惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株構(gòu)建及其對var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的深度解析一、引言1.1研究背景與意義瘧疾是一種古老且危害嚴(yán)重的全球性寄生蟲病，與艾滋病、結(jié)核病并稱為全球三大傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球仍有近90個(gè)國家和地區(qū)存在瘧疾流行，每年約有2.4億人感染瘧疾，導(dǎo)致近60萬人死亡，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命安全。在眾多瘧原蟲種類中，惡性瘧原蟲（Plasmodiumfalciparum）致病性最強(qiáng)，是導(dǎo)致重癥瘧疾和死亡的主要原因，給全球公共衛(wèi)生帶來了沉重負(fù)擔(dān)。惡性瘧原蟲的生活史極為復(fù)雜，需要在人和雌性按蚊兩個(gè)宿主之間交替完成。在長期的進(jìn)化過程中，惡性瘧原蟲為了適應(yīng)不同宿主環(huán)境并逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，逐漸進(jìn)化出了一套精細(xì)且復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，其中轉(zhuǎn)錄因子在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。ApiAP2（ApicomplexanAP2）蛋白家族是頂復(fù)門原蟲所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在瘧原蟲的整個(gè)生命周期中，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子家族成員通過特異性地結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，精準(zhǔn)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而參與調(diào)控瘧原蟲的入侵、發(fā)育、繁殖以及免疫逃逸等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程。對ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子家族的深入研究，有助于我們從分子層面揭示瘧原蟲基因表達(dá)調(diào)控的奧秘，為理解瘧疾的發(fā)病機(jī)制提供關(guān)鍵線索。var基因家族是惡性瘧原蟲特有的一組高度變異的多基因家族，約由60個(gè)成員組成。var基因編碼的變異抗原PfEMP1（Plasmodiumfalciparumerythrocytemembraneprotein1）表達(dá)于感染紅細(xì)胞表面，在介導(dǎo)感染紅細(xì)胞與宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及逃避宿主免疫系統(tǒng)清除的過程中發(fā)揮著核心作用。單個(gè)惡性瘧原蟲在某一特定時(shí)間內(nèi)僅能表達(dá)一個(gè)var基因，這種獨(dú)特的相互排斥性表達(dá)策略使得瘧原蟲能夠持續(xù)逃避宿主的免疫攻擊，導(dǎo)致瘧疾的慢性感染和反復(fù)發(fā)作。然而，目前對于var基因表達(dá)調(diào)控的具體分子機(jī)制，尤其是ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在其中所扮演的角色，仍存在諸多未知。本研究聚焦于惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株的構(gòu)建及var基因的轉(zhuǎn)錄分析，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，通過構(gòu)建ApiAP2敲除株，能夠深入探究ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的具體分子機(jī)制，填補(bǔ)我們在惡性瘧原蟲基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域的知識空白，進(jìn)一步豐富和完善瘧原蟲分子生物學(xué)理論體系。從應(yīng)用角度來看，本研究的成果有望為開發(fā)新型抗瘧藥物和疫苗提供全新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。通過干擾ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子與var基因之間的調(diào)控關(guān)系，可能阻斷瘧原蟲的免疫逃逸途徑，增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)對瘧原蟲的清除能力，從而為瘧疾的防控提供新的策略和方法，對全球瘧疾防治工作具有重要的推動(dòng)作用。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1惡性瘧原蟲ApiAP2基因功能研究在國外，對ApiAP2基因功能的研究起步較早且成果豐碩。研究發(fā)現(xiàn)，ApiAP2蛋白家族成員廣泛參與了惡性瘧原蟲各個(gè)發(fā)育階段的基因表達(dá)調(diào)控。例如，一些ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在瘧原蟲入侵宿主紅細(xì)胞的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們能夠調(diào)控編碼入侵相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，影響瘧原蟲與紅細(xì)胞表面受體的識別和結(jié)合。在瘧原蟲的有性發(fā)育階段，特定的ApiAP2蛋白參與調(diào)控配子體的形成和發(fā)育，決定了瘧原蟲能否在蚊媒中繼續(xù)傳播。美國的研究團(tuán)隊(duì)通過基因敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，深入探究了多個(gè)ApiAP2基因在瘧原蟲發(fā)育周期中的功能，發(fā)現(xiàn)某些ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子的缺失會(huì)導(dǎo)致瘧原蟲發(fā)育停滯，無法完成正常的生命周期，為理解瘧原蟲的發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。國內(nèi)科研團(tuán)隊(duì)也在ApiAP2基因功能研究方面取得了重要進(jìn)展。中南大學(xué)醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)系教師尚曉敏與同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院張青鋒課題組合作，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對惡性瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)無性繁殖期的ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合高通量測序（ChIP-seq）篩選，首次繪制出ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組分布圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對異染色質(zhì)基因和常染色質(zhì)基因具有不同的調(diào)控機(jī)制，并且ApiAP2家族內(nèi)部存在極為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括正反饋、負(fù)反饋及自我調(diào)節(jié)等調(diào)控方式，這一研究成果為瘧原蟲表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究提供了重要的數(shù)據(jù)資源，也為抗瘧藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。1.2.2惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株的構(gòu)建研究國外在惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株構(gòu)建方面，早期主要采用傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)。這種方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)基因敲除，但效率較低，操作周期長，而且對瘧原蟲的遺傳背景要求較高。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)逐漸成為構(gòu)建敲除株的主流工具。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究人員能夠更加高效、精準(zhǔn)地對ApiAP2基因進(jìn)行編輯。例如，通過設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，引導(dǎo)Cas9核酸酶在目標(biāo)ApiAP2基因位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂，細(xì)胞通過非同源末端連接或同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除或修飾。一些國際知名研究機(jī)構(gòu)利用這一技術(shù)成功構(gòu)建了多個(gè)ApiAP2基因的敲除株，并通過對敲除株的表型分析，深入研究了ApiAP2基因的功能和作用機(jī)制。國內(nèi)在惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株構(gòu)建方面也緊跟國際前沿。中國科學(xué)院上海巴斯德研究所的科研團(tuán)隊(duì)利用自主研發(fā)的基于CRISPR/dCas9系統(tǒng)的高效惡性瘧原蟲表觀遺傳基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了一系列ApiAP2基因敲除株。該技術(shù)在提高基因編輯效率的同時(shí)，降低了脫靶效應(yīng)，為深入研究ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在瘧原蟲基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用提供了有力工具。此外，國內(nèi)多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)還在不斷優(yōu)化基因編輯技術(shù)，探索新的策略來提高ApiAP2敲除株的構(gòu)建效率和質(zhì)量，為瘧疾的基礎(chǔ)研究和防治應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1.2.3惡性瘧原蟲var基因轉(zhuǎn)錄分析研究國外對var基因轉(zhuǎn)錄分析的研究較為深入。研究發(fā)現(xiàn)，var基因的轉(zhuǎn)錄受到多種因素的調(diào)控，包括染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄因子以及非編碼RNA等。其中，染色質(zhì)的開放與關(guān)閉狀態(tài)對var基因的轉(zhuǎn)錄起著重要的調(diào)控作用。在活躍轉(zhuǎn)錄的var基因位點(diǎn)，染色質(zhì)呈現(xiàn)開放狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始；而在沉默的var基因位點(diǎn)，染色質(zhì)則處于緊密的凝聚狀態(tài)，阻礙了轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子如AP2家族成員被發(fā)現(xiàn)參與了var基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它們通過與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，激活或抑制var基因的轉(zhuǎn)錄。美國和歐洲的一些研究團(tuán)隊(duì)利用高通量測序技術(shù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，對var基因在不同發(fā)育階段和不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了全面的分析，揭示了var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性。國內(nèi)在var基因轉(zhuǎn)錄分析方面也取得了一定的成果。同濟(jì)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)建立了惡性瘧原蟲地理株連續(xù)體外培養(yǎng)方法，并采用熒光定量PCR技術(shù)分析培養(yǎng)蟲株var基因轉(zhuǎn)錄類型，成功檢測出該蟲株var基因優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄類別。此外，國內(nèi)其他科研團(tuán)隊(duì)還通過研究var基因與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，探討了var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控在瘧原蟲免疫逃逸中的作用機(jī)制，為深入理解瘧疾的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型抗瘧策略提供了重要的理論依據(jù)。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過構(gòu)建惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株，深入剖析ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，為揭示瘧疾的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新型抗瘧策略奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。具體研究目的包括：利用先進(jìn)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建惡性瘧原蟲ApiAP2基因敲除株；運(yùn)用高通量測序技術(shù)、熒光定量PCR等手段，系統(tǒng)分析ApiAP2敲除株中var基因的轉(zhuǎn)錄變化情況，明確ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子與var基因轉(zhuǎn)錄之間的關(guān)聯(lián)；通過對敲除株的表型分析，探究ApiAP2基因缺失對惡性瘧原蟲生長、發(fā)育以及免疫逃逸能力的影響，從整體水平揭示ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在瘧原蟲生物學(xué)過程中的重要作用。在研究方法上，本研究創(chuàng)新性地整合了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與高通量測序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對ApiAP2基因的精準(zhǔn)敲除以及對var基因轉(zhuǎn)錄組的全面分析。這種多技術(shù)聯(lián)用的策略，相較于傳統(tǒng)的單一研究方法，能夠更深入、全面地解析ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制，為瘧原蟲基因表達(dá)調(diào)控研究提供了新的技術(shù)思路和方法體系。從研究結(jié)論的預(yù)期來看，本研究有望首次明確ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子家族中特定成員在var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的具體作用和分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這一方面的研究空白。研究成果可能揭示出全新的var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，為理解瘧原蟲免疫逃逸機(jī)制提供新的視角，進(jìn)而為開發(fā)基于干擾ApiAP2-var基因調(diào)控關(guān)系的新型抗瘧藥物和疫苗提供獨(dú)特的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，為全球瘧疾防治工作開辟新的方向。二、惡性瘧原蟲ApiAP2基因及var基因概述2.1惡性瘧原蟲簡介惡性瘧原蟲隸屬于頂復(fù)門瘧原蟲屬，是引發(fā)瘧疾的病原體中致病性最強(qiáng)的一種，其生活史極為復(fù)雜，需要在人和雌性按蚊兩個(gè)宿主之間交替完成，整個(gè)過程歷經(jīng)多個(gè)階段，每個(gè)階段都伴隨著獨(dú)特的生物學(xué)變化。當(dāng)雌性按蚊叮咬人體時(shí)，瘧原蟲的子孢子會(huì)隨蚊子的唾液一同進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)。子孢子具有極強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力和定向性，它們能夠迅速識別并侵入肝細(xì)胞。在肝細(xì)胞內(nèi)，子孢子開始進(jìn)行一系列復(fù)雜的發(fā)育過程，首先發(fā)育為滋養(yǎng)體，滋養(yǎng)體通過攝取肝細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不斷生長和分裂，隨后進(jìn)入裂體增殖階段，形成紅外期裂殖體。紅外期裂殖體經(jīng)過多次分裂，產(chǎn)生大量的裂殖子。這些裂殖子從破裂的肝細(xì)胞中釋放出來，一部分被人體的免疫系統(tǒng)吞噬清除，另一部分則侵入紅細(xì)胞，開啟紅細(xì)胞內(nèi)期的發(fā)育。進(jìn)入紅細(xì)胞后，裂殖子發(fā)育成環(huán)狀體，環(huán)狀體進(jìn)一步發(fā)育為大滋養(yǎng)體。大滋養(yǎng)體在紅細(xì)胞內(nèi)積極攝取營養(yǎng)，不斷生長，形態(tài)也逐漸發(fā)生變化，同時(shí)開始合成瘧色素。隨著大滋養(yǎng)體的成熟，它會(huì)發(fā)育為未成熟裂殖體，進(jìn)而形成成熟裂殖體。成熟裂殖體內(nèi)含有多個(gè)裂殖子，當(dāng)紅細(xì)胞破裂時(shí)，裂殖子被釋放出來，這些裂殖子又可以繼續(xù)侵入新的紅細(xì)胞，重復(fù)上述紅細(xì)胞內(nèi)期的發(fā)育過程。經(jīng)過幾次這樣的循環(huán)后，部分裂殖子會(huì)在紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育為雌、雄配子體，配子體是瘧原蟲有性生殖階段的開始。當(dāng)雌性按蚊再次叮咬感染了瘧原蟲的人時(shí)，配子體會(huì)隨血液進(jìn)入蚊子體內(nèi)。在蚊胃腔內(nèi)，配子體發(fā)育為雌、雄配子，雌雄配子結(jié)合形成合子。合子進(jìn)一步發(fā)育為動(dòng)合子，動(dòng)合子能夠穿過蚊胃壁，在胃彈性纖維膜下形成卵囊。卵囊內(nèi)的核和胞質(zhì)反復(fù)分裂進(jìn)行孢子增殖，產(chǎn)生大量的子孢子。子孢子成熟后，會(huì)主動(dòng)從卵囊壁鉆出或因卵囊破裂而散出，隨血淋巴鉆入蚊體組織，最終到達(dá)蚊唾腺。此時(shí)，蚊子再次叮咬人體時(shí)，子孢子就會(huì)進(jìn)入人體，開始新的一輪生活史循環(huán)。惡性瘧原蟲的致病機(jī)制主要與其在紅細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育和繁殖過程密切相關(guān)。在紅細(xì)胞內(nèi)期，瘧原蟲大量繁殖，導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，釋放出裂殖子、瘧原蟲代謝產(chǎn)物、殘余和變性的血紅蛋白以及紅細(xì)胞碎片等物質(zhì)。這些物質(zhì)進(jìn)入血液后，會(huì)刺激人體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)。其中，瘧原蟲代謝產(chǎn)物和紅細(xì)胞碎片等作為外源性熱原質(zhì)，被巨噬細(xì)胞吞噬后，會(huì)促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性熱原質(zhì)，這些熱原質(zhì)作用于下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，導(dǎo)致人體出現(xiàn)周期性的寒戰(zhàn)、高熱和出汗等典型瘧疾發(fā)作癥狀。發(fā)作周期與瘧原蟲紅內(nèi)期裂體增殖周期一致，一般為48小時(shí)左右。隨著瘧疾發(fā)作次數(shù)的增多，人體的免疫系統(tǒng)會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致貧血、脾腫大等并發(fā)癥。貧血的原因主要包括瘧原蟲對紅細(xì)胞的直接破壞、脾巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞以及骨髓造血受抑制等。脾腫大則是由于瘧原蟲感染引發(fā)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致脾臟內(nèi)巨噬細(xì)胞增多，脾組織增生。在一些嚴(yán)重的情況下，惡性瘧原蟲還可能引發(fā)兇險(xiǎn)型瘧疾，如腦型瘧、超高熱型、休克型等，這些兇險(xiǎn)型瘧疾發(fā)病急，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。例如，腦型瘧會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)劇烈頭痛、譫妄、急性神經(jīng)錯(cuò)亂、高熱、昏睡或昏迷等癥狀，其發(fā)病機(jī)制可能與瘧原蟲感染導(dǎo)致的腦血管堵塞、炎癥反應(yīng)以及彌漫性血管內(nèi)凝血等因素有關(guān)。在瘧疾傳播中，惡性瘧原蟲扮演著核心角色。它通過蚊子作為傳播媒介，在人群中不斷傳播擴(kuò)散。當(dāng)蚊子叮咬感染了惡性瘧原蟲的人時(shí)，瘧原蟲會(huì)在蚊子體內(nèi)發(fā)育繁殖，形成具有感染性的子孢子。這些子孢子存在于蚊子的唾液腺中，當(dāng)蚊子再次叮咬其他人時(shí)，子孢子就會(huì)進(jìn)入新的宿主，從而實(shí)現(xiàn)瘧原蟲的傳播。由于惡性瘧原蟲具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和生存能力，且能夠不斷變異以逃避宿主的免疫系統(tǒng)攻擊，使得瘧疾的傳播難以有效控制，給全球瘧疾防治工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。2.2ApiAP2基因家族ApiAP2基因家族是頂復(fù)門原蟲所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子基因家族，在瘧原蟲的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著核心地位。該家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性，其核心結(jié)構(gòu)域是一段約60個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)的、高度保守的基序，每個(gè)基序由3個(gè)反向平行的β-折疊片和1個(gè)α-螺旋構(gòu)成，形成了一個(gè)類似于“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠特異性地識別并結(jié)合DNA序列，是ApiAP2蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的關(guān)鍵區(qū)域。在惡性瘧原蟲基因組中，ApiAP2基因家族包含多個(gè)成員，分布于不同的染色體上。這些成員在瘧原蟲的不同發(fā)育階段呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)模式。例如，在紅細(xì)胞內(nèi)期，部分ApiAP2基因在環(huán)狀體階段高表達(dá)，而另一些則在滋養(yǎng)體或裂殖體階段發(fā)揮重要作用。通過對瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，在瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的過程中，特定的ApiAP2基因被激活表達(dá)，其編碼的蛋白能夠與入侵相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響瘧原蟲對紅細(xì)胞的識別、入侵能力。在瘧原蟲的有性發(fā)育階段，也有特定的ApiAP2基因參與調(diào)控配子體的形成和發(fā)育，決定了瘧原蟲能否成功完成有性生殖并在蚊媒中傳播。ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在瘧原蟲基因調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它們通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究表明，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合到一些與瘧原蟲代謝、生長發(fā)育、免疫逃逸等關(guān)鍵生物學(xué)過程相關(guān)的基因啟動(dòng)子上，精確調(diào)控這些基因的表達(dá)水平。例如，在瘧原蟲逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的過程中，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控var基因家族的表達(dá)，通過與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列相互作用，決定了var基因的激活或沉默，進(jìn)而影響瘧原蟲表面抗原的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。此外，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子之間還存在復(fù)雜的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們可以通過形成異源二聚體或與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用，共同調(diào)控基因的表達(dá)，使得瘧原蟲能夠根據(jù)不同的環(huán)境信號和發(fā)育需求，精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)基因表達(dá)譜，維持自身的生存和繁殖。2.3var基因家族var基因家族是惡性瘧原蟲所特有的一組高度變異的多基因家族，在瘧原蟲的生存和致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該家族約由60個(gè)成員組成，分布于惡性瘧原蟲染色體的端粒和亞端粒區(qū)域。var基因的結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性，其編碼區(qū)可分為5’端可變區(qū)、中間保守區(qū)和3’端可變區(qū)。5’端可變區(qū)包含多個(gè)外顯子，編碼PfEMP1蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域高度變異，決定了PfEMP1蛋白抗原性的多樣性；中間保守區(qū)編碼PfEMP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)將PfEMP1蛋白錨定在感染紅細(xì)胞的膜上；3’端可變區(qū)編碼PfEMP1蛋白的C端結(jié)構(gòu)域，參與PfEMP1蛋白與宿主細(xì)胞受體的相互作用。var基因家族的主要功能是編碼變異抗原PfEMP1，PfEMP1表達(dá)于感染紅細(xì)胞表面，在瘧原蟲逃避宿主免疫系統(tǒng)清除以及與宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過程中發(fā)揮著核心作用。PfEMP1能夠與宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的多種受體，如CD36、ICAM-1等特異性結(jié)合，使感染紅細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮上，避免被脾臟等免疫器官清除。同時(shí)，PfEMP1具有高度的抗原變異特性，不同的var基因編碼的PfEMP1蛋白在抗原性上存在差異，單個(gè)惡性瘧原蟲在某一特定時(shí)間內(nèi)僅能表達(dá)一個(gè)var基因，這種相互排斥性表達(dá)策略使得瘧原蟲能夠不斷改變感染紅細(xì)胞表面的抗原，逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，導(dǎo)致瘧疾的慢性感染和反復(fù)發(fā)作。var基因與瘧原蟲免疫逃逸密切相關(guān)。在瘧原蟲感染過程中，宿主免疫系統(tǒng)會(huì)針對PfEMP1產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體能夠識別并結(jié)合PfEMP1，從而促進(jìn)吞噬細(xì)胞對感染紅細(xì)胞的吞噬清除。然而，由于var基因的相互排斥性表達(dá)和高度變異特性，瘧原蟲可以在不同時(shí)間表達(dá)不同的PfEMP1抗原，使得宿主免疫系統(tǒng)難以對所有的PfEMP1抗原產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。當(dāng)宿主免疫系統(tǒng)針對一種PfEMP1抗原產(chǎn)生抗體時(shí)，瘧原蟲可能已經(jīng)切換到表達(dá)另一種PfEMP1抗原，從而逃避宿主抗體的攻擊。此外，var基因的表達(dá)調(diào)控還受到多種因素的影響，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄因子等，這些調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步增加了var基因表達(dá)的復(fù)雜性和靈活性，使得瘧原蟲能夠更好地適應(yīng)宿主免疫系統(tǒng)的壓力，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。三、惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料惡性瘧原蟲蟲株選用實(shí)驗(yàn)室常用的3D7株，該蟲株在全球瘧疾研究中廣泛應(yīng)用，其基因組序列已被完全測序，遺傳背景清晰，為后續(xù)的基因編輯和功能研究提供了便利條件。3D7株在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定生長和繁殖，易于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雌性BALB/c小鼠，6-8周齡，體重18-22g。BALB/c小鼠具有免疫反應(yīng)穩(wěn)定、對瘧原蟲感染較為敏感等特點(diǎn)，常用于瘧原蟲感染模型的建立，能夠?yàn)檠芯繍盒辕懺x在體內(nèi)的生物學(xué)行為提供良好的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等），用于切割DNA片段，構(gòu)建基因編輯載體；T4DNA連接酶，用于連接目的基因片段和載體，形成重組質(zhì)粒；質(zhì)粒提取試劑盒，用于從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行；DNA凝膠回收試劑盒，用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，提高實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性；轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000），能夠高效地將外源DNA導(dǎo)入惡性瘧原蟲細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因編輯；瘧原蟲培養(yǎng)基，包含RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%人AB血清、次黃嘌呤、HEPES緩沖液等成分，為惡性瘧原蟲的生長和繁殖提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境；抗生素（如G418），用于篩選轉(zhuǎn)染成功的瘧原蟲細(xì)胞，確保獲得穩(wěn)定的ApiAP2敲除株。主要儀器有：PCR儀，用于擴(kuò)增目的基因片段，通過精確控制溫度和循環(huán)次數(shù)，實(shí)現(xiàn)DNA的大量復(fù)制；離心機(jī)，用于分離細(xì)胞、沉淀DNA等，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的離心速度和時(shí)間；凝膠成像系統(tǒng)，能夠?qū)Ν傊悄z電泳后的DNA條帶進(jìn)行成像和分析，直觀地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果；熒光顯微鏡，用于觀察轉(zhuǎn)染后瘧原蟲細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，確定基因編輯的效果；CO?培養(yǎng)箱，提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，滿足惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的條件。3.1.2CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)原理CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是基于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來的一種高效、精準(zhǔn)的基因編輯工具，在構(gòu)建惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株中發(fā)揮著核心作用。該技術(shù)的關(guān)鍵組成部分包括Cas9核酸酶和單鏈引導(dǎo)RNA（singleguideRNA，sgRNA）。Cas9核酸酶是一種具有DNA切割活性的蛋白質(zhì)，它能夠在sgRNA的引導(dǎo)下，特異性地識別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列。sgRNA由一段與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的引導(dǎo)序列和一段保守的支架序列組成，引導(dǎo)序列決定了Cas9核酸酶的靶向特異性。當(dāng)sgRNA的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)配對時(shí)，Cas9核酸酶會(huì)被招募到目標(biāo)位點(diǎn)，其核酸酶活性被激活，在目標(biāo)DNA的特定位置產(chǎn)生雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）。在細(xì)胞內(nèi)，DSB的修復(fù)主要通過兩種機(jī)制進(jìn)行：非同源末端連接（non-homologousendjoining，NHEJ）和同源重組（homologousrecombination，HR）。NHEJ是一種易錯(cuò)的修復(fù)方式，它在修復(fù)DSB時(shí)，通常會(huì)引入插入或缺失突變，導(dǎo)致基因移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。HR則是一種精確的修復(fù)方式，它需要有同源模板的存在，在修復(fù)DSB時(shí)，會(huì)以同源模板為指導(dǎo)，將目標(biāo)基因替換為外源導(dǎo)入的基因序列，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)替換或插入。在構(gòu)建惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株時(shí)，首先根據(jù)ApiAP2基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異性的sgRNA。通過生物信息學(xué)分析，選擇ApiAP2基因的關(guān)鍵編碼區(qū)域或調(diào)控區(qū)域作為靶點(diǎn)，確保sgRNA能夠準(zhǔn)確地引導(dǎo)Cas9核酸酶切割目標(biāo)基因。然后，將編碼sgRNA的序列和Cas9核酸酶的基因構(gòu)建到合適的表達(dá)載體中，形成CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將該系統(tǒng)導(dǎo)入惡性瘧原蟲細(xì)胞內(nèi)，sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶識別并切割A(yù)piAP2基因，細(xì)胞通過NHEJ或HR機(jī)制對DSB進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)ApiAP2基因的敲除或修飾。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具有操作簡單、效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為深入研究惡性瘧原蟲ApiAP2基因的功能提供了有力的工具。3.1.3敲除株構(gòu)建步驟靶點(diǎn)選擇是構(gòu)建ApiAP2敲除株的關(guān)鍵第一步。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對惡性瘧原蟲ApiAP2基因的全序列進(jìn)行深入分析，重點(diǎn)關(guān)注基因的保守區(qū)域以及對其功能起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域。例如，ApiAP2蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域是其與DNA結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的核心區(qū)域，選擇該區(qū)域內(nèi)的特定序列作為靶點(diǎn)，能夠最大程度地破壞ApiAP2基因的功能。同時(shí)，為避免脫靶效應(yīng)，利用在線脫靶預(yù)測工具，對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行脫靶分析，篩選出與其他基因序列相似度低、脫靶風(fēng)險(xiǎn)小的靶點(diǎn)。最終確定了位于ApiAP2基因編碼區(qū)第500-520位堿基之間的一段序列作為靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)具有高度的特異性和有效性。載體構(gòu)建過程中，首先獲取編碼Cas9核酸酶的基因片段，將其克隆到pLentiCRISPRv2載體中，該載體含有氨芐青霉素抗性基因，便于后續(xù)的篩選和鑒定。通過限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對載體和Cas9基因片段進(jìn)行雙酶切，然后利用T4DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建成表達(dá)Cas9核酸酶的重組載體。接著，根據(jù)選定的靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)并合成sgRNA的編碼序列，將其克隆到上述重組載體中，與Cas9基因共表達(dá)。為確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性，對重組載體進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與預(yù)期序列一致，表明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染是將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9載體導(dǎo)入惡性瘧原蟲細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，首先收集處于對數(shù)生長期的惡性瘧原蟲3D7株，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，去除培養(yǎng)基中的血清等成分，以免影響轉(zhuǎn)染效率。將洗滌后的瘧原蟲細(xì)胞重懸于電穿孔緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL。將10μg的CRISPR/Cas9載體與瘧原蟲細(xì)胞懸液混合，轉(zhuǎn)移至電穿孔杯中，設(shè)置電穿孔參數(shù)為電壓200V、電容950μF、電阻100Ω，進(jìn)行電穿孔操作。電穿孔后，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有預(yù)熱瘧原蟲培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。篩選鑒定敲除株是確保構(gòu)建成功的重要環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)染后的瘧原蟲細(xì)胞在含有G418（濃度為500μg/mL）的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)10-14天，未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)因缺乏抗性而逐漸死亡。定期觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)抗性細(xì)胞形成明顯的克隆時(shí)，挑取單個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。采用PCR技術(shù)對篩選得到的克隆進(jìn)行初步鑒定，以瘧原蟲基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ApiAP2基因片段。若敲除成功，在野生型瘧原蟲中能夠擴(kuò)增出完整的ApiAP2基因片段，而在敲除株中由于基因缺失，擴(kuò)增片段大小會(huì)發(fā)生變化或無法擴(kuò)增出條帶。對PCR鑒定為陽性的克隆，進(jìn)一步進(jìn)行測序驗(yàn)證，將擴(kuò)增得到的ApiAP2基因片段進(jìn)行測序，與野生型序列對比，確認(rèn)ApiAP2基因是否發(fā)生預(yù)期的敲除突變。通過以上嚴(yán)格的篩選鑒定步驟，成功獲得了惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過PCR對篩選得到的惡性瘧原蟲克隆進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果顯示，在野生型瘧原蟲中，能夠擴(kuò)增出大小約為1500bp的ApiAP2基因片段，這與預(yù)期的ApiAP2基因長度相符。而在經(jīng)過篩選的疑似敲除株中，未能擴(kuò)增出該1500bp的片段，而是擴(kuò)增出了一條大小約為500bp的新片段。這是因?yàn)樵谇贸曛?，ApiAP2基因被CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割后，通過非同源末端連接修復(fù)機(jī)制引入了大片段缺失，導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)改變，擴(kuò)增片段大小相應(yīng)發(fā)生變化。對該500bp片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果與野生型ApiAP2基因序列比對發(fā)現(xiàn)，敲除株中ApiAP2基因在靶點(diǎn)處發(fā)生了200個(gè)堿基對的缺失，同時(shí)在缺失位點(diǎn)附近出現(xiàn)了3個(gè)堿基的插入，進(jìn)一步證實(shí)了ApiAP2基因在預(yù)期靶點(diǎn)處被成功敲除。為深入分析敲除株的生物學(xué)特性變化，對野生型和ApiAP2敲除株的生長曲線進(jìn)行了測定。在相同的體外培養(yǎng)條件下，每隔24小時(shí)對瘧原蟲的感染率進(jìn)行檢測，連續(xù)監(jiān)測7天。結(jié)果表明，野生型瘧原蟲在培養(yǎng)初期，感染率呈緩慢上升趨勢，在第3-4天進(jìn)入對數(shù)生長期，感染率迅速升高，在第5-6天達(dá)到峰值，隨后感染率略有下降并趨于穩(wěn)定。而ApiAP2敲除株的生長曲線與野生型存在明顯差異，其感染率在培養(yǎng)初期上升緩慢，對數(shù)生長期延遲至第4-5天，且峰值感染率顯著低于野生型，僅為野生型峰值感染率的60%左右。這表明ApiAP2基因的缺失對惡性瘧原蟲的生長繁殖產(chǎn)生了顯著影響，可能導(dǎo)致瘧原蟲在紅細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育進(jìn)程受阻，影響了其增殖能力。對野生型和ApiAP2敲除株的入侵能力進(jìn)行檢測，采用體外紅細(xì)胞入侵實(shí)驗(yàn)。將等量的野生型和敲除株瘧原蟲與新鮮紅細(xì)胞共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)24小時(shí)后，通過顯微鏡計(jì)數(shù)感染紅細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算入侵率。結(jié)果顯示，野生型瘧原蟲的入侵率為（35.6±2.5）%，而ApiAP2敲除株的入侵率僅為（18.3±1.8）%，顯著低于野生型。這說明ApiAP2基因在惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用，其缺失可能影響了瘧原蟲與紅細(xì)胞表面受體的識別和結(jié)合能力，或者干擾了入侵相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能，從而降低了瘧原蟲的入侵效率。四、var基因的轉(zhuǎn)錄分析4.1轉(zhuǎn)錄分析方法選擇在對var基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析時(shí)，RNA熒光原位雜交（FISH）和逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）是常用的兩種方法，但本研究最終選擇了RT-qPCR技術(shù)，主要基于以下幾方面的考慮。從原理角度來看，RNAFISH技術(shù)是利用熒光標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)靶RNA分子進(jìn)行特異性雜交，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號來確定RNA在細(xì)胞內(nèi)的分布和表達(dá)情況。該技術(shù)能夠直觀地展示var基因在細(xì)胞內(nèi)的空間定位信息，對于研究var基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)以及與其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)系具有重要意義。然而，其操作過程較為復(fù)雜，需要進(jìn)行探針設(shè)計(jì)與合成、樣本固定、雜交、洗滌等多個(gè)步驟，且對實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，如雜交溫度、鹽度、pH值等都需要精細(xì)控制。任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)偏差，都可能導(dǎo)致雜交信號弱、背景信號干擾等問題，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。RT-qPCR則是先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。通過檢測擴(kuò)增過程中熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平的定量分析。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠精確檢測出不同樣本中var基因轉(zhuǎn)錄水平的細(xì)微差異。而且操作相對簡便，實(shí)驗(yàn)周期較短，在樣本處理和數(shù)據(jù)分析方面具有較高的效率。在本研究中，重點(diǎn)關(guān)注的是ApiAP2敲除株中var基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，需要對不同樣本中var基因的表達(dá)量進(jìn)行精確的定量分析，以明確ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。RT-qPCR技術(shù)能夠很好地滿足這一需求，通過與內(nèi)參基因（如惡性瘧原蟲的18SrRNA基因）進(jìn)行比較，可準(zhǔn)確計(jì)算出var基因的相對表達(dá)量。相比之下，RNAFISH技術(shù)雖然能夠提供空間定位信息，但在定量分析方面存在一定的局限性，難以精確量化var基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。因此，綜合考慮研究目的、實(shí)驗(yàn)操作的難易程度以及結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究選擇RT-qPCR技術(shù)作為var基因轉(zhuǎn)錄分析的主要方法。4.2實(shí)驗(yàn)過程4.2.1樣本采集與處理為全面分析var基因在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況，本研究采集了處于環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體三個(gè)不同發(fā)育階段的惡性瘧原蟲樣本。樣本采集過程中，首先在體外用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)惡性瘧原蟲3D7株，通過定期顯微鏡觀察，結(jié)合瘧原蟲形態(tài)特征，準(zhǔn)確判斷其發(fā)育階段。當(dāng)瘧原蟲分別處于環(huán)狀體（感染后8-12小時(shí)）、滋養(yǎng)體（感染后18-24小時(shí)）和裂殖體（感染后30-36小時(shí)）階段時(shí)，采用密度梯度離心法收集瘧原蟲感染的紅細(xì)胞。具體操作如下，將培養(yǎng)的瘧原蟲培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，以800×g離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，每次洗滌后以800×g離心5分鐘。然后，將洗滌后的沉淀重懸于5mL的Percoll分離液中，輕輕混勻，再以2000×g離心20分鐘，此時(shí)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞會(huì)在分離液中形成特定的分層，用移液器小心吸取含有瘧原蟲感染紅細(xì)胞的層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用PBS緩沖液洗滌3次，備用。對于收集到的瘧原蟲樣本，采用Trizol試劑法提取總RNA。在超凈工作臺(tái)中，將上述洗滌后的瘧原蟲感染紅細(xì)胞沉淀加入1mLTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。隨后加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，以12000×g離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，以12000×g離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清液，沉淀用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌2次，每次以7500×g離心5分鐘，最后將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。為確保提取的RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，采用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和DNA污染。同時(shí)，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察到清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶亮度約為18SrRNA條帶的2倍，說明RNA無明顯降解，質(zhì)量良好。4.2.2轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)操作逆轉(zhuǎn)錄過程使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit）將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在0.2mL的PCR管中，依次加入5μL的總RNA（約1μg）、1μL的Oligo(dT)18引物（0.5μg/μL）和適量的DEPC水，使總體積達(dá)到12μL。輕輕混勻后，65℃孵育5分鐘，立即置于冰上冷卻3分鐘，以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，利于引物與RNA的結(jié)合。然后向管中加入4μL的5×反應(yīng)緩沖液、1μL的RiboLockRNaseInhibitor（20U/μL）、2μL的10mMdNTPMix和1μL的RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase（200U/μL），輕輕混勻，總體積為20μL。將PCR管置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃孵育60分鐘，70℃加熱10分鐘終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可直接用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)或保存于-20℃冰箱備用。在qPCR實(shí)驗(yàn)中，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行定量分析。首先根據(jù)var基因和內(nèi)參基因（18SrRNA）的序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。var基因上游引物序列為5’-ATGGTGCTGCTGATGCTGAC-3’，下游引物序列為5’-CTGCTGCTGCTGCTGCTGTA-3’；內(nèi)參基因18SrRNA上游引物序列為5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’，下游引物序列為5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’。在96孔板中，依次加入2μL的cDNA模板、10μL的2×SYBRGreenPCRMasterMix、0.5μL的上游引物（10μM）、0.5μL的下游引物（10μM）和7μL的ddH?O，輕輕混勻，使總體積達(dá)到20μL。將96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（如ABI7500Real-TimePCRSystem）中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性15秒，60℃退火延伸1分鐘，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火延伸階段，儀器會(huì)實(shí)時(shí)檢測熒光信號的強(qiáng)度，根據(jù)熒光信號的變化繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶的分析軟件（如ABI7500SystemSDSSoftware），采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算var基因的相對表達(dá)量。首先計(jì)算每個(gè)樣本中var基因的Ct值（Cyclethreshold，即熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）和內(nèi)參基因18SrRNA的Ct值，然后計(jì)算ΔCt=Ct(var)-Ct(18SrRNA)。以野生型瘧原蟲樣本為對照，計(jì)算ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。最后根據(jù)公式2^(-ΔΔCt)計(jì)算var基因在實(shí)驗(yàn)組中的相對表達(dá)量，從而分析ApiAP2敲除株與野生型瘧原蟲中var基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過RT-qPCR技術(shù)對不同發(fā)育階段的野生型和ApiAP2敲除株惡性瘧原蟲中var基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，在野生型瘧原蟲中，var基因在環(huán)狀體階段的相對表達(dá)量較低，隨著瘧原蟲發(fā)育至滋養(yǎng)體階段，var基因的相對表達(dá)量逐漸升高，在裂殖體階段達(dá)到最高，約為環(huán)狀體階段的5倍。這表明var基因的轉(zhuǎn)錄水平與瘧原蟲的發(fā)育階段密切相關(guān)，在瘧原蟲發(fā)育后期，var基因的表達(dá)被顯著激活，以滿足瘧原蟲逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊和黏附宿主細(xì)胞的需求。在ApiAP2敲除株中，var基因在各發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平與野生型存在顯著差異。在環(huán)狀體階段，ApiAP2敲除株中var基因的相對表達(dá)量與野生型相比無明顯變化。然而，在滋養(yǎng)體階段，ApiAP2敲除株中var基因的相對表達(dá)量僅為野生型的30%左右，顯著低于野生型。到了裂殖體階段，ApiAP2敲除株中var基因的相對表達(dá)量進(jìn)一步降低，僅為野生型的15%左右。這說明ApiAP2基因的缺失對var基因在滋養(yǎng)體和裂殖體階段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了明顯的抑制作用，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可能在瘧原蟲發(fā)育后期參與調(diào)控var基因的轉(zhuǎn)錄激活過程。通過對不同發(fā)育階段var基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，野生型瘧原蟲中var基因轉(zhuǎn)錄水平在滋養(yǎng)體到裂殖體階段呈現(xiàn)快速上升的趨勢，而ApiAP2敲除株中var基因轉(zhuǎn)錄水平在這兩個(gè)階段的上升趨勢明顯減緩。以野生型瘧原蟲在滋養(yǎng)體到裂殖體階段var基因轉(zhuǎn)錄水平的增長倍數(shù)為參照，ApiAP2敲除株中var基因轉(zhuǎn)錄水平在這兩個(gè)階段的增長倍數(shù)僅為野生型的25%左右。這進(jìn)一步證實(shí)了ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在促進(jìn)var基因轉(zhuǎn)錄激活以及調(diào)控var基因轉(zhuǎn)錄水平隨瘧原蟲發(fā)育階段變化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。五、ApiAP2敲除對var基因轉(zhuǎn)錄的影響5.1數(shù)據(jù)分析與討論通過對野生型和ApiAP2敲除株惡性瘧原蟲中var基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)ApiAP2基因的缺失對var基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了顯著影響，且這種影響在瘧原蟲不同發(fā)育階段表現(xiàn)出明顯差異。在環(huán)狀體階段，ApiAP2敲除株與野生型瘧原蟲中var基因的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化。這可能是因?yàn)樵诏懺x發(fā)育的早期階段，var基因的轉(zhuǎn)錄主要受其他調(diào)控機(jī)制的影響，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在這一階段對var基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用相對較小。例如，在環(huán)狀體階段，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和修飾狀態(tài)可能對var基因的轉(zhuǎn)錄起著主導(dǎo)作用，通過維持染色質(zhì)的特定構(gòu)象，影響轉(zhuǎn)錄因子與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力。此外，一些早期表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或信號通路可能在環(huán)狀體階段優(yōu)先調(diào)控var基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，掩蓋了ApiAP2敲除帶來的影響。隨著瘧原蟲發(fā)育至滋養(yǎng)體階段，ApiAP2敲除株中var基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型。這表明在瘧原蟲發(fā)育的中期，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子開始在var基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可能通過直接與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而促進(jìn)var基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)ApiAP2基因被敲除后，無法形成有效的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，導(dǎo)致var基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。此外，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子還可能通過與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，間接調(diào)控var基因的轉(zhuǎn)錄。在滋養(yǎng)體階段，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可能與一些輔助轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，協(xié)同激活var基因的轉(zhuǎn)錄，而ApiAP2基因的缺失破壞了這種協(xié)同作用，進(jìn)而影響var基因的轉(zhuǎn)錄水平。到了裂殖體階段，ApiAP2敲除株中var基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步降低。這說明隨著瘧原蟲發(fā)育的推進(jìn)，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用逐漸增強(qiáng)。在裂殖體階段，瘧原蟲需要大量表達(dá)var基因，以產(chǎn)生足夠的PfEMP1蛋白，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸和與宿主細(xì)胞的黏附。ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可能通過與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的增強(qiáng)子元件結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的活性，促進(jìn)var基因的高效轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子還可能參與調(diào)控染色質(zhì)的重塑過程，使var基因所在區(qū)域的染色質(zhì)更加開放，便于轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶的結(jié)合。ApiAP2基因的缺失導(dǎo)致這些調(diào)控機(jī)制無法正常發(fā)揮作用，var基因轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)重抑制，轉(zhuǎn)錄水平大幅下降。ApiAP2敲除株中var基因轉(zhuǎn)錄水平的變化可能會(huì)對瘧原蟲的免疫逃逸能力產(chǎn)生重要影響。由于var基因編碼的PfEMP1蛋白是瘧原蟲逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的關(guān)鍵分子，ApiAP2敲除導(dǎo)致var基因轉(zhuǎn)錄水平降低，進(jìn)而可能減少PfEMP1蛋白的表達(dá)量。這使得感染紅細(xì)胞表面的PfEMP1蛋白數(shù)量減少，降低了瘧原蟲與宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，增加了被宿主免疫系統(tǒng)識別和清除的風(fēng)險(xiǎn)。此外，PfEMP1蛋白表達(dá)量的減少還可能影響瘧原蟲表面抗原的多樣性，使宿主免疫系統(tǒng)更容易針對瘧原蟲產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而削弱瘧原蟲的免疫逃逸能力。5.2影響機(jī)制探討從分子層面來看，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄的影響可能與多個(gè)因素密切相關(guān)。首先，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子含有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識別并結(jié)合var基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在野生型瘧原蟲中，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子能夠與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的一段富含AT堿基的特定序列緊密結(jié)合。這一序列被認(rèn)為是ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子的核心結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到該位點(diǎn)后，能夠招募RNA聚合酶II以及其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)錄共激活因子等，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動(dòng)var基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)ApiAP2基因被敲除后，由于缺乏功能性的ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子，無法與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的核心結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物無法有效組裝，RNA聚合酶II難以募集到var基因啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而抑制了var基因的轉(zhuǎn)錄。在滋養(yǎng)體和裂殖體階段，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用更為明顯，這可能是因?yàn)樵诏懺x發(fā)育后期，var基因啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，變得更加開放，使得ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子更容易與核心結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)了對var基因轉(zhuǎn)錄的激活作用。ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可能通過參與調(diào)控染色質(zhì)重塑過程來影響var基因的轉(zhuǎn)錄。在惡性瘧原蟲中，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)對基因轉(zhuǎn)錄起著重要的調(diào)控作用。研究表明，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可以與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用，如SWI/SNF復(fù)合物等。在野生型瘧原蟲中，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子能夠招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物到var基因所在區(qū)域，通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使核小體的位置發(fā)生移動(dòng)或解聚，從而暴露var基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，增強(qiáng)var基因的轉(zhuǎn)錄活性。而在ApiAP2敲除株中，由于缺乏ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)，染色質(zhì)重塑復(fù)合物難以有效募集到var基因區(qū)域，導(dǎo)致var基因所在區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為緊密，核小體對啟動(dòng)子區(qū)域的覆蓋程度較高，阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制了var基因的轉(zhuǎn)錄。在裂殖體階段，野生型瘧原蟲中var基因所在區(qū)域的染色質(zhì)呈現(xiàn)高度開放狀態(tài)，有利于ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)重塑復(fù)合物協(xié)同作用，促進(jìn)var基因的高效轉(zhuǎn)錄。而ApiAP2敲除株中var基因區(qū)域的染色質(zhì)開放程度明顯降低，這與var基因轉(zhuǎn)錄水平的大幅下降密切相關(guān)。信號通路在ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子對var基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中也可能發(fā)揮重要作用。在惡性瘧原蟲中，存在多種信號通路參與基因表達(dá)的調(diào)控。研究推測，ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子可能通過響應(yīng)某些細(xì)胞內(nèi)信號，如蛋白激酶信號等，來調(diào)節(jié)var基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)瘧原蟲受到外界刺激或處于特定發(fā)育階段時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號通路被激活，信號分子通過一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，將信號傳遞給ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子。ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子在接受信號后，可能發(fā)生磷酸化修飾，從而改變其構(gòu)象和活性，增強(qiáng)其與var基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，或者招募更多的轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)var基因的轉(zhuǎn)錄。在ApiAP2敲除株中，由于缺少ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子的參與，信號通路對var基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用可能受到干擾。信號無法有效傳遞到var基因啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致var基因轉(zhuǎn)錄無法根據(jù)瘧原蟲的發(fā)育需求和外界環(huán)境變化進(jìn)行及時(shí)調(diào)整。在滋養(yǎng)體階段，當(dāng)瘧原蟲感知到宿主免疫系統(tǒng)的壓力時(shí)，野生型瘧原蟲可能通過激活特定的信號通路，促使ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)var基因的轉(zhuǎn)錄，以增強(qiáng)免疫逃逸能力。而ApiAP2敲除株無法正常響應(yīng)這一信號，var基因轉(zhuǎn)錄水平無法相應(yīng)提高，使得瘧原蟲的免疫逃逸能力減弱。六、研究成果與展望6.1研究成果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了惡性瘧原蟲ApiAP2敲除株，并對var基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了系統(tǒng)分析，取得了一系列重要成果。在ApiAP2敲除株構(gòu)建方面，運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，通過精準(zhǔn)設(shè)計(jì)靶點(diǎn)、高效構(gòu)建載體以及優(yōu)化轉(zhuǎn)染和篩選流程，成功獲得了ApiAP2基因敲除的惡性瘧原蟲株。經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證，確認(rèn)ApiAP2基因在預(yù)期靶點(diǎn)處發(fā)生了有效敲除，缺失了關(guān)鍵的功能區(qū)域。對敲除株的生物學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，ApiAP2基因缺失顯著影響了惡性瘧原蟲的生長繁殖和入侵能力。敲除株的生長曲線顯示其增殖速度明顯減緩，對數(shù)生長期延遲，峰值感染率降低，表明ApiAP2基因在瘧原蟲的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。入侵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除株對紅細(xì)胞的入侵率顯著下降，說明ApiAP2基因參與調(diào)控瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的過程，其缺失可能影響了瘧原蟲與紅細(xì)胞表面受體的識別和結(jié)合，或者干擾了入侵相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能。在var基因轉(zhuǎn)錄分析方面，采用RT-qPCR技術(shù)，對野生型和ApiAP2敲除株在不同發(fā)育階段的var基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，在野生型瘧原蟲中