創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金資助項(xiàng)目答辯D-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究專業(yè)：化學(xué)工程與工藝導(dǎo)師：報(bào)告人：/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究實(shí)驗(yàn)及討論研究方案研究背景選題意義結(jié)論/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究選題意義D-絲氨酸是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)NMDA型谷氨酸受體(NR1/NR2型)的輔助激動(dòng)劑，在動(dòng)物的大腦中一生都維持著很高的濃度；腦內(nèi)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞都含有D-絲氨酸并且具有特異的生物合成、胞外釋放、攝取和降解途徑。D-絲氨酸作為一種重要的膠質(zhì)細(xì)胞遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)突觸可塑性、感覺信息傳遞、神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)興奮性毒性等生理及病理過程,并逐漸成為阿爾采末病(AD)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的治療靶點(diǎn)。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究研究背景如何分離檢測(cè)D-絲氨酸？針對(duì)其外消旋體的拆分已開發(fā)了優(yōu)先結(jié)晶法、形成非對(duì)映體立體異構(gòu)體結(jié)晶法、酶促法、色譜法（包括：液相色譜、氣相色譜、薄層色譜、配位色譜、離子交換色譜）毛細(xì)管電泳法和萃取法等。存在的問題：絲氨酸由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分離難度較大，且沒有紫外或熒光吸收，常需衍生后才可得到檢測(cè)。

如何建立D-Ser有效檢測(cè)的快速方法，大大降低檢測(cè)成本，仍是分析工作者面臨的具有挑戰(zhàn)性的課題。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究研究背景高效毛細(xì)管電泳（HPCE）是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)，因具有低耗、快速、高效、環(huán)境友好等特點(diǎn)而成為新興的手性分離分析中極具吸引力的分析方法。非接觸電導(dǎo)檢測(cè)是近年來出現(xiàn)的新的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于缺乏紫外-可見吸收基團(tuán)氨基酸則無須先作衍生化處理,可以進(jìn)行直接檢測(cè)。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究研究方案本課題提出采用高效毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)法，以銅-L-精氨酸作為配體交換選擇劑，與羥丙基甲基纖維素（HPMC）構(gòu)成二元手性選擇體系，建立快速、靈敏和低成本的D-絲氨酸的分離分析新方法。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究分離分析原理毛細(xì)管電泳是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)高效，快速的新型液相分離分析技術(shù)；而非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器是近年發(fā)展起來的一種新型電導(dǎo)檢測(cè)方法。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究實(shí)驗(yàn)部分儀器和試劑手性選擇體系的選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定線性范圍、重現(xiàn)性、檢出限測(cè)定/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究?jī)x器CES2008型毛細(xì)管電泳儀/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究實(shí)驗(yàn)試劑氫氧化鈉(NaOH，廣州化學(xué)試劑廠，分析純)、檸檬酸(Cit，廣州化學(xué)試劑廠，分析純)、乙酸銅(Cu(CH3COO)2·H2O，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純)、羥丙基甲基纖維素(HPMC，山東赫達(dá)股份有限公司，分析純)、D,L-絲氨酸、L-絲氨酸(D,L-Ser、L-Ser，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，層析純)、L-精氨酸(L-Arg，上海伯奧生物科技有限公司，層析純)。所用水為超純水。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究手性選擇體系的選擇僅用Cu(Ⅱ)絲氨酸對(duì)映體未能達(dá)到分離Cu(Ⅱ)+L-Arg分離度Rs=1.6Cu(Ⅱ)-L-Arg+HPMC分離度Rs=2.1/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究手性選擇體系的選擇圖1兩種不同的手性選擇體系對(duì)分離度的影響Fig.1Theeffectoftwodifferentchiralselectorsontheresolutiona.Cu(Ⅱ)-L-Argb.√Cu(Ⅱ)-L-Arg-HPMC/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究銅離子濃度對(duì)分離度的影響圖2Cu(Ⅱ)濃度對(duì)分離度的影響Fig.2TheeffectofCu(Ⅱ)concentrationontheresolution本實(shí)驗(yàn)選擇Cu(Ⅱ)的最佳濃度為2.5mmol/L。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究L-精氨酸濃度對(duì)分離度的影響圖3L-精氨酸濃度對(duì)分離度的影響Fig.3TheeffectofL-Argconcentrationontheresolution本實(shí)驗(yàn)選擇L-精氨酸的最佳濃度為5.0mmol/L。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究HPMC濃度對(duì)分離度的影響圖4HPMC濃度對(duì)分離度的影響Fig.4TheeffectofHPMCconcentrationontheresolution因此，本實(shí)驗(yàn)選擇HPMC最佳濃度為10mg/L。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究緩沖溶液的組成、濃度及pH的影響NaOH-Cit體系在非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法中有良好的基線和靈敏的響應(yīng)，但緩沖溶液濃度太高易引起基線漂移。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檸檬酸濃度對(duì)對(duì)映體分離的影響很大，濃度太低，絲氨酸不出峰；濃度太高，水峰提前，對(duì)映體也得不到分離，見下表。表1檸檬酸濃度對(duì)分離度的影響故實(shí)驗(yàn)選擇Cit濃度為0.4mmol/L。CCit(mmol/L)0.20.40.60.81.0Resolution(Rs)--2.31.8----/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究緩沖溶液的組成、濃度及pH的影響固定檸檬酸濃度后，加入NaOH以調(diào)節(jié)運(yùn)行液的pH。在2～4mmol/L濃度范圍內(nèi)考察NaOH濃度對(duì)分離度的影響，見表2。表2NaOH濃度對(duì)分離度的影響故實(shí)驗(yàn)選擇NaOH濃度為3.0mmol/L。CNaOH(mmol/L)2.02.43.03.44.0Resolution(Rs)0.91.62.41.91.9/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究緩沖溶液的組成、濃度及pH的影響圖5pH對(duì)分離度的影響Fig.5TheeffectofpHontheresolution/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究1電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)離子組分存在進(jìn)樣歧視2重力進(jìn)樣無進(jìn)樣歧視3擴(kuò)散進(jìn)樣進(jìn)樣具雙向性，有進(jìn)樣歧視進(jìn)樣方式的選擇故本實(shí)驗(yàn)采用重力進(jìn)樣。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究進(jìn)樣方式的選擇圖6進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離度的影響Fig.6Theeffectofinjectiontimeontheresolution進(jìn)樣時(shí)間為60s時(shí)分離度最高，Rs=2.6。/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究進(jìn)樣方式的選擇此外，進(jìn)樣時(shí)間還對(duì)峰高及峰面積有較大影響，見表3。表3進(jìn)樣時(shí)間的影響故實(shí)驗(yàn)選擇Cit濃度為0.4mmol/L。進(jìn)樣時(shí)間（s）304050607080100120峰高L-Ser4955748410010513964D-Ser51689210912212917082峰面積L-Ser10611460211926832916296245701444D-Ser11021683268833843354346850651850/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究分離電壓的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了分離電壓從10kV至15kV對(duì)絲氨酸對(duì)映體分離的影響，見表4。表4分離電壓對(duì)遷移時(shí)間和分離度的影響故實(shí)驗(yàn)選擇Cit濃度為0.4mmol/L。workingvoltage(kV)101213√1415Resolution(Rs)2.62.32.01.81.6MigratingtimeofD-Ser(min)48.832.726.523.521.8/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究運(yùn)行液體系：3.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit+2.5mmol/LCu(Ac)2+5.0mmol/LL-Arg+10.0mg/LHPMC（pH=9.67）重力進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間為60s分離電壓為13kV

最佳實(shí)驗(yàn)條件/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究線性范圍與檢出限圖7D-絲氨酸線性校正曲線圖表5線性范圍與檢出限

待測(cè)組分回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍（mg/L）檢出限（mg/L）D-絲氨酸y=-123.8+981.9xr=0.99991～1000.5/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究重現(xiàn)性測(cè)定在相同條件下，D-Ser以3mg/L的濃度重復(fù)進(jìn)樣4次，測(cè)其重現(xiàn)性，見表6。表6重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)證明本方法具有較高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性。序號(hào)1234RSD/%遷移時(shí)間（min）23.124.722.623.33.9峰面積24002473261626805.0/sundae_meng實(shí)際樣品分析圖8D-絲氨酸小鼠脊髓樣品HPCE-C4D譜圖Fig.8TheelectropherogramofD-SerinratspinalcordD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究拆分機(jī)理初步探討在緩沖溶液中，銅離子與L-精氨酸以1∶2形成三元絡(luò)合物：L-Arg+Cu(Ⅱ)?(L-Arg)CuL-Arg+(L-Arg)Cu(Ⅱ)?Cu(L-Arg)2當(dāng)絲氨酸對(duì)映體進(jìn)入緩沖系統(tǒng)時(shí)，D-Ser和L-Ser分別取代一分子的L-Arg,形成兩種不同的三元絡(luò)合物:L-Ser+Cu(L-Arg)2?(L-Arg)Cu(L-Ser)+L-ArgD-Ser+Cu(L-Arg)2?(L-Arg)Cu(D-Ser)+L-Arg/sundae_mengD-絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)研究拆分機(jī)理初步探討根據(jù)(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)穩(wěn)定性和光學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，引起二者電泳淌度的不同，D,L-Ser得到分離，本實(shí)驗(yàn)中L-Ser比D-Ser先流出。由于(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)的穩(wěn)定性系數(shù)差異不夠大，絲氨酸對(duì)映體分離度較小。緩沖溶液中加入HPMC后，HPMC與Cu(Ⅱ)-L-Arg形成二元手性選擇體系，D,L-Ser分離度提高。/sundae_mengD-絲氨酸