微米管表面CHA放大策略實(shí)現(xiàn)miRNA-21高靈敏檢測(cè)研究一、引言1.1miRNA-21檢測(cè)的意義癌癥，作為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康與生活質(zhì)量。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新發(fā)癌癥病例1929萬(wàn)例，癌癥死亡病例996萬(wàn)例。這一嚴(yán)峻的數(shù)據(jù)表明，癌癥已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，給家庭、社會(huì)和醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在癌癥的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估等關(guān)鍵環(huán)節(jié)中，腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)發(fā)揮著不可或缺的重要作用，為癌癥的精準(zhǔn)防控提供了關(guān)鍵的技術(shù)支撐。微小核糖核酸（miRNA），作為一類內(nèi)源性的小分子單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、代謝等多種重要的生物學(xué)過(guò)程中扮演著核心調(diào)控角色。它們通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，從而影響細(xì)胞的各種生理功能和病理進(jìn)程。大量的研究表明，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在癌癥領(lǐng)域，miRNA的失調(diào)被認(rèn)為是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制之一。miRNA-21，作為眾多miRNA中的一種，因其在多種癌癥中的顯著異常表達(dá)而備受關(guān)注，被公認(rèn)為是一種極具潛力的腫瘤標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等多種常見(jiàn)惡性腫瘤組織和體液中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲、預(yù)后等密切相關(guān)。例如，在乳腺癌中，miRNA-21的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)；在肺癌中，miRNA-21的異常上調(diào)參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡抵抗、遷移和侵襲等過(guò)程，并且與肺癌的分期、病理類型和患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。此外，miRNA-21還被報(bào)道在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等其他非腫瘤性疾病中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，進(jìn)一步凸顯了其在疾病診斷和治療中的重要價(jià)值。在癌癥的早期診斷方面，miRNA-21具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的癌癥診斷方法，如組織活檢、影像學(xué)檢查等，往往存在一定的局限性，如組織活檢屬于侵入性檢查，會(huì)給患者帶來(lái)痛苦和風(fēng)險(xiǎn)，且可能存在取樣誤差；影像學(xué)檢查對(duì)于早期癌癥的檢測(cè)靈敏度較低，容易漏診。而miRNA-21可以在血液、唾液、尿液等多種體液中穩(wěn)定存在，通過(guò)檢測(cè)這些體液中的miRNA-21水平，有望實(shí)現(xiàn)癌癥的早期無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)診斷，為患者的早期治療提供寶貴的時(shí)間窗。例如，研究人員通過(guò)對(duì)大量癌癥患者和健康對(duì)照者的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)血清中miRNA-21的表達(dá)水平在癌癥患者中顯著高于健康人群，且在癌癥的早期階段就已經(jīng)出現(xiàn)明顯變化，這表明miRNA-21可以作為一種潛在的早期癌癥診斷標(biāo)志物，用于癌癥的早期篩查和預(yù)警。在治療監(jiān)測(cè)方面，miRNA-21可以作為評(píng)估癌癥治療效果和監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。在癌癥治療過(guò)程中，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療等，患者體內(nèi)的miRNA-21水平會(huì)隨著治療的進(jìn)行而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miRNA-21的表達(dá)水平，可以及時(shí)了解腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)，評(píng)估治療效果，為臨床醫(yī)生調(diào)整治療方案提供重要依據(jù)。例如，在化療過(guò)程中，如果患者體內(nèi)的miRNA-21水平隨著化療的進(jìn)行逐漸下降，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感，治療效果較好；反之，如果miRNA-21水平持續(xù)升高或沒(méi)有明顯變化，則提示腫瘤細(xì)胞可能對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，需要及時(shí)更換治療方案。此外，miRNA-21還可以用于監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)情況。在癌癥患者經(jīng)過(guò)治療后達(dá)到臨床緩解期時(shí)，通過(guò)定期檢測(cè)miRNA-21的水平，可以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)跡象，及時(shí)采取干預(yù)措施，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。在預(yù)后評(píng)估方面，miRNA-21的表達(dá)水平與癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)。大量的臨床研究表明，高表達(dá)的miRNA-21通常預(yù)示著癌癥患者的不良預(yù)后，包括較短的無(wú)病生存期、總生存期和較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。通過(guò)檢測(cè)miRNA-21的表達(dá)水平，可以對(duì)癌癥患者的預(yù)后進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，為患者的個(gè)性化治療和隨訪管理提供重要參考。例如，對(duì)于miRNA-21高表達(dá)的癌癥患者，臨床醫(yī)生可以采取更加積極的治療策略，加強(qiáng)隨訪監(jiān)測(cè)，以降低患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，改善患者的預(yù)后。綜上所述，miRNA-21作為一種重要的腫瘤標(biāo)志物，在多種癌癥的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中具有關(guān)鍵作用，其檢測(cè)對(duì)于癌癥的精準(zhǔn)防控具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。然而，由于miRNA-21在生物樣本中的含量極低，且存在序列相似性高、易降解等特點(diǎn)，使得其高靈敏、高特異性檢測(cè)面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)一種高效、靈敏、特異的miRNA-21檢測(cè)方法具有迫切的現(xiàn)實(shí)需求和重要的科學(xué)意義，對(duì)于推動(dòng)癌癥的早期診斷和治療，改善患者的預(yù)后具有重要的推動(dòng)作用。1.2現(xiàn)有miRNA-21檢測(cè)方法概述目前，針對(duì)miRNA-21的檢測(cè)已發(fā)展出多種方法，這些方法各有優(yōu)劣，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮著不同的作用。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要包括定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、微陣列雜交和RNA印跡（Northernblotting）等，它們?cè)趍iRNA-21檢測(cè)的發(fā)展歷程中占據(jù)著重要地位，為后續(xù)新方法的開發(fā)提供了基礎(chǔ)和借鑒。qRT-PCR被廣泛認(rèn)為是miRNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，其原理是先將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的定量檢測(cè)。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的顯著優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測(cè)到極低豐度的miRNA-21，并且可以對(duì)其進(jìn)行精確的定量分析。這使得qRT-PCR在臨床診斷、基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，為疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供了重要的技術(shù)支持。然而，qRT-PCR也存在一些局限性。首先，其操作過(guò)程較為復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員和昂貴的儀器設(shè)備，這限制了其在一些資源有限的地區(qū)或基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。其次，該方法對(duì)樣本的質(zhì)量和完整性要求較高，樣本的提取、保存和處理過(guò)程中的任何不當(dāng)操作都可能影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，qRT-PCR只能檢測(cè)已知序列的miRNA-21，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的或序列未知的miRNA-21則無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。微陣列雜交技術(shù)則是將大量的寡核苷酸探針固定在芯片表面，與標(biāo)記后的miRNA樣本進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)分析miRNA-21的表達(dá)水平。該技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測(cè)，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本中的多種miRNA進(jìn)行分析，大大提高了檢測(cè)效率。這使得微陣列雜交技術(shù)在大規(guī)?；虮磉_(dá)譜分析、疾病標(biāo)志物篩選等研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。然而，微陣列雜交技術(shù)也存在一些不足之處。其靈敏度相對(duì)較低，對(duì)于低豐度表達(dá)的miRNA-21檢測(cè)效果不佳，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，該技術(shù)的重復(fù)性較差，不同批次實(shí)驗(yàn)之間的結(jié)果可能存在較大差異，這限制了其在臨床診斷中的應(yīng)用。而且，微陣列雜交技術(shù)需要使用預(yù)定義的miRNA探針庫(kù)，對(duì)于一些新發(fā)現(xiàn)的或未包含在探針庫(kù)中的miRNA-21則無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。RNA印跡是一種經(jīng)典的基于探針雜交技術(shù)的miRNA檢測(cè)方法，它不僅可以用來(lái)檢測(cè)成熟的miRNA-21，也可以檢測(cè)其前體。該方法的原理是先將RNA樣本進(jìn)行凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至固相膜上，與標(biāo)記后的探針進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)確定miRNA-21的存在和表達(dá)水平。RNA印跡法不需要擴(kuò)增，在檢測(cè)過(guò)程中序列中的堿基不發(fā)生改變，也不被修飾，因此其結(jié)果比較可靠，能夠直接反映miRNA-21的原始狀態(tài)。然而，RNA印跡法也存在諸多缺點(diǎn)。其靈敏度較低，檢測(cè)限通常在nmol/L～pmol/L之間，對(duì)于低豐度表達(dá)的miRNA-21難以檢測(cè)到。該方法為低通量檢測(cè)，一次只能檢測(cè)少量樣本，檢測(cè)效率較低。而且，RNA印跡法需要大量的RNA樣本，對(duì)于一些臨床樣本量有限的情況不太適用。此外，該方法只能對(duì)miRNA-21進(jìn)行半定量分析，無(wú)法精確確定其表達(dá)量，并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中RNA易降解，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求較高。隨著科技的不斷進(jìn)步，新興的miRNA-21檢測(cè)技術(shù)也不斷涌現(xiàn)，為解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性提供了新的思路和途徑。這些新興技術(shù)主要包括基于納米材料的檢測(cè)技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等，它們?cè)陟`敏度、特異性、操作簡(jiǎn)便性等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?；诩{米材料的檢測(cè)技術(shù)利用納米材料的獨(dú)特物理和化學(xué)性質(zhì)，如高比表面積、良好的導(dǎo)電性、熒光特性等，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的高靈敏檢測(cè)。例如，金納米粒子具有獨(dú)特的表面等離子體共振特性，其顏色會(huì)隨著周圍環(huán)境的變化而發(fā)生改變。當(dāng)金納米粒子與miRNA-21特異性結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致其表面等離子體共振發(fā)生變化，從而引起顏色的變化，通過(guò)肉眼或光譜儀即可對(duì)miRNA-21進(jìn)行檢測(cè)。這種基于金納米粒子的比色法檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、可視化等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。此外，量子點(diǎn)、碳納米管、石墨烯等納米材料也被廣泛應(yīng)用于miRNA-21的檢測(cè)中。量子點(diǎn)具有優(yōu)異的熒光性能，其熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、發(fā)射光譜窄且可通過(guò)改變組成和尺寸進(jìn)行調(diào)節(jié)，可作為熒光探針用于miRNA-21的檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。碳納米管和石墨烯具有良好的電學(xué)性能和生物相容性，可用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的電化學(xué)檢測(cè)，具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。然而，基于納米材料的檢測(cè)技術(shù)也面臨一些挑戰(zhàn)。納米材料的制備和修飾過(guò)程較為復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保其性能的穩(wěn)定性和重復(fù)性。此外，納米材料與生物分子的相互作用機(jī)制尚不完全清楚，可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，需要進(jìn)一步深入研究。核酸擴(kuò)增技術(shù)是通過(guò)對(duì)miRNA-21進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從而提高其檢測(cè)靈敏度的一類技術(shù)。常見(jiàn)的核酸擴(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）和催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)（CHA）等。LAMP技術(shù)是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，它利用一組特異性引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的快速擴(kuò)增。該技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)將靶核酸擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，大大提高了檢測(cè)靈敏度。而且，LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，可在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中應(yīng)用。RPA技術(shù)也是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶等在常溫下實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的擴(kuò)增。該技術(shù)具有擴(kuò)增速度快、靈敏度高、對(duì)樣本要求低等優(yōu)點(diǎn)，可在37℃左右的常溫條件下快速完成擴(kuò)增反應(yīng)，適用于各種復(fù)雜樣本的檢測(cè)。HCR技術(shù)是一種無(wú)酶核酸擴(kuò)增技術(shù)，它基于DNA鏈取代反應(yīng)，在靶分子的引發(fā)下，兩種DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)交替開環(huán)，自組裝形成包含大量重復(fù)單元的線性雙鏈DNA納米結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)酶參與、擴(kuò)增效率較高等優(yōu)點(diǎn)，可在等溫條件下進(jìn)行，避免了酶的使用帶來(lái)的一些問(wèn)題。CHA技術(shù)是在HCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種更高效、更靈敏的無(wú)酶信號(hào)放大技術(shù)。在CHA反應(yīng)中，靶標(biāo)觸發(fā)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)后并不會(huì)作為生成物的一部分參與后續(xù)延伸，而是會(huì)被重新釋放到體系中充當(dāng)“催化劑”繼續(xù)觸發(fā)下一段CHA反應(yīng)，產(chǎn)生更明顯的信號(hào)放大效果。無(wú)酶催化的CHA具有更高靈敏度和放大效率，在微量靶標(biāo)的檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。然而，核酸擴(kuò)增技術(shù)也存在一些問(wèn)題。例如，擴(kuò)增過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，需要對(duì)引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，以提高擴(kuò)增的特異性。此外，核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)反應(yīng)體系的要求較高，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，以確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。生物傳感器技術(shù)是將生物識(shí)別元件與物理或化學(xué)換能器相結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)生物分子之間的特異性相互作用產(chǎn)生的信號(hào)變化，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。常見(jiàn)的生物傳感器包括電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器、壓電傳感器等。電化學(xué)傳感器利用電極表面的生物分子與miRNA-21發(fā)生特異性結(jié)合后，引起電極表面電荷分布或電流、電位等電化學(xué)信號(hào)的變化，通過(guò)檢測(cè)這些信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。該傳感器具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)。光學(xué)傳感器則是利用光信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)miRNA-21，如熒光傳感器、表面等離子共振傳感器等。熒光傳感器通過(guò)標(biāo)記熒光基團(tuán)，當(dāng)熒光基團(tuán)與miRNA-21特異性結(jié)合后，熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度、波長(zhǎng)等變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。表面等離子共振傳感器則是利用金屬表面等離子體共振現(xiàn)象，當(dāng)miRNA-21與固定在金屬表面的探針特異性結(jié)合后，會(huì)引起金屬表面等離子體共振的變化，通過(guò)檢測(cè)這種變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。該傳感器具有靈敏度高、無(wú)需標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)miRNA-21的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。壓電傳感器則是利用壓電材料在受到壓力或應(yīng)力作用時(shí)產(chǎn)生電荷的特性，當(dāng)miRNA-21與固定在壓電材料表面的探針特異性結(jié)合后，會(huì)引起壓電材料表面質(zhì)量的變化，從而導(dǎo)致壓電信號(hào)的變化，通過(guò)檢測(cè)這些信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。生物傳感器技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在miRNA-21檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，生物傳感器技術(shù)也面臨一些挑戰(zhàn)。生物識(shí)別元件的穩(wěn)定性和特異性有待進(jìn)一步提高，以確保傳感器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。此外，傳感器的制備工藝和檢測(cè)方法還需要不斷優(yōu)化，以提高其檢測(cè)性能和可靠性。綜上所述，現(xiàn)有miRNA-21檢測(cè)方法在靈敏度、特異性、操作復(fù)雜度、檢測(cè)成本等方面存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法雖然技術(shù)成熟，但在靈敏度和操作簡(jiǎn)便性等方面存在一定的局限性；新興檢測(cè)技術(shù)雖然展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但仍面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)和問(wèn)題，需要進(jìn)一步的研究和優(yōu)化。因此，開發(fā)一種高效、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便且成本低廉的miRNA-21檢測(cè)方法仍然是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。1.3CHA放大方法及微米管在生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）是一種基于DNA鏈取代反應(yīng)的等溫信號(hào)放大技術(shù)，在HCR體系中，靶分子引發(fā)兩種DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)交替開環(huán)，自組裝形成包含大量重復(fù)單元的線性雙鏈DNA納米結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，其放大效率達(dá)10?-10?倍。催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)（CHA）則是在HCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種更為高效、靈敏的無(wú)酶信號(hào)放大技術(shù)。二者的主要區(qū)別在于，CHA反應(yīng)中靶標(biāo)觸發(fā)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)后并不會(huì)作為生成物的一部分參與后續(xù)延伸，而是會(huì)被重新釋放到體系中充當(dāng)“催化劑”繼續(xù)觸發(fā)下一段CHA反應(yīng)，產(chǎn)生更明顯的信號(hào)放大效果。在CHA反應(yīng)中，通常設(shè)計(jì)兩組具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)單鏈DNA探針。當(dāng)目標(biāo)核酸不存在時(shí)，兩組單鏈DNA均以發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在；而當(dāng)系統(tǒng)中存在目標(biāo)核酸時(shí)，在目標(biāo)核酸的催化作用下，兩組發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA探針會(huì)依次打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈。整個(gè)催化過(guò)程中并不消耗目標(biāo)核酸，目標(biāo)核酸促發(fā)兩組單鏈DNA探針形成雙鏈后，繼續(xù)進(jìn)入下一輪的反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的循環(huán)放大。例如，在檢測(cè)某種特定的miRNA時(shí)，將與該miRNA互補(bǔ)的一段DNA序列作為觸發(fā)鏈，當(dāng)體系中存在目標(biāo)miRNA時(shí)，miRNA與觸發(fā)鏈結(jié)合，打開第一個(gè)發(fā)夾探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后第二個(gè)發(fā)夾探針與第一個(gè)發(fā)夾探針的部分序列互補(bǔ)結(jié)合，依次類推，不斷循環(huán)，形成大量的雙鏈DNA產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)miRNA的信號(hào)放大檢測(cè)。CHA放大方法具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。首先，它是一種無(wú)酶催化的反應(yīng)，避免了酶的使用帶來(lái)的一些問(wèn)題，如酶的活性易受溫度、pH值等環(huán)境因素的影響，酶的保存和運(yùn)輸條件較為苛刻等。CHA反應(yīng)在等溫條件下即可進(jìn)行，無(wú)需復(fù)雜的溫度控制設(shè)備，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。其次，CHA反應(yīng)具有極高的靈敏度，能夠檢測(cè)到極低濃度的靶標(biāo)分子。這是由于靶標(biāo)分子在反應(yīng)中起到“催化劑”的作用，不斷循環(huán)觸發(fā)CHA反應(yīng)，使得信號(hào)得到極大程度的放大。研究表明，CHA技術(shù)能夠檢測(cè)到低至皮摩爾（pM）甚至飛摩爾（fM）級(jí)別的核酸分子，在微量靶標(biāo)的檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。此外，CHA反應(yīng)的特異性強(qiáng)，通過(guò)合理設(shè)計(jì)發(fā)夾探針的序列，可以使反應(yīng)高度特異性地識(shí)別目標(biāo)核酸分子，有效減少非特異性反應(yīng)的發(fā)生，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。由于這些優(yōu)勢(shì)，CHA放大方法在核酸檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在疾病診斷方面，CHA技術(shù)被用于多種疾病相關(guān)的核酸標(biāo)志物的檢測(cè)，如病毒核酸、腫瘤標(biāo)志物等。例如，在病毒檢測(cè)中，利用CHA技術(shù)可以快速、靈敏地檢測(cè)出病毒的核酸，為病毒感染的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中，CHA技術(shù)能夠檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNA、mRNA等核酸分子，有助于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。在生物傳感領(lǐng)域，CHA技術(shù)與各種傳感器相結(jié)合，如電化學(xué)傳感器、熒光傳感器、表面等離子共振傳感器等，構(gòu)建出高靈敏的生物傳感器。這些生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物分子的實(shí)時(shí)、原位檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。在基因表達(dá)分析方面，CHA技術(shù)可以用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)水平，為基因功能研究和疾病發(fā)病機(jī)制的探討提供了重要的技術(shù)手段。微米管作為一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的材料，在生物檢測(cè)領(lǐng)域也展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。微米管通常是指管徑在微米級(jí)別的管狀結(jié)構(gòu)，其管壁厚度可以在納米級(jí)到微米級(jí)之間。常見(jiàn)的微米管材料包括碳微米管、聚合物微米管、無(wú)機(jī)氧化物微米管等。碳微米管具有與碳納米管相似的管狀結(jié)構(gòu)，在保持納米級(jí)管壁厚度的同時(shí)，能擁有微米級(jí)的管徑，巨大的管壁外表面，相當(dāng)于一張微米級(jí)的石墨烯網(wǎng)狀膜，因此碳微米管能同時(shí)擁有碳納米管和石墨烯的獨(dú)特物理和化學(xué)性能。聚合物微米管則可以通過(guò)多種方法制備，如模板法、相分離法、靜電紡絲法等，其具有良好的生物相容性、可加工性和功能化特性。無(wú)機(jī)氧化物微米管如二氧化硅微米管、氧化鋅微米管等，具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性、光學(xué)性能和電學(xué)性能。微米管的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)使其在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有一系列突出的優(yōu)勢(shì)。首先，微米管具有較大的比表面積，能夠提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，有利于生物分子的吸附和固定。這使得微米管在生物傳感器的構(gòu)建中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以提高傳感器的靈敏度和檢測(cè)性能。其次，微米管的管狀結(jié)構(gòu)可以作為生物分子的傳輸通道，實(shí)現(xiàn)生物分子的定向傳輸和富集。例如，在微流控芯片中，微米管可以作為微通道，用于生物樣品的輸送和分離，提高分析效率。此外，微米管的尺寸和形狀可以精確控制，通過(guò)改變制備方法和工藝參數(shù)，可以制備出具有不同管徑、管壁厚度和長(zhǎng)度的微米管，以滿足不同生物檢測(cè)應(yīng)用的需求。微米管還可以進(jìn)行表面修飾，通過(guò)在其表面引入各種功能基團(tuán)，如氨基、羧基、巰基等，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的特異性識(shí)別和結(jié)合，進(jìn)一步提高其在生物檢測(cè)中的應(yīng)用性能。在實(shí)際應(yīng)用中，微米管在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域取得了一系列令人矚目的成果。在蛋白質(zhì)檢測(cè)方面，利用微米管的高比表面積和表面可修飾性，將特異性識(shí)別蛋白質(zhì)的抗體或適配體固定在微米管表面，構(gòu)建蛋白質(zhì)傳感器。當(dāng)樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)與微米管表面的識(shí)別分子結(jié)合時(shí)，會(huì)引起微米管表面物理或化學(xué)性質(zhì)的變化，通過(guò)檢測(cè)這些變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。在核酸檢測(cè)方面，微米管同樣發(fā)揮著重要作用。例如，將核酸探針固定在微米管表面，利用核酸雜交原理，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的特異性檢測(cè)。此外，微米管還可以作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的載體，將核酸擴(kuò)增試劑裝載到微米管內(nèi)，在微米管內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，提高擴(kuò)增效率和靈敏度。在細(xì)胞檢測(cè)方面，微米管可以用于細(xì)胞的捕獲、分離和分析。通過(guò)在微米管表面修飾細(xì)胞特異性識(shí)別分子，如細(xì)胞黏附分子、抗體等，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞的選擇性捕獲和分離。同時(shí)，微米管還可以作為細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境，模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝等過(guò)程。CHA放大方法以其獨(dú)特的信號(hào)放大機(jī)制和優(yōu)勢(shì)，在核酸檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值；微米管憑借其特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域取得了豐富的應(yīng)用成果。將CHA放大方法與微米管相結(jié)合，有望開發(fā)出更加高效、靈敏、特異的生物檢測(cè)技術(shù)，為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。1.4研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在開發(fā)一種基于微米管表面的CHA放大方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的高靈敏性檢測(cè)，以滿足癌癥早期診斷和治療監(jiān)測(cè)等臨床需求。具體研究目標(biāo)包括：構(gòu)建基于微米管表面的CHA反應(yīng)體系，優(yōu)化反應(yīng)條件，提高檢測(cè)靈敏度和特異性；利用微米管的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，結(jié)合CHA的信號(hào)放大優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度miRNA-21的高效檢測(cè)；將該方法應(yīng)用于實(shí)際生物樣本（如血清、細(xì)胞裂解液等）中miRNA-21的檢測(cè)，驗(yàn)證其在臨床診斷中的可行性和可靠性。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是首次將微米管與CHA放大方法相結(jié)合，利用微米管的大比表面積和良好的生物相容性，為CHA反應(yīng)提供更多的結(jié)合位點(diǎn)和穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)了信號(hào)放大效果，提高了檢測(cè)靈敏度；二是通過(guò)合理設(shè)計(jì)CHA反應(yīng)中的發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈，使其能夠特異性地識(shí)別miRNA-21，有效減少了非特異性反應(yīng)的干擾，提高了檢測(cè)的特異性；三是該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，有望實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為癌癥的早期診斷和基層醫(yī)療提供了新的技術(shù)手段。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miRNA-21的生物學(xué)特性2.1.1miRNA-21的結(jié)構(gòu)與功能miRNA-21是一種內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，其成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。在人類基因組中，miRNA-21基因位于17號(hào)染色體上（17q23.2），其編碼基因由3個(gè)外顯子組成。miRNA-21的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA-21）在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，長(zhǎng)度可達(dá)幾百到幾千個(gè)核苷酸。pri-miRNA-21具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在Drosha-DGCR8復(fù)合體的作用下，被切割成約70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA-21）。pre-miRNA-21通過(guò)Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在Dicer酶的作用下，進(jìn)一步切割成為成熟的miRNA-21。成熟的miRNA-21與AGO蛋白等形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），通過(guò)與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，或者在完全互補(bǔ)配對(duì)的情況下，介導(dǎo)靶mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA-21在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞增殖方面，研究表明miRNA-21可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，miRNA-21通過(guò)抑制程序性細(xì)胞死亡蛋白4（PDCD4）的表達(dá)，解除PDCD4對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miRNA-21則扮演著抗凋亡的角色。在神經(jīng)細(xì)胞中，miRNA-21通過(guò)靶向作用于富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（LRIG1），抑制LRIG1的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，miRNA-21同樣發(fā)揮著重要作用。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miRNA-21通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑3（TIMP3）的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，miRNA-21還參與了細(xì)胞的分化、代謝等多種生理過(guò)程，并且在不同的細(xì)胞類型和生理病理狀態(tài)下，其調(diào)控機(jī)制和作用靶點(diǎn)可能存在差異。例如，在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，miRNA-21通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等相關(guān)基因的表達(dá)，影響脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程。在心血管系統(tǒng)中，miRNA-21參與了心肌細(xì)胞的肥大、纖維化以及血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等過(guò)程，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.1.2miRNA-21在疾病中的異常表達(dá)大量的研究表明，miRNA-21在多種疾病中呈現(xiàn)出異常表達(dá)，尤其是在癌癥領(lǐng)域，其異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，miRNA-21的表達(dá)水平顯著升高，且與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞中的多個(gè)靶基因，如PDCD4、PTEN等，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。其中，PDCD4是一種腫瘤抑制因子，miRNA-21通過(guò)與PDCD4mRNA的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制其翻譯過(guò)程，從而解除PDCD4對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。PTEN則是一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白具有磷酸酶活性，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路。miRNA-21通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活、增殖和遷移。臨床研究表明，乳腺癌患者血清中miRNA-21的表達(dá)水平越高，患者的無(wú)病生存期和總生存期越短，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越高。在肺癌中，miRNA-21同樣高表達(dá)，并且與肺癌的分期、病理類型和患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，miRNA-21通過(guò)抑制多個(gè)靶基因，如TIMP3、RECK等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。TIMP3和RECK都是MMPs的抑制劑，miRNA-21通過(guò)抑制它們的表達(dá)，使得MMPs的活性增強(qiáng)，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)，為肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。此外，miRNA-21還參與了肺癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，影響肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，高表達(dá)的miRNA-21使得肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，降低了化療的療效。在結(jié)直腸癌中，miRNA-21的表達(dá)上調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miRNA-21通過(guò)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中的靶基因，如PDCD4、TIMP3等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在結(jié)直腸癌的早期階段，miRNA-21的表達(dá)水平就已經(jīng)開始升高，并且隨著腫瘤的進(jìn)展，其表達(dá)水平進(jìn)一步增加。臨床研究表明，結(jié)直腸癌患者血清中miRNA-21的表達(dá)水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評(píng)估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。除了上述癌癥類型外，miRNA-21在肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等多種癌癥中也呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，并且通過(guò)調(diào)控不同的靶基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程。例如，在肝癌中，miRNA-21通過(guò)抑制PTEN、SOCS3等靶基因，激活PI3K/AKT和JAK/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；在胰腺癌中，miRNA-21通過(guò)抑制TIMP3、PDCD4等靶基因，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且與胰腺癌的預(yù)后不良相關(guān)；在前列腺癌中，miRNA-21的表達(dá)水平升高與腫瘤的惡性程度增加和患者的預(yù)后不良相關(guān)；在胃癌中，miRNA-21通過(guò)抑制多個(gè)靶基因，如PTEN、RECK等，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，miRNA-21的異常表達(dá)還與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等非腫瘤性疾病密切相關(guān)。在心血管疾病中，miRNA-21參與了心肌梗死、心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在心肌梗死中，miRNA-21的表達(dá)水平在梗死心肌組織中顯著升高，通過(guò)抑制相關(guān)靶基因，如PTEN、PDCD4等，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡和纖維化，加重心肌損傷；在心肌肥大中，miRNA-21通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，如MEF2A、HDAC4等，促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大；在動(dòng)脈粥樣硬化中，miRNA-21通過(guò)抑制相關(guān)靶基因，如TIMP3、PTEN等，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miRNA-21參與了神經(jīng)退行性疾病、腦缺血等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在阿爾茨海默病中，miRNA-21的表達(dá)水平在患者的腦組織中發(fā)生改變，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，如APP、BACE1等，影響β-淀粉樣蛋白的生成和沉積，參與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制；在腦缺血中，miRNA-21的表達(dá)水平在缺血腦組織中升高，通過(guò)抑制相關(guān)靶基因，如PTEN、PDCD4等，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。在自身免疫性疾病中，miRNA-21參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，miRNA-21的表達(dá)水平在患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中升高，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，如PDCD4、SOCS1等，影響免疫細(xì)胞的功能和炎癥反應(yīng)，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制；在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，miRNA-21的表達(dá)水平在患者的滑膜組織中升高，通過(guò)抑制相關(guān)靶基因，如TIMP3、PTEN等，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)，加重關(guān)節(jié)損傷。miRNA-21作為一種重要的分子標(biāo)志物，其在多種疾病中的異常表達(dá)及作用機(jī)制的研究，為疾病的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路和靶點(diǎn)。2.2CHA放大方法原理2.2.1CHA反應(yīng)的基本過(guò)程CHA反應(yīng)是一種基于核酸自組裝的等溫信號(hào)放大技術(shù)，其基本原理基于精心設(shè)計(jì)的兩條發(fā)夾狀寡核苷酸和一條鏈狀寡核苷酸之間的相互作用。具體過(guò)程如下：如圖1所示，首先設(shè)計(jì)兩條發(fā)夾狀寡核苷酸探針，分別為發(fā)夾1（Hairpin1，HP1）和發(fā)夾2（Hairpin2，HP2），以及一條與HP1和HP2部分序列互補(bǔ)的鏈狀寡核苷酸，即觸發(fā)鏈（Triggerstrand，T）。在沒(méi)有目標(biāo)核酸存在時(shí)，HP1和HP2均以穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在。HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)由一段雙鏈莖區(qū)和一個(gè)單鏈環(huán)區(qū)組成，雙鏈莖區(qū)中的堿基通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，而單鏈環(huán)區(qū)則暴露在外。HP2的結(jié)構(gòu)與HP1類似，也具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)體系中存在目標(biāo)核酸時(shí)，目標(biāo)核酸與觸發(fā)鏈T特異性結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。由于雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T與HP1的結(jié)合導(dǎo)致HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，原本雙鏈莖區(qū)的堿基對(duì)解開，單鏈環(huán)區(qū)也發(fā)生構(gòu)象變化。此時(shí)，HP1的部分序列暴露出來(lái)，與HP2的部分序列互補(bǔ)。HP2通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與打開后的HP1結(jié)合，形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)。在這個(gè)過(guò)程中，觸發(fā)鏈T被釋放出來(lái)，重新進(jìn)入體系中。釋放出來(lái)的觸發(fā)鏈T又可以與另一個(gè)HP1分子結(jié)合，重復(fù)上述過(guò)程，即觸發(fā)鏈T與HP1結(jié)合打開HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，HP2與打開后的HP1結(jié)合形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T再次被釋放。如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。在這個(gè)過(guò)程中，每一個(gè)觸發(fā)鏈T分子可以反復(fù)參與反應(yīng)，催化多個(gè)HP1和HP2分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生大量的HP1-HP2雙鏈產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的信號(hào)放大檢測(cè)。如圖1所示，首先設(shè)計(jì)兩條發(fā)夾狀寡核苷酸探針，分別為發(fā)夾1（Hairpin1，HP1）和發(fā)夾2（Hairpin2，HP2），以及一條與HP1和HP2部分序列互補(bǔ)的鏈狀寡核苷酸，即觸發(fā)鏈（Triggerstrand，T）。在沒(méi)有目標(biāo)核酸存在時(shí)，HP1和HP2均以穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在。HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)由一段雙鏈莖區(qū)和一個(gè)單鏈環(huán)區(qū)組成，雙鏈莖區(qū)中的堿基通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，而單鏈環(huán)區(qū)則暴露在外。HP2的結(jié)構(gòu)與HP1類似，也具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)體系中存在目標(biāo)核酸時(shí)，目標(biāo)核酸與觸發(fā)鏈T特異性結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。由于雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T與HP1的結(jié)合導(dǎo)致HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，原本雙鏈莖區(qū)的堿基對(duì)解開，單鏈環(huán)區(qū)也發(fā)生構(gòu)象變化。此時(shí)，HP1的部分序列暴露出來(lái)，與HP2的部分序列互補(bǔ)。HP2通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與打開后的HP1結(jié)合，形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)。在這個(gè)過(guò)程中，觸發(fā)鏈T被釋放出來(lái)，重新進(jìn)入體系中。釋放出來(lái)的觸發(fā)鏈T又可以與另一個(gè)HP1分子結(jié)合，重復(fù)上述過(guò)程，即觸發(fā)鏈T與HP1結(jié)合打開HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，HP2與打開后的HP1結(jié)合形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T再次被釋放。如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。在這個(gè)過(guò)程中，每一個(gè)觸發(fā)鏈T分子可以反復(fù)參與反應(yīng)，催化多個(gè)HP1和HP2分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生大量的HP1-HP2雙鏈產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的信號(hào)放大檢測(cè)。當(dāng)體系中存在目標(biāo)核酸時(shí)，目標(biāo)核酸與觸發(fā)鏈T特異性結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。由于雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T與HP1的結(jié)合導(dǎo)致HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，原本雙鏈莖區(qū)的堿基對(duì)解開，單鏈環(huán)區(qū)也發(fā)生構(gòu)象變化。此時(shí)，HP1的部分序列暴露出來(lái)，與HP2的部分序列互補(bǔ)。HP2通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與打開后的HP1結(jié)合，形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)。在這個(gè)過(guò)程中，觸發(fā)鏈T被釋放出來(lái)，重新進(jìn)入體系中。釋放出來(lái)的觸發(fā)鏈T又可以與另一個(gè)HP1分子結(jié)合，重復(fù)上述過(guò)程，即觸發(fā)鏈T與HP1結(jié)合打開HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，HP2與打開后的HP1結(jié)合形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T再次被釋放。如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。在這個(gè)過(guò)程中，每一個(gè)觸發(fā)鏈T分子可以反復(fù)參與反應(yīng)，催化多個(gè)HP1和HP2分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生大量的HP1-HP2雙鏈產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的信號(hào)放大檢測(cè)。釋放出來(lái)的觸發(fā)鏈T又可以與另一個(gè)HP1分子結(jié)合，重復(fù)上述過(guò)程，即觸發(fā)鏈T與HP1結(jié)合打開HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，HP2與打開后的HP1結(jié)合形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)，觸發(fā)鏈T再次被釋放。如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。在這個(gè)過(guò)程中，每一個(gè)觸發(fā)鏈T分子可以反復(fù)參與反應(yīng)，催化多個(gè)HP1和HP2分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生大量的HP1-HP2雙鏈產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的信號(hào)放大檢測(cè)。[此處插入CHA反應(yīng)原理示意圖]以檢測(cè)miRNA-21為例，假設(shè)觸發(fā)鏈T與miRNA-21的部分序列互補(bǔ)。當(dāng)體系中存在miRNA-21時(shí)，miRNA-21與觸發(fā)鏈T結(jié)合，觸發(fā)鏈T從原本的單鏈狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榕cmiRNA-21形成雙鏈的狀態(tài)。這個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)與HP1的部分序列互補(bǔ)，從而使HP1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開。打開后的HP1暴露出與HP2互補(bǔ)的序列，HP2與HP1結(jié)合，形成HP1-HP2雙鏈結(jié)構(gòu)。在這個(gè)過(guò)程中，miRNA-21始終保持完整，并沒(méi)有參與到最終的雙鏈產(chǎn)物中，而是不斷地觸發(fā)新的CHA反應(yīng)循環(huán)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，越來(lái)越多的HP1和HP2形成雙鏈結(jié)構(gòu)，體系中的信號(hào)得到不斷放大。通過(guò)檢測(cè)這些雙鏈產(chǎn)物的量，就可以間接檢測(cè)出miRNA-21的含量。2.2.2CHA放大的優(yōu)勢(shì)與局限性CHA放大方法在生物檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢(shì)，為核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了新的突破。首先，CHA反應(yīng)無(wú)需酶的參與，避免了酶催化反應(yīng)中常見(jiàn)的一些問(wèn)題。酶的活性通常對(duì)反應(yīng)條件極為敏感，溫度、pH值等環(huán)境因素的微小變化都可能導(dǎo)致酶活性的降低甚至失活，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。酶的制備、保存和運(yùn)輸也需要較為苛刻的條件，增加了檢測(cè)成本和操作難度。而CHA反應(yīng)在等溫條件下即可進(jìn)行，一般在室溫或接近室溫的條件下就能順利發(fā)生，無(wú)需復(fù)雜的溫度控制設(shè)備，這使得檢測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)便、快捷，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。其次，CHA反應(yīng)具有極高的靈敏度。在CHA反應(yīng)中，靶標(biāo)分子作為“催化劑”，不斷循環(huán)觸發(fā)反應(yīng)，使得信號(hào)得到極大程度的放大。研究表明，CHA技術(shù)能夠檢測(cè)到低至皮摩爾（pM）甚至飛摩爾（fM）級(jí)別的核酸分子，在微量靶標(biāo)的檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。這種高靈敏度使得CHA放大方法在早期疾病診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠檢測(cè)到生物樣本中極低含量的疾病相關(guān)核酸標(biāo)志物，為疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供了有力的技術(shù)支持。此外，CHA反應(yīng)的特異性強(qiáng)。通過(guò)合理設(shè)計(jì)發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈的序列，可以使反應(yīng)高度特異性地識(shí)別目標(biāo)核酸分子。發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈的序列與目標(biāo)核酸分子之間的互補(bǔ)配對(duì)是基于嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，只有當(dāng)目標(biāo)核酸分子的序列與設(shè)計(jì)的探針和觸發(fā)鏈完全匹配或高度匹配時(shí)，才能有效地觸發(fā)CHA反應(yīng)，形成大量的雙鏈產(chǎn)物。而對(duì)于非目標(biāo)核酸分子，由于其序列與探針和觸發(fā)鏈不互補(bǔ)或互補(bǔ)性較低，難以觸發(fā)反應(yīng)，從而有效減少了非特異性反應(yīng)的發(fā)生，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。然而，CHA放大方法也存在一些局限性。在復(fù)雜樣本檢測(cè)方面，CHA反應(yīng)面臨一定的挑戰(zhàn)。生物樣本，如血清、細(xì)胞裂解液等，成分復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂質(zhì)等生物分子，這些物質(zhì)可能會(huì)干擾CHA反應(yīng)的進(jìn)行。樣本中的一些雜質(zhì)可能會(huì)與發(fā)夾探針或觸發(fā)鏈非特異性結(jié)合，影響它們與目標(biāo)核酸分子的相互作用，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。樣本中的某些酶或其他生物活性物質(zhì)也可能會(huì)降解發(fā)夾探針或觸發(fā)鏈，破壞CHA反應(yīng)體系，降低檢測(cè)的可靠性。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要對(duì)復(fù)雜樣本進(jìn)行預(yù)處理，去除雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，以保證CHA反應(yīng)的順利進(jìn)行。CHA反應(yīng)條件的優(yōu)化也較為復(fù)雜。雖然CHA反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，但反應(yīng)的效率和特異性受到多種因素的影響，如發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、離子強(qiáng)度等。這些因素之間相互關(guān)聯(lián)，需要進(jìn)行精細(xì)的優(yōu)化和調(diào)整，才能獲得最佳的檢測(cè)效果。不同的目標(biāo)核酸分子和樣本類型可能需要不同的反應(yīng)條件，這增加了實(shí)驗(yàn)操作的難度和復(fù)雜性。在檢測(cè)不同類型的miRNA時(shí)，可能需要對(duì)發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈的序列、濃度以及反應(yīng)條件進(jìn)行重新優(yōu)化，以確保檢測(cè)的靈敏度和特異性。此外，CHA反應(yīng)體系中的副反應(yīng)也可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。在反應(yīng)過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)發(fā)夾探針自身的聚集、非特異性雜交等副反應(yīng)，這些副反應(yīng)會(huì)消耗發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈，降低反應(yīng)效率，同時(shí)也可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，需要對(duì)CHA反應(yīng)體系進(jìn)行深入研究，優(yōu)化反應(yīng)條件，減少副反應(yīng)的發(fā)生。2.3微米管的特性及在生物檢測(cè)中的應(yīng)用原理2.3.1微米管的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)微米管通常是指管徑處于微米量級(jí)的管狀結(jié)構(gòu)，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它許多優(yōu)異的性質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，微米管的管徑一般在1-100μm之間，管壁厚度則可以在納米級(jí)到微米級(jí)之間調(diào)控。以常見(jiàn)的碳微米管為例，它具有與碳納米管相似的管狀結(jié)構(gòu)，在保持納米級(jí)管壁厚度的同時(shí)，能擁有微米級(jí)的管徑，其巨大的管壁外表面，相當(dāng)于一張微米級(jí)的石墨烯網(wǎng)狀膜。這種結(jié)構(gòu)使得碳微米管能同時(shí)擁有碳納米管和石墨烯的獨(dú)特物理和化學(xué)性能。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）等技術(shù)對(duì)碳微米管進(jìn)行觀察，可以清晰地看到其規(guī)整的管狀結(jié)構(gòu)，管壁由一層或多層石墨烯片卷曲而成，管腔呈現(xiàn)出中空狀態(tài)。聚合物微米管也是常見(jiàn)的微米管類型之一，它可以通過(guò)多種方法制備，如模板法、相分離法、靜電紡絲法等。以模板法制備聚合物微米管為例，首先需要制備一個(gè)模板，如納米顆粒、納米線等，然后將聚合物溶液涂覆在模板表面，經(jīng)過(guò)固化、去除模板等步驟，即可得到聚合物微米管。這種方法制備的聚合物微米管管徑和管壁厚度可以通過(guò)控制模板的尺寸和聚合物溶液的濃度等參數(shù)來(lái)精確調(diào)節(jié)。通過(guò)原子力顯微鏡（AFM）對(duì)聚合物微米管進(jìn)行表征，可以得到其表面形貌和粗糙度等信息，進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。微米管具有大比表面積的特性，這是其在生物檢測(cè)中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵因素之一。大比表面積使得微米管能夠提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，有利于生物分子的吸附和固定。例如，在構(gòu)建生物傳感器時(shí)，將特異性識(shí)別生物分子的抗體、適配體等固定在微米管表面，由于微米管的大比表面積，能夠固定更多的識(shí)別分子，從而提高傳感器對(duì)目標(biāo)生物分子的捕獲能力，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。研究表明，相比于普通的平面材料，微米管的比表面積可以提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍，大大增加了其與生物分子的相互作用面積。良好的生物相容性也是微米管的重要性質(zhì)之一。生物相容性是指材料與生物體之間相互作用的和諧程度，包括細(xì)胞毒性、免疫原性等方面。微米管在生物檢測(cè)中需要與生物樣本直接接觸，因此其生物相容性至關(guān)重要。許多研究表明，碳微米管、聚合物微米管等在與細(xì)胞、組織等生物體系接觸時(shí)，不會(huì)對(duì)生物體系產(chǎn)生明顯的毒性和免疫反應(yīng)。例如，將聚合物微米管與細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞活力檢測(cè)、細(xì)胞形態(tài)觀察等方法發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在聚合物微米管表面能夠正常生長(zhǎng)、增殖，說(shuō)明聚合物微米管具有良好的生物相容性。這使得微米管可以安全地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，為生物分子的檢測(cè)提供了可靠的載體。微米管還具有可修飾性，這為其在生物檢測(cè)中的應(yīng)用提供了更多的可能性。通過(guò)各種化學(xué)修飾方法，可以在微米管表面引入不同的功能基團(tuán)，如氨基（-NH?）、羧基（-COOH）、巰基（-SH）等。這些功能基團(tuán)可以與生物分子發(fā)生特異性的化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)生物分子在微米管表面的定向固定和特異性識(shí)別。例如，利用羧基與氨基之間的縮合反應(yīng)，可以將含有氨基的抗體固定在表面修飾有羧基的微米管上，制備出具有特異性識(shí)別能力的生物傳感器。此外，還可以通過(guò)在微米管表面修飾熒光基團(tuán)、納米粒子等，賦予微米管新的功能，如熒光檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)等功能，進(jìn)一步拓展其在生物檢測(cè)中的應(yīng)用范圍。2.3.2微米管在生物分子檢測(cè)中的作用機(jī)制在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域，微米管主要通過(guò)吸附、固定生物分子，提供反應(yīng)界面，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)等機(jī)制發(fā)揮作用。以蛋白質(zhì)檢測(cè)為例，微米管的大比表面積使其能夠吸附大量的蛋白質(zhì)分子。研究表明，在一定條件下，碳微米管對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的吸附量可達(dá)到毫克級(jí)。當(dāng)微米管表面修飾有與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的分子，如抗體或適配體時(shí)，這種吸附作用就具有了特異性?？贵w或適配體與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合，使得目標(biāo)蛋白質(zhì)能夠被選擇性地固定在微米管表面。在檢測(cè)人免疫球蛋白G（IgG）時(shí)，將抗IgG抗體固定在聚合物微米管表面，抗IgG抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合IgG，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)IgG的捕獲和固定。微米管的管狀結(jié)構(gòu)為生物分子提供了一個(gè)獨(dú)特的反應(yīng)界面。在這個(gè)界面上，生物分子之間的反應(yīng)可以更加高效地進(jìn)行。在核酸雜交反應(yīng)中，將核酸探針固定在微米管表面，當(dāng)含有目標(biāo)核酸的樣本與微米管接觸時(shí)，目標(biāo)核酸與探針之間的雜交反應(yīng)在微米管表面進(jìn)行。由于微米管表面的空間限制和分子富集作用，雜交反應(yīng)的速率和效率都得到了提高。研究發(fā)現(xiàn)，相比于在溶液中進(jìn)行的核酸雜交反應(yīng)，在微米管表面進(jìn)行的雜交反應(yīng)速度更快，雜交信號(hào)更強(qiáng)。這是因?yàn)槲⒚坠鼙砻娴暮怂崽结槤舛认鄬?duì)較高，增加了與目標(biāo)核酸碰撞的機(jī)會(huì)，同時(shí)微米管表面的微環(huán)境也有利于雜交反應(yīng)的進(jìn)行。微米管還能夠增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。在電化學(xué)檢測(cè)中，微米管的良好導(dǎo)電性可以作為電極材料，促進(jìn)電子的傳輸，從而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。以二氧化鈦微米管修飾的電化學(xué)傳感器檢測(cè)葡萄糖為例，二氧化鈦微米管具有良好的電化學(xué)活性和導(dǎo)電性，能夠加速葡萄糖氧化過(guò)程中的電子轉(zhuǎn)移，提高傳感器的響應(yīng)電流。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，使用二氧化鈦微米管修飾的電極對(duì)葡萄糖的檢測(cè)靈敏度比普通電極提高了數(shù)倍。在熒光檢測(cè)中，將熒光基團(tuán)修飾在微米管表面，當(dāng)目標(biāo)生物分子與微米管結(jié)合時(shí)，熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)這種變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)。由于微米管的大比表面積可以固定更多的熒光基團(tuán)，使得熒光信號(hào)得到增強(qiáng)，從而提高了檢測(cè)靈敏度。研究表明，利用熒光標(biāo)記的微米管檢測(cè)DNA時(shí)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到納摩爾級(jí)甚至更低。三、基于微米管表面的CHA放大方法構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器3.1.1材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用的微米管為碳微米管，購(gòu)自[具體供應(yīng)商名稱]，其管徑約為5-10μm，管壁厚度在50-100nm之間。這種碳微米管具有大比表面積、良好的導(dǎo)電性和生物相容性，適合作為生物分子固定和反應(yīng)的載體。用于CHA反應(yīng)的寡核苷酸序列由[公司名稱]合成并經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化。其中，發(fā)夾探針1（HP1）序列為：5’-TCCGAGTCCTCAGTCTCCGAGTCCTCAGTC-3’；發(fā)夾探針2（HP2）序列為：5’-GACTGAGGACTCGGAGACTGAGGACTCGGA-3’；觸發(fā)鏈（T）序列為：5’-GACTGAGGACTCGGA-3’。這些寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)基于對(duì)miRNA-21序列的分析，確保能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合miRNA-21，觸發(fā)CHA反應(yīng)。與miRNA-21互補(bǔ)的探針序列為：5’-ACACTCTATCCATGGCAGTCA-3’，用于捕獲樣本中的miRNA-21。緩沖液方面，采用10×Tris-HCl緩沖液（pH8.0），用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，維持反應(yīng)環(huán)境的穩(wěn)定。該緩沖液購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，使用時(shí)按照1:10的比例稀釋成1×Tris-HCl緩沖液。此外，還使用了1×磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），用于清洗和稀釋樣本及試劑。PBS緩沖液由NaCl、KCl、Na?HPO?和KH?PO?等試劑按照一定比例配制而成，具體配方為：NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，Na?HPO?1.44g/L，KH?PO?0.24g/L。實(shí)驗(yàn)中使用的酶為T4DNA連接酶，購(gòu)自[酶供應(yīng)商名稱]，其作用是在CHA反應(yīng)中催化寡核苷酸鏈之間的連接，促進(jìn)雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。修飾試劑選用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），用于對(duì)微米管表面進(jìn)行活化修飾，使其能夠與寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合。NHS和EDC均購(gòu)自[化學(xué)試劑供應(yīng)商名稱]。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由超純水系統(tǒng)制備，電阻率大于18.2MΩ?cm，用于配制各種溶液和清洗實(shí)驗(yàn)器材，以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不受雜質(zhì)的干擾。3.1.2儀器設(shè)備離心機(jī)采用[離心機(jī)型號(hào)]，購(gòu)自[離心機(jī)生產(chǎn)廠家]，其主要功能是用于分離和沉淀樣品中的固體和液體成分。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)離心操作可以將微米管與溶液分離，去除未結(jié)合的試劑和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)速范圍為0-15000rpm，最大離心力可達(dá)20000×g。恒溫孵育器選用[恒溫孵育器型號(hào)]，能夠精確控制溫度，溫度范圍為室溫-99℃，精度可達(dá)±0.1℃。在CHA反應(yīng)過(guò)程中，將反應(yīng)體系置于恒溫孵育器中，保持反應(yīng)溫度恒定，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。熒光檢測(cè)儀為[熒光檢測(cè)儀型號(hào)]，購(gòu)自[儀器制造商]，用于檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)定量分析miRNA-21的含量。該儀器具有高靈敏度和寬動(dòng)態(tài)范圍，能夠檢測(cè)到低至皮摩爾級(jí)別的熒光信號(hào)。PCR儀選用[PCR儀型號(hào)]，主要用于對(duì)寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增和退火處理。在實(shí)驗(yàn)中，利用PCR儀的精確溫度控制功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)寡核苷酸的高效擴(kuò)增和準(zhǔn)確退火，確保寡核苷酸的質(zhì)量和活性。其溫度控制范圍為4-99℃，升降溫速率快，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)溫度變化的要求。掃描電子顯微鏡（SEM）型號(hào)為[SEM型號(hào)]，來(lái)自[SEM生產(chǎn)廠家]，用于觀察微米管的表面形貌和結(jié)構(gòu)。通過(guò)SEM成像，可以清晰地看到微米管的管徑、管壁厚度以及表面的修飾情況，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供直觀的圖像信息。其分辨率可達(dá)納米級(jí)，能夠提供高清晰度的微觀圖像。透射電子顯微鏡（TEM）選用[TEM型號(hào)]，同樣用于觀察微米管的微觀結(jié)構(gòu)。TEM能夠提供更詳細(xì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，如管壁的層狀結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的納米級(jí)特征。在本實(shí)驗(yàn)中，TEM用于對(duì)微米管的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，以優(yōu)化微米管的制備和修飾工藝。其分辨率可達(dá)亞納米級(jí)，能夠觀察到微米管內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。3.2微米管的預(yù)處理與修飾3.2.1微米管的清洗與活化在使用微米管之前，需對(duì)其進(jìn)行清洗以去除表面雜質(zhì)，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。將購(gòu)買的碳微米管置于50mL的離心管中，加入適量的無(wú)水乙醇，超聲振蕩30分鐘。超聲處理能夠產(chǎn)生高頻機(jī)械振動(dòng)，使微米管表面的雜質(zhì)在這種振動(dòng)作用下脫離微米管表面，分散到乙醇溶液中。無(wú)水乙醇具有良好的溶解性和揮發(fā)性，能夠有效溶解并帶走微米管表面的有機(jī)雜質(zhì)。超聲結(jié)束后，將離心管放入離心機(jī)中，以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。在離心力的作用下，微米管沉淀在離心管底部，而含有雜質(zhì)的乙醇溶液則位于上層。小心吸去上層清液，再向離心管中加入適量的超純水，重復(fù)超聲振蕩和離心操作2-3次，以徹底去除微米管表面殘留的乙醇和雜質(zhì)。超純水的使用是為了避免引入新的雜質(zhì)，確保微米管表面的純凈度。清洗后的微米管需要進(jìn)行活化處理，以增加其表面的活性基團(tuán)，提高與寡核苷酸的結(jié)合能力。將清洗后的微米管分散在5mL的10mMEDC和20mMNHS混合溶液中。EDC和NHS在溶液中能夠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，EDC作為一種碳二亞胺類化合物，能夠與羧基反應(yīng)，形成活性中間體，而NHS則可以與活性中間體結(jié)合，形成穩(wěn)定的N-羥基琥珀酰亞胺酯。碳微米管表面通常含有少量的羧基等活性基團(tuán)，在EDC和NHS的作用下，這些羧基被活化，形成更易于與氨基等基團(tuán)反應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺酯。將混合溶液在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，使微米管表面的羧基充分活化。攪拌能夠使微米管與混合溶液充分接觸，確保活化反應(yīng)均勻進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心（8000rpm，10分鐘）去除上清液，再用超純水洗滌微米管3-4次，以去除未反應(yīng)的EDC、NHS和反應(yīng)副產(chǎn)物。此時(shí)，微米管表面已被活化，具備了與寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合的能力。3.2.2寡核苷酸在微米管表面的固定采用共價(jià)鍵結(jié)合的方式將用于CHA反應(yīng)的寡核苷酸固定在微米管表面。將活化后的微米管分散在含有10μM與miRNA-21互補(bǔ)的探針溶液中。該探針的5’端修飾有氨基，與微米管表面活化后的羧基能夠發(fā)生反應(yīng)。在溶液中，探針?lè)肿拥陌被c微米管表面的N-羥基琥珀酰亞胺酯發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。將混合溶液在37℃下孵育12小時(shí)，孵育過(guò)程中，反應(yīng)體系中的分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，有利于探針?lè)肿优c微米管表面的活性基團(tuán)充分接觸并發(fā)生反應(yīng)。為了確保反應(yīng)的充分進(jìn)行，可在孵育過(guò)程中進(jìn)行輕柔的振蕩。振蕩能夠使微米管在溶液中均勻分散，增加探針?lè)肿优c微米管表面的碰撞幾率。孵育結(jié)束后，通過(guò)離心（8000rpm，10分鐘）去除未結(jié)合的探針。再用1×PBS緩沖液洗滌微米管3-4次，以去除吸附在微米管表面的未反應(yīng)探針和雜質(zhì)。此時(shí)，與miRNA-21互補(bǔ)的探針已成功固定在微米管表面。為了驗(yàn)證寡核苷酸在微米管表面的固定效果，可采用熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將熒光標(biāo)記的與miRNA-21互補(bǔ)的探針按照上述方法固定在微米管表面。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，若能在微米管表面觀察到明顯的熒光信號(hào)，則表明寡核苷酸已成功固定在微米管表面。也可以通過(guò)測(cè)定固定前后溶液中熒光強(qiáng)度的變化來(lái)間接驗(yàn)證固定效果。若固定后溶液中的熒光強(qiáng)度顯著降低，說(shuō)明寡核苷酸已大量固定在微米管表面。3.3CHA反應(yīng)體系的優(yōu)化3.3.1寡核苷酸序列設(shè)計(jì)與篩選依據(jù)miRNA-21的序列和CHA反應(yīng)原理，對(duì)寡核苷酸序列進(jìn)行精心設(shè)計(jì)與篩選。首先，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，深入了解miRNA-21的序列信息及其二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。利用在線生物信息學(xué)工具，如RNAfold等，預(yù)測(cè)miRNA-21的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析其可能的堿基配對(duì)情況和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)多組發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈序列。發(fā)夾探針的設(shè)計(jì)需要考慮多個(gè)因素。莖部的長(zhǎng)度和堿基組成會(huì)影響發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，一般來(lái)說(shuō)，莖部長(zhǎng)度在10-20個(gè)堿基對(duì)之間較為合適。莖部堿基的GC含量也需要控制在一定范圍內(nèi)，通常GC含量在40%-60%之間，以保證發(fā)夾結(jié)構(gòu)既具有足夠的穩(wěn)定性，又能在目標(biāo)核酸存在時(shí)順利打開。環(huán)部的長(zhǎng)度和序列則需要根據(jù)與目標(biāo)核酸的互補(bǔ)情況進(jìn)行設(shè)計(jì)，確保環(huán)部序列能夠與目標(biāo)核酸特異性結(jié)合，同時(shí)避免環(huán)部過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短導(dǎo)致的結(jié)合效率降低或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。例如，設(shè)計(jì)發(fā)夾探針HP1時(shí)，其莖部長(zhǎng)度設(shè)定為15個(gè)堿基對(duì)，GC含量為50%，環(huán)部長(zhǎng)度為8個(gè)堿基，序列與miRNA-21的部分序列互補(bǔ)。發(fā)夾探針HP2的設(shè)計(jì)同樣遵循上述原則，與HP1形成互補(bǔ)配對(duì)。觸發(fā)鏈的設(shè)計(jì)則需要與miRNA-21和發(fā)夾探針的序列高度互補(bǔ)，以確保能夠有效地觸發(fā)CHA反應(yīng)。觸發(fā)鏈的長(zhǎng)度一般在15-30個(gè)堿基之間，既要保證與miRNA-21和發(fā)夾探針有足夠的互補(bǔ)區(qū)域，又要避免過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的反應(yīng)效率降低。在設(shè)計(jì)觸發(fā)鏈時(shí)，還需要考慮其與發(fā)夾探針結(jié)合后的熱力學(xué)穩(wěn)定性，通過(guò)計(jì)算結(jié)合自由能等參數(shù)，評(píng)估觸發(fā)鏈與發(fā)夾探針結(jié)合的可行性和穩(wěn)定性。例如，設(shè)計(jì)的觸發(fā)鏈T長(zhǎng)度為20個(gè)堿基，與miRNA-21和發(fā)夾探針的互補(bǔ)區(qū)域均在15個(gè)堿基以上，結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果表明其與發(fā)夾探針結(jié)合具有較高的穩(wěn)定性。設(shè)計(jì)好多組寡核苷酸序列后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行篩選。采用熒光標(biāo)記的方法，將熒光基團(tuán)（如FAM、TAMRA等）標(biāo)記在發(fā)夾探針或觸發(fā)鏈上。將不同組的寡核苷酸序列與已知濃度的miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行CHA反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。以熒光信號(hào)強(qiáng)度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)的寡核苷酸序列作為最佳序列。熒光信號(hào)強(qiáng)度越強(qiáng)，說(shuō)明CHA反應(yīng)的效率越高，寡核苷酸序列與miRNA-21的結(jié)合特異性和反應(yīng)活性越好。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所選序列的特異性，進(jìn)行了特異性實(shí)驗(yàn)。將最佳序列與miRNA-21及其類似物（如miRNA-155、miRNA-122等）進(jìn)行反應(yīng)，只有與miRNA-21反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，與其他類似物反應(yīng)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度極低，表明所選序列具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別miRNA-21。3.3.2反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)影響CHA反應(yīng)效率和信號(hào)放大效果的多個(gè)因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以確定最佳反應(yīng)條件。首先研究溫度對(duì)CHA反應(yīng)的影響。設(shè)置不同的反應(yīng)溫度，包括25℃、30℃、37℃、42℃等。將含有固定濃度的miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品、最佳寡核苷酸序列以及其他反應(yīng)試劑的反應(yīng)體系分別置于不同溫度的恒溫孵育器中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在37℃時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，CHA反應(yīng)效率最高。這是因?yàn)?7℃接近生物體內(nèi)的溫度，在這個(gè)溫度下，寡核苷酸分子的熱運(yùn)動(dòng)較為活躍，有利于發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈與miRNA-21的結(jié)合以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開和雙鏈的形成。而在較低溫度下，分子熱運(yùn)動(dòng)減緩，反應(yīng)速率降低；在較高溫度下，寡核苷酸的結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到破壞，導(dǎo)致反應(yīng)效率下降。反應(yīng)時(shí)間也是影響CHA反應(yīng)的重要因素。分別設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為1h、2h、4h、6h、8h等。將反應(yīng)體系在37℃下進(jìn)行不同時(shí)間的反應(yīng)，然后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在4h時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的值。這表明在4h內(nèi)，CHA反應(yīng)不斷進(jìn)行，雙鏈產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)。而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)4h后，熒光信號(hào)強(qiáng)度基本不再變化，說(shuō)明此時(shí)CHA反應(yīng)已基本達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，選擇4h作為最佳反應(yīng)時(shí)間，既能保證反應(yīng)充分進(jìn)行，又能提高檢測(cè)效率。寡核苷酸濃度對(duì)CHA反應(yīng)也有顯著影響。分別改變發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈的濃度，設(shè)置不同的濃度梯度，如10nM、20nM、50nM、100nM等。在固定其他反應(yīng)條件的情況下，進(jìn)行CHA反應(yīng)并檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈的濃度為50nM時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)。濃度過(guò)低時(shí)，參與反應(yīng)的寡核苷酸分子數(shù)量不足，導(dǎo)致反應(yīng)效率低下，熒光信號(hào)較弱；濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)引起寡核苷酸分子的聚集或非特異性雜交，同樣會(huì)影響反應(yīng)效率和熒光信號(hào)強(qiáng)度。離子強(qiáng)度也是影響CHA反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。通過(guò)在反應(yīng)體系中加入不同濃度的鹽溶液（如NaCl、KCl等）來(lái)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。設(shè)置鹽濃度梯度為50mM、100mM、150mM、200mM等。在其他反應(yīng)條件相同的情況下，進(jìn)行CHA反應(yīng)并檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)鹽濃度為150mM時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，CHA反應(yīng)效果最佳。離子強(qiáng)度會(huì)影響寡核苷酸分子之間的靜電相互作用，合適的離子強(qiáng)度能夠屏蔽寡核苷酸分子之間的電荷排斥力，促進(jìn)發(fā)夾探針和觸發(fā)鏈與miRNA-21的結(jié)合以及雙鏈的形成。鹽濃度過(guò)低時(shí)，靜電排斥力較大，不利于分子間的結(jié)合；鹽濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)破壞寡核苷酸的結(jié)構(gòu)，影響反應(yīng)進(jìn)行。3.4檢測(cè)系統(tǒng)的組裝與原理驗(yàn)證3.4.1檢測(cè)系統(tǒng)的組裝流程將修飾好的微米管與CHA反應(yīng)體系及檢測(cè)信號(hào)輸出元件進(jìn)行組裝，構(gòu)建完整的miRNA-21檢測(cè)系統(tǒng)。取經(jīng)過(guò)預(yù)處理和寡核苷酸固定的微米管，將其分散在含有優(yōu)化后的CHA反應(yīng)體系的緩沖液中。CHA反應(yīng)體系包含適當(dāng)濃度的發(fā)夾探針1（HP1）、發(fā)夾探針2（HP2）和觸發(fā)鏈（T），以及1×Tris-HCl緩沖液（pH8.0），確保各成分充分混合。將混合液在37℃下孵育10-15分鐘，使微米管表面固定的與miRNA-21互補(bǔ)的探針與CHA反應(yīng)體系中的觸發(fā)鏈充分接觸。若采用熒光探針作為檢測(cè)信號(hào)輸出元件，在CHA反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的雙鏈特異性染料，如SYBRGreenI。該染料能夠特異性地嵌入雙鏈DNA中，當(dāng)CHA反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生大量雙鏈DNA產(chǎn)物時(shí)，SYBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號(hào)增強(qiáng)。將加入熒光染料后的反應(yīng)體系在37℃下繼續(xù)孵育4小時(shí)，使CHA反應(yīng)充分進(jìn)行，熒光信號(hào)穩(wěn)定產(chǎn)生。若使用電化學(xué)傳感器作為檢測(cè)信號(hào)輸出元件，將修飾好的微米管固定在電極表面。采用滴涂法，將含有微米管的溶液滴涂在玻碳電極表面，待溶劑揮發(fā)后，微米管牢固地附著在電極上。在電極表面滴加適量的CHA反應(yīng)體系，使反應(yīng)在電極表面進(jìn)行。通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)電極表面的電流、電位等電化學(xué)信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)。3.4.2原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析為驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)miRNA-21的特異性識(shí)別和信號(hào)放大能力，設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，準(zhǔn)備不同濃度的miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍為1fM-1nM。將這些標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到組裝好的檢測(cè)系統(tǒng)中，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于基于熒光檢測(cè)的系統(tǒng)，反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。以miRNA-21濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著miRNA-21濃度的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在1fM-1nM的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=100x+50（R2=0.995）。這表明檢測(cè)系統(tǒng)能夠有效地識(shí)別miRNA-21，并通過(guò)CHA反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的定量檢測(cè)。為驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的特異性，將miRNA-21與其他序列相似的miRNA（如miRNA-155、miRNA-122等）進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。將相同濃度（100fM）的miRNA-21、miRNA-155和miRNA-122分別加入到檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果顯示，只有miRNA-21產(chǎn)生了明顯的熒光信號(hào)，而miRNA-155和miRNA-122產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度極低，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。這充分證明了檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)miRNA-21具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分miRNA-21與其他相似序列的miRNA。對(duì)于基于電化學(xué)檢測(cè)的系統(tǒng)，同樣將不同濃度的miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品加入到檢測(cè)系統(tǒng)中。通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)電極表面的電流變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著miRNA-21濃度的增加，電極表面的電流響應(yīng)逐漸增大，在1fM-1nM的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=5x+1（R2=0.992）。在特異性實(shí)驗(yàn)中，只有miRNA-21引起了明顯的電流變化，而其他相似序列的miRNA幾乎沒(méi)有引起電流響應(yīng)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)miRNA-21的特異性識(shí)別和信號(hào)放大能力，無(wú)論是基于熒光檢測(cè)還是電化學(xué)檢測(cè)的系統(tǒng)，都能夠有效地檢測(cè)miRNA-21，且具有較高的靈敏度和特異性。四、方法性能評(píng)估4.1靈敏度測(cè)試4.1.1低濃度miRNA-21檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了精確評(píng)估基于微米管表面的CHA放大方法對(duì)miRNA-21的檢測(cè)靈敏度，精心設(shè)計(jì)了一系列低濃度miRNA-21檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。首先，準(zhǔn)備一系列不同低濃度梯度的miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度范圍涵蓋1fM-1nM，具體濃度設(shè)置為1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM。每個(gè)濃度梯度設(shè)置6個(gè)平行樣本，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。將這些不同濃度的miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到構(gòu)建好的基于微米管表面的CHA檢測(cè)系統(tǒng)中。反應(yīng)體系按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行配置，確保反應(yīng)體系中各成分的濃度和比例最佳。將含有miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)系統(tǒng)的反應(yīng)管置于37℃恒溫孵育器中孵育4小時(shí)，使CHA反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)于基于熒光檢測(cè)的系統(tǒng)，利用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度；對(duì)于基于電化學(xué)檢測(cè)的系統(tǒng)，通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)電極表面的電流變化。在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，每個(gè)樣本的熒光信號(hào)強(qiáng)度或電流值均重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為該樣本的檢測(cè)值。同時(shí)，記錄每次測(cè)量的原始數(shù)據(jù)，以便后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和誤差評(píng)估。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的一致性，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑的添加順序和量等，以減少實(shí)驗(yàn)誤差對(duì)結(jié)果的影響。4.1.2靈敏度結(jié)果分析與比較對(duì)不同濃度miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行深入分析。以miRNA-21濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光信號(hào)強(qiáng)度（或電流值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于基于熒光檢測(cè)的系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在1fM-1nM的濃度范圍內(nèi)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與miRNA-21濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=100x+50（R2=0.995）。這表明該檢測(cè)方法能夠有效地檢測(cè)不同濃度的miRNA-21，并且隨著miRNA-21濃度的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的規(guī)定，檢測(cè)限（LOD）的計(jì)算公式為L(zhǎng)OD=3σ/s，其中σ為空白樣本測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。通過(guò)對(duì)空白樣本進(jìn)行多次測(cè)量（n=10），計(jì)算得到空白樣本熒光信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ=0.5。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率s=100，計(jì)算得出基于熒光檢測(cè)的該方法對(duì)miRNA-21的檢測(cè)限為