身對激發(fā)光的吸收（______），另一種是溶液中其他吸光物質(zhì)對______的吸收。答案：自吸收；發(fā)射光9.熒光壽命測量常用的方法有______（如脈沖光源法）和______（如相位調(diào)制法）。答案：時域法；頻域法10.熒光探針設(shè)計的關(guān)鍵是______，例如通過______（填一種機制）實現(xiàn)對目標(biāo)分子的特異性響應(yīng)。答案：特異性識別基團與熒光報告基團的結(jié)合；熒光淬滅/恢復(fù)、FRET、激發(fā)態(tài)電荷轉(zhuǎn)移三、簡答題1.簡述熒光產(chǎn)生的基本過程。答案：熒光產(chǎn)生需經(jīng)歷以下步驟：（1）分子吸收光能，由基態(tài)單重態(tài)S0躍遷到激發(fā)單重態(tài)的某一振動能級（S1'、S2'等）；（2）通過振動弛豫（無輻射躍遷）迅速失去部分能量，回到S1的最低振動能級；（3）從S1的最低振動能級以輻射方式躍遷回S0的各振動能級，釋放能量產(chǎn)生熒光。整個過程時間約10??秒。2.影響熒光強度的主要因素有哪些？答案：（1）分子結(jié)構(gòu)：共軛雙鍵越長、剛性平面結(jié)構(gòu)越強、給電子取代基（如-OH、-NH?）越多，熒光越強；（2）溶劑：極性增大可能增強或減弱熒光（視分子結(jié)構(gòu)而定），含重原子溶劑可能促進系間竄越，降低熒光；（3）溫度：溫度升高，分子碰撞加劇，非輻射躍遷增加，熒光減弱；（4）pH：影響分子解離狀態(tài)（如酚類在堿性條件下解離為酚氧負(fù)離子，熒光增強）；（5）淬滅劑：如O?、I?等通過碰撞或絡(luò)合降低熒光量子產(chǎn)率；（6）濃度：低濃度時F∝c，高濃度因自吸或自淬滅導(dǎo)致熒光強度下降甚至猝滅。3.熒光定量分析為何通常要求樣品濃度較低？答案：熒光定量分析的基本公式F=Kc成立的前提是稀溶液（A≤0.05）。當(dāng)濃度過高時，會出現(xiàn)兩種現(xiàn)象：（1）自吸收：樣品分子對自身發(fā)射的熒光產(chǎn)生吸收，導(dǎo)致檢測到的熒光強度降低；（2）自淬滅：激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子碰撞，將能量轉(zhuǎn)移給基態(tài)分子，加速非輻射躍遷，降低熒光量子產(chǎn)率。因此，高濃度時F與c不再呈線性關(guān)系，需控制濃度在低范圍。4.如何選擇熒光分析中的激發(fā)波長和發(fā)射波長？答案：（1）激發(fā)波長（λex）：通常選擇樣品的最大吸收波長（λmax吸收），因為此波長下樣品對激發(fā)光的吸收效率最高，可獲得最強熒光信號。若存在干擾物質(zhì)，可選擇次強吸收波長以減少干擾。（2）發(fā)射波長（λem）：選擇樣品的最大熒光發(fā)射波長（λmax發(fā)射），此波長下熒光強度最大，檢測靈敏度最高。需注意避免激發(fā)光散射（如瑞利散射、拉曼散射）的干擾，通常λem應(yīng)大于λex（斯托克斯位移）。5.比較熒光分析法與紫外-可見分光光度法的異同。答案：相同點：均基于分子對光的吸收；儀器結(jié)構(gòu)均包含光源、單色器、樣品池、檢測器。不同點：（1）檢測信號：熒光法檢測發(fā)射光（屬于發(fā)射光譜），分光光度法檢測透射光（屬于吸收光譜）；（2）靈敏度：熒光法靈敏度更高（可達ng/mL級），因發(fā)射光信號背景干擾?。唬?）選擇性：熒光法可通過同時選擇λex和λem提高選擇性；（4）應(yīng)用范圍：熒光法僅適用于熒光物質(zhì)或可衍生為熒光物質(zhì)的樣品，分光光度法適用于所有吸光物質(zhì)；（5）線性范圍：熒光法線性范圍較窄（通常2-3個數(shù)量級），分光光度法較寬（4-5個數(shù)量級）。四、計算題1.用熒光法測定某藥物溶液的濃度。取濃度為0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測得熒光強度為45.2；濃度為1.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，熒光強度為89.5；濃度為1.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，熒光強度為134.0。取未知樣品溶液，測得熒光強度為67.8（假設(shè)線性范圍內(nèi)）。計算未知樣品的濃度。答案：設(shè)濃度c（μg/mL）與熒光強度F的線性關(guān)系為F=kc+b。代入標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)據(jù)：當(dāng)c=0.5時，45.2=0.5k+b；當(dāng)c=1.0時，89.5=1.0k+b；解得k=(89.5-45.2)/(1.0-0.5)=88.6，b=45.2-0.5×88.6=45.2-44.3=0.9。未知樣品F=67.8，代入得c=(67.8-0.9)/88.6≈0.755μg/mL。2.已知羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率φR=0.97，其在某溶劑中的吸光度AR=0.02（激發(fā)光波長下），熒光積分強度IR=1250；某未知熒光物質(zhì)在相同條件下的吸光度AX=0.03，熒光積分強度IX=850（假設(shè)兩物質(zhì)的激發(fā)光強度、光程、溶劑相同）。計算未知物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率φX。答案：根據(jù)熒光量子產(chǎn)率比較法公式：φX=φR×(IX/IR)×(AR/AX)（因F=KφI0εbc，當(dāng)I0、b、c相同時，F(xiàn)∝φε，而A=εbc，故F∝φA，因此φX=φR×(FX/FR)×(AR/AX)）。代入數(shù)據(jù)：φX=0.97×(850/1250)×(0.02/0.03)=0.97×0.68×0.6667≈0.438。3.某熒光物質(zhì)的熒光壽命τ=5.0ns，當(dāng)加入淬滅劑后，測得熒光壽命τ'=2.0ns。計算淬滅常數(shù)Kq（假設(shè)淬滅過程為動態(tài)淬滅，且淬滅劑濃度[Q]=1.0×10?3mol/L）。