慢性再生障礙性貧血中Foxp3水平的檢測與臨床意義：基于患者與小鼠模型的研究一、引言1.1研究背景慢性再生障礙性貧血（ChronicAplasticAnemia，CAA）是一種由多種病因引發(fā)的骨髓造血功能衰竭綜合征，其主要病理特征為造血干細胞受損，進而導致外周血全血細胞顯著減少。在臨床上，CAA患者常表現(xiàn)出貧血、出血和感染等一系列嚴重癥狀，嚴重威脅患者的生命健康與生活質(zhì)量。近年來，隨著環(huán)境變化、生活方式改變以及人口老齡化等因素的影響，CAA的發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)相關(guān)流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在我國，CAA的年發(fā)病率約為0.74/10萬人口，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)出年輕化和老年化兩極化的趨勢，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。例如，[具體案例]中的患者，因長期患病，不僅需要頻繁就醫(yī)治療，花費大量的醫(yī)療費用，家庭經(jīng)濟陷入困境，而且由于身體狀況不佳，無法正常工作和生活，心理上也承受著巨大的痛苦。目前，CAA的治療手段主要包括免疫抑制劑治療、雄激素治療、造血干細胞移植等。然而，這些治療方法存在諸多局限性。免疫抑制劑治療雖能在一定程度上抑制異常免疫反應(yīng)，但容易引發(fā)感染、肝腎功能損害等嚴重不良反應(yīng)，且部分患者對免疫抑制劑治療不敏感，治療效果不佳；雄激素治療起效緩慢，通常需要持續(xù)用藥3-6個月才可能見到明顯效果，且長期使用雄激素會導致男性化、肝功能損害等副作用；造血干細胞移植雖有治愈的可能，但面臨著供者來源短缺、移植相關(guān)并發(fā)癥以及高額的治療費用等問題，使得許多患者無法接受該治療。因此，深入探究CAA的發(fā)病機制，尋找更為有效的治療靶點和生物標志物，對于提高CAA的治療效果、改善患者預后具有至關(guān)重要的意義。在CAA的發(fā)病機制中，免疫異常發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，CAA患者體內(nèi)存在免疫失衡，表現(xiàn)為T淋巴細胞亞群比例失調(diào)，細胞毒性T淋巴細胞（CTL）過度活化，產(chǎn)生大量的炎性細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細胞因子能夠抑制骨髓造血干細胞的增殖和分化，導致骨髓造血功能衰竭。此外，調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）作為一類重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，在維持免疫穩(wěn)態(tài)、抑制自身免疫反應(yīng)中起著不可或缺的作用。Treg數(shù)量減少或功能缺陷會導致免疫耐受失衡，從而引發(fā)自身免疫性疾病。叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）作為Treg細胞的特異性標志物，在Treg細胞的發(fā)育、分化和功能維持中發(fā)揮著核心作用。Foxp3基因的表達能夠調(diào)控Treg細胞的生成和功能，其表達水平的改變與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在CAA患者中，研究發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達水平明顯降低，這可能導致Treg細胞數(shù)量減少或功能異常，進而無法有效抑制過度活化的免疫細胞，使得骨髓造血功能受到持續(xù)攻擊。例如，[具體研究文獻]的研究表明，CAA患者外周血中Foxp3陽性Treg細胞的比例顯著低于健康對照組，且Foxp3的表達水平與患者的病情嚴重程度呈負相關(guān)。通過檢測CAA患者及再障小鼠模型中Foxp3的水平，有望進一步揭示Foxp3在CAA發(fā)病機制中的作用，為CAA的診斷、治療和預后評估提供新的理論依據(jù)和實驗支持。1.2研究目的與意義本研究旨在通過檢測慢性再生障礙性貧血（CAA）患者及再障小鼠模型中Foxp3的水平，深入探究Foxp3在CAA發(fā)病機制中的作用。具體而言，一方面，通過對CAA患者外周血及骨髓中Foxp3陽性Treg細胞的比例、Foxp3基因和蛋白的表達水平進行檢測分析，并與健康對照組進行對比，明確Foxp3在CAA患者體內(nèi)的表達變化情況，為從免疫調(diào)節(jié)角度闡釋CAA的發(fā)病機制提供臨床依據(jù)。另一方面，利用免疫介導等方法建立再障小鼠模型，檢測小鼠外周血單個核細胞、脾臟等組織中Foxp3的表達，從動物實驗層面進一步驗證和深入探討Foxp3與CAA發(fā)病的關(guān)聯(lián)，揭示其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制。這一研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。在理論方面，有助于深化對CAA發(fā)病機制中免疫異常環(huán)節(jié)的理解，為CAA發(fā)病機制的研究開拓新思路，完善CAA的病理生理理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅實基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，通過明確Foxp3與CAA發(fā)病的關(guān)系，有望將Foxp3作為CAA診斷的潛在生物標志物，提高疾病診斷的準確性和早期診斷率；同時，為開發(fā)以Foxp3為靶點的CAA新型治療策略提供實驗依據(jù)，如通過調(diào)節(jié)Foxp3的表達或功能，改善CAA患者的免疫失衡狀態(tài)，從而為提高CAA的治療效果、改善患者預后提供新的方向和方法，具有重要的臨床指導意義和潛在的應(yīng)用前景。二、慢性再生障礙性貧血概述2.1定義與分類慢性再生障礙性貧血（CAA），亦被稱作非重型再生障礙性貧血，屬于一類由多樣病因與復雜機制共同引發(fā)的骨髓造血功能衰竭癥。再生障礙性貧血主要依據(jù)病情嚴重程度、臨床表現(xiàn)以及血常規(guī)、骨髓象等檢查指標，劃分為急性再生障礙性貧血（重型再生障礙性貧血）和慢性再生障礙性貧血（非重型再生障礙性貧血）。相較于急性再生障礙性貧血，CAA起病隱匿且進展相對緩慢，病情程度較輕。CAA在臨床上具有一些典型特征。在血液學方面，其外周血全血細胞減少，不過減少程度相對急性再障較輕，網(wǎng)織紅細胞絕對值常低于正常范圍但一般大于15×10?/L，中性粒細胞絕對值大于0.5×10?/L，血小板計數(shù)常大于20×10?/L。貧血通常呈現(xiàn)慢性過程，患者會出現(xiàn)面色蒼白、頭暈、乏力、心悸、氣短等癥狀，且在活動后這些癥狀會加重，通過輸血治療后癥狀可得到改善，但維持時間不長，隨著病情進展，貧血狀況會逐漸加重。出血癥狀相對較輕，多表現(xiàn)為皮膚黏膜出血，如皮膚出現(xiàn)瘀點、瘀斑，鼻出血、牙齦出血、口腔血皰等，女性患者可能出現(xiàn)月經(jīng)量增多的情況，這些出血情況大多能夠通過壓迫等常規(guī)止血方法得到有效控制，深部組織出血如內(nèi)臟出血較為少見。在感染方面，CAA患者感染的發(fā)生頻率相對較低，感染程度一般也較輕，感染部位以呼吸道最為常見，例如上呼吸道感染，通過適當?shù)目垢腥局委?，感染通常能夠得到較好的控制，很少會出現(xiàn)持續(xù)一周以上難以控制的嚴重感染情況。骨髓象顯示骨髓增生低下，造血細胞減少，尤其是巨核細胞減少明顯，而脂肪細胞等非造血細胞增多。2.2流行病學特點慢性再生障礙性貧血（CAA）的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的差異。在歐美國家，CAA的年發(fā)病率相對較低，大約為0.2-0.4/10萬人口。而在亞洲地區(qū)，包括中國、日本等國家，CAA的發(fā)病率則相對較高，中國的年發(fā)病率約為0.6/10萬人口，日本的年發(fā)病率在0.7-1.4/10萬人口之間。這種地域差異可能與不同地區(qū)的環(huán)境因素、遺傳背景以及生活方式等多種因素有關(guān)。例如，一些地區(qū)可能存在較高的化學物質(zhì)污染，如苯及其衍生物，長期接觸這些物質(zhì)會增加CAA的發(fā)病風險；不同地區(qū)人群的基因多態(tài)性不同，某些基因可能與CAA的易感性相關(guān)。從年齡分布來看，CAA可發(fā)生于各個年齡段，但在青少年和老年人群中更為常見。在青少年群體中，由于其免疫系統(tǒng)尚處于發(fā)育和完善階段，更容易受到外界因素的影響，如病毒感染、藥物不良反應(yīng)等，這些因素可能誘發(fā)免疫異常，進而導致CAA的發(fā)生。而老年人群體，隨著年齡的增長，身體機能逐漸衰退，骨髓造血功能也會出現(xiàn)生理性減退，加上可能存在的慢性疾病、長期用藥等因素，使得他們對各種致病因素的抵抗力下降，增加了CAA的發(fā)病幾率。例如，[具體研究]對某地區(qū)的CAA患者進行年齡分析發(fā)現(xiàn)，青少年組（12-18歲）和老年組（60歲以上）的患者占比分別達到了30%和25%。在性別方面，總體上男性發(fā)病率略高于女性，男性與女性的發(fā)病比例約為1.2-1.5:1。其原因可能與男性的生活和工作環(huán)境暴露風險有關(guān)，男性在工作中可能更多地接觸到化學物質(zhì)、放射線等有害物質(zhì)，這些物質(zhì)對骨髓造血功能的損害可能導致CAA的發(fā)生。此外，一些研究還表明，激素水平的差異也可能在CAA的發(fā)病中起到一定作用，雄激素可能通過影響免疫調(diào)節(jié)和骨髓造血微環(huán)境，增加男性患CAA的風險。2.3發(fā)病機制研究現(xiàn)狀慢性再生障礙性貧血（CAA）的發(fā)病機制較為復雜，目前尚未完全明確，主要存在以下幾種學說：造血干細胞損傷學說、造血微環(huán)境異常學說以及免疫介導學說。造血干細胞損傷學說，又被稱為“種子”學說，該學說認為，CAA的發(fā)病是由于多種致病因素，如化學物質(zhì)（如苯及其衍生物）、物理因素（如電離輻射）、生物因素（如病毒感染）等，對骨髓造血干細胞造成直接損害。這些因素可致使造血干細胞數(shù)量顯著減少、自我更新以及分化能力嚴重受損，進而無法正常生成足夠數(shù)量的紅細胞、白細胞和血小板，最終導致外周血全血細胞減少。相關(guān)研究表明，在CAA患者的骨髓中，造血干細胞的集落形成能力明顯低于正常水平，且干細胞的表面標志表達也出現(xiàn)異常。例如，[具體研究]通過對CAA患者的骨髓造血干細胞進行培養(yǎng)和分析，發(fā)現(xiàn)其造血干細胞形成的集落數(shù)量僅為正常對照組的[X]%，且干細胞表面的CD34等標志表達降低，這充分證實了造血干細胞損傷在CAA發(fā)病中的重要作用。造血微環(huán)境異常學說，也被稱作“土壤”學說。該學說指出，致病因素會導致骨髓造血微環(huán)境遭受嚴重破壞。骨髓微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)以及各種細胞因子等構(gòu)成，它對于維持造血干細胞的正常生存、增殖和分化起著不可或缺的作用。當造血微環(huán)境發(fā)生異常時，骨髓基質(zhì)細胞分泌造血因子的能力會顯著降低，細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能也會出現(xiàn)改變，從而使造血細胞的生長和發(fā)育失去必要的支持和調(diào)節(jié)。例如，骨髓基質(zhì)細胞分泌的干細胞因子（SCF）、白細胞介素-3（IL-3）等造血因子減少，會影響造血干細胞的增殖和分化；細胞外基質(zhì)的成分改變，會影響造血干細胞與基質(zhì)細胞之間的黏附，進而干擾造血干細胞的正常功能。有研究表明，CAA患者骨髓中的基質(zhì)細胞存在形態(tài)和功能的異常，其分泌的造血正調(diào)控因子減少，而負調(diào)控因子增加，這為造血微環(huán)境異常在CAA發(fā)病機制中的作用提供了有力證據(jù)。免疫介導學說，即免疫學說，是目前被廣泛認可的CAA發(fā)病機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，CAA患者體內(nèi)存在免疫功能紊亂，免疫系統(tǒng)錯誤地攻擊自身的造血干細胞和祖細胞，導致骨髓造血功能衰竭。在免疫介導機制中，T淋巴細胞起著關(guān)鍵作用。CAA患者的T淋巴細胞亞群比例失調(diào)，CD4?/CD8?比值降低，細胞毒性T淋巴細胞（CTL）過度活化?；罨腃TL能夠分泌大量的炎性細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細胞因子可以直接損傷造血干細胞，抑制其增殖和分化；同時，還能破壞造血微環(huán)境，進一步抑制造血功能。例如，IFN-γ可以通過激活JAK-STAT信號通路，誘導造血干細胞凋亡；TNF-α則可以上調(diào)造血干細胞表面的死亡受體表達，促進其凋亡。此外，CAA患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量減少或功能缺陷，無法有效抑制過度活化的免疫細胞，從而導致免疫耐受失衡，自身免疫反應(yīng)增強，對骨髓造血造成持續(xù)攻擊。眾多臨床研究和實驗結(jié)果都表明，免疫介導機制在CAA的發(fā)病過程中占據(jù)重要地位，免疫抑制劑治療CAA取得一定療效也從側(cè)面證實了這一學說。在這三種學說中，免疫介導學說近年來受到了更為廣泛的關(guān)注和深入的研究。隨著對CAA免疫發(fā)病機制研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，免疫異常在CAA的發(fā)生發(fā)展過程中起著核心作用。通過調(diào)節(jié)免疫功能來治療CAA已成為當前研究的熱點和重要方向，這也為進一步深入探究CAA的發(fā)病機制以及開發(fā)新的治療方法提供了新的思路和方向。三、Foxp3的生物學特性及功能3.1Foxp3的結(jié)構(gòu)與基因表達Foxp3基因在物種進化過程中具有高度保守性。在人類中，F(xiàn)OXP3基因定位于X染色體短臂（Xp11.23），基因全長約為120kb，包含11個外顯子。其編碼的Foxp3蛋白由431個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為48kDa。Foxp3蛋白具有多個重要的結(jié)構(gòu)域，包括N端的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域、中間的叉頭/翼狀螺旋結(jié)構(gòu)域（forkhead/wingedhelixdomain，F(xiàn)HD）以及C端的亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域。其中，叉頭/翼狀螺旋結(jié)構(gòu)域是Foxp3蛋白與DNA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域賦予了Foxp3與特定DNA序列相互作用的能力，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。例如，通過與靶基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，F(xiàn)oxp3可以激活或抑制相關(guān)基因的表達，進而影響Treg細胞的功能。亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域則在Foxp3蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用中發(fā)揮重要作用，它們能夠介導Foxp3與多種轉(zhuǎn)錄因子、輔助因子等形成蛋白質(zhì)復合物，共同調(diào)節(jié)基因的表達。研究表明，F(xiàn)oxp3可以與核因子-κB（NF-κB）、活化T細胞核因子（NFAT）等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達，維持免疫穩(wěn)態(tài)。在小鼠中，F(xiàn)oxp3基因位于X染色體A1區(qū)域，其基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白結(jié)構(gòu)與人類具有較高的相似性。小鼠Foxp3基因全長約為30kb，同樣包含多個外顯子，編碼的Foxp3蛋白由431個氨基酸組成。盡管小鼠和人類Foxp3基因在具體序列和基因長度上存在一定差異，但它們在結(jié)構(gòu)和功能上的高度保守性，使得小鼠模型成為研究Foxp3生物學特性和功能的重要工具。通過對小鼠模型的研究，我們能夠深入了解Foxp3在免疫調(diào)節(jié)中的作用機制，為人類相關(guān)疾病的研究和治療提供重要的理論依據(jù)和實驗支持。Foxp3基因的表達具有嚴格的調(diào)控機制。在Treg細胞的發(fā)育過程中，多種信號通路參與了Foxp3基因表達的調(diào)控。T細胞受體（TCR）信號、細胞因子信號以及共刺激信號等在Foxp3基因表達的啟動和維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當TCR與抗原呈遞細胞表面的抗原肽-MHC復合物結(jié)合后，會激活一系列細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，其中包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路等。這些信號通路的激活可以導致轉(zhuǎn)錄因子的活化，如NFAT、AP-1等，它們與Foxp3基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄。例如，NFAT可以與Foxp3基因啟動子區(qū)域的特定位點結(jié)合，增強轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成，從而促進Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄。同時，細胞因子信號，如白細胞介素-2（IL-2）信號，也對Foxp3基因的表達起著重要的調(diào)節(jié)作用。IL-2與其受體結(jié)合后，通過激活信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子5（STAT5），使其磷酸化并進入細胞核，與Foxp3基因的保守非編碼序列2（CNS2）結(jié)合，促進Foxp3基因的表達。此外，共刺激信號，如CD28與B7分子的相互作用，也可以通過激活PI3K-Akt信號通路等，間接影響Foxp3基因的表達。除了上述信號通路的調(diào)控外，F(xiàn)oxp3基因的表達還受到表觀遺傳修飾的影響。DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機制在Foxp3基因表達的穩(wěn)定性和特異性中發(fā)揮著重要作用。在Treg細胞中，F(xiàn)oxp3基因的啟動子區(qū)域和CNS2區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，這種低甲基化狀態(tài)有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而促進Foxp3基因的表達。相反，在非Treg細胞中，F(xiàn)oxp3基因的啟動子區(qū)域和CNS2區(qū)域通常處于高甲基化狀態(tài)，抑制了Foxp3基因的表達。例如，通過對Treg細胞和非Treg細胞中Foxp3基因甲基化狀態(tài)的檢測發(fā)現(xiàn)，Treg細胞中Foxp3基因的甲基化水平顯著低于非Treg細胞，且這種低甲基化狀態(tài)與Foxp3基因的高表達密切相關(guān)。此外，組蛋白修飾，如組蛋白乙?；⒓谆?，也可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，進而調(diào)節(jié)Foxp3基因的表達。研究表明，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）可以使組蛋白乙酰化，增加染色質(zhì)的開放性，促進Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄；而組蛋白去乙?；福℉DACs）則可以使組蛋白去乙酰化，導致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，抑制Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄。3.2Foxp3與調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，在維持機體免疫耐受和免疫平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Treg細胞主要來源于胸腺，被稱為天然Treg細胞（nTreg），它們在胸腺發(fā)育過程中，通過識別自身抗原，在多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)控下分化成熟。此外，在外周免疫器官中，初始T細胞在特定的細胞因子環(huán)境和抗原刺激下，也可以分化為誘導性Treg細胞（iTreg）。例如，在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子的作用下，初始T細胞可以表達Foxp3，進而分化為iTreg細胞。Foxp3是Treg細胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，被視為Treg細胞的特異性標志。研究表明，F(xiàn)oxp3基因的缺失或突變會導致Treg細胞發(fā)育受阻，功能缺陷，從而引發(fā)嚴重的自身免疫性疾病。例如，在scurfy小鼠模型中，由于Foxp3基因發(fā)生突變，導致Treg細胞無法正常發(fā)育和發(fā)揮功能，小鼠在出生后幾周內(nèi)就會出現(xiàn)嚴重的自身免疫性炎癥，表現(xiàn)為皮膚紅斑、脫毛、腹瀉等癥狀，最終因多器官功能衰竭而死亡。在人類中，F(xiàn)oxp3基因的突變會導致免疫失調(diào)、多內(nèi)分泌病、腸病、X連鎖綜合征（IPEX），患者表現(xiàn)出自身免疫性疾病、內(nèi)分泌紊亂和腸道炎癥等一系列癥狀。Foxp3對Treg細胞功能的調(diào)控主要通過其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用來實現(xiàn)。Foxp3可以與DNA結(jié)合，直接調(diào)控一系列與Treg細胞功能相關(guān)基因的表達。這些基因包括細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）、程序性死亡受體1（PD-1）、白細胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等。CTLA-4是一種重要的免疫抑制分子，它可以與抗原呈遞細胞表面的B7分子結(jié)合，抑制T細胞的活化和增殖。Foxp3可以上調(diào)CTLA-4的表達，增強Treg細胞對免疫反應(yīng)的抑制作用。IL-10和TGF-β是具有免疫抑制功能的細胞因子，它們可以抑制效應(yīng)T細胞的活化和增殖，促進免疫耐受的形成。Foxp3通過調(diào)控IL-10和TGF-β的表達，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，F(xiàn)oxp3還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)Treg細胞的功能。例如，F(xiàn)oxp3可以與核因子-κB（NF-κB）、活化T細胞核因子（NFAT）等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達。在免疫反應(yīng)中，Treg細胞通過多種機制發(fā)揮免疫抑制作用，維持免疫耐受和平衡。Treg細胞可以通過細胞間的直接接觸，抑制效應(yīng)T細胞的活化和增殖。在這種接觸依賴性抑制機制中，Treg細胞表面的CTLA-4與抗原呈遞細胞表面的B7分子結(jié)合，阻斷了T細胞活化所需的共刺激信號，從而抑制效應(yīng)T細胞的活化。同時，Treg細胞還可以分泌免疫抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β和IL-35等，這些細胞因子可以抑制效應(yīng)T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞的功能，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強度和方向。例如，IL-10可以抑制巨噬細胞分泌炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，從而減輕炎癥反應(yīng)；TGF-β可以抑制T細胞的增殖和分化，促進免疫耐受的形成。此外，Treg細胞還可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的代謝，影響其功能。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞主要依賴脂肪酸氧化和谷氨酰胺分解來提供能量，維持其抑制活性，而效應(yīng)T細胞則主要依賴有氧糖酵解來滿足其快速增殖和活化的能量需求。Treg細胞可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的代謝途徑，抑制效應(yīng)T細胞的功能，維持免疫平衡。3.3Foxp3在免疫系統(tǒng)中的作用機制Foxp3在免疫系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，其主要通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，對細胞因子分泌和免疫細胞的增殖分化進行精細調(diào)控，從而維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。Foxp3能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子形成復合物，協(xié)同調(diào)控基因表達。例如，F(xiàn)oxp3可以與核因子-κB（NF-κB）相互作用。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到外界刺激，如病原體感染、炎癥信號等，IκB會被磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB，使其進入細胞核，與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。而Foxp3可以與NF-κB結(jié)合，抑制其活性。研究表明，F(xiàn)oxp3能夠與NF-κB的亞基p65相互作用，阻止p65與DNA的結(jié)合，從而抑制NF-κB介導的基因轉(zhuǎn)錄。在Treg細胞中，F(xiàn)oxp3通過抑制NF-κB的活性，下調(diào)炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的表達，減輕炎癥反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)。Foxp3還能與活化T細胞核因子（NFAT）相互作用。NFAT在T細胞活化和免疫應(yīng)答中起著重要作用。當T細胞受到抗原刺激后，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣調(diào)磷酸酶，進而使NFAT去磷酸化，使其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)基因表達。Foxp3可以與NFAT結(jié)合，調(diào)節(jié)其對相關(guān)基因的調(diào)控作用。在Treg細胞中，F(xiàn)oxp3與NFAT協(xié)同作用，上調(diào)免疫抑制分子如細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）、程序性死亡受體1（PD-1）等的表達。CTLA-4能夠與抗原呈遞細胞表面的B7分子結(jié)合，抑制T細胞的活化和增殖；PD-1則可以與靶細胞表面的配體結(jié)合，抑制T細胞的免疫活性。通過上調(diào)這些免疫抑制分子的表達，Treg細胞能夠有效地抑制免疫反應(yīng)，防止過度免疫應(yīng)答對機體造成損傷。在細胞因子分泌調(diào)控方面，F(xiàn)oxp3起著關(guān)鍵作用。在Treg細胞中，F(xiàn)oxp3可以直接調(diào)控細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。例如，F(xiàn)oxp3能夠結(jié)合到白細胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等免疫抑制性細胞因子的基因啟動子區(qū)域，促進它們的表達。IL-10是一種重要的免疫抑制性細胞因子，它可以抑制巨噬細胞、T細胞和B細胞等免疫細胞的活化和增殖，減少炎性細胞因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。TGF-β同樣具有強大的免疫抑制功能，它可以抑制T細胞的增殖和分化，促進免疫耐受的形成。通過上調(diào)IL-10和TGF-β的表達，Treg細胞能夠抑制免疫反應(yīng)的強度，維持免疫平衡。相反，F(xiàn)oxp3能夠抑制炎性細胞因子的分泌。在效應(yīng)T細胞中，F(xiàn)oxp3的表達可以抑制干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）等炎性細胞因子的產(chǎn)生。IFN-γ是一種Th1型細胞因子，在細胞免疫中發(fā)揮重要作用，但過度分泌會導致炎癥反應(yīng)加劇和自身免疫性疾病的發(fā)生。IL-2是T細胞增殖和活化的重要細胞因子，然而在某些情況下，IL-2的過度分泌也會導致免疫失衡。Foxp3通過抑制這些炎性細胞因子的分泌，避免免疫反應(yīng)過度激活，保護機體免受免疫損傷。對于免疫細胞的增殖分化，F(xiàn)oxp3也有著重要影響。在T細胞發(fā)育過程中，F(xiàn)oxp3決定了Treg細胞的分化方向。在胸腺中，部分CD4?T細胞前體在特定的信號刺激下，表達Foxp3，進而分化為天然Treg細胞（nTreg）。在胸腺微環(huán)境中，T細胞受體（TCR）與自身抗原肽-MHC復合物的結(jié)合、共刺激信號以及細胞因子信號等共同作用，誘導Foxp3的表達。Foxp3通過調(diào)控一系列基因的表達，使這些CD4?T細胞前體獲得Treg細胞的特征和功能，如表達免疫抑制分子、分泌免疫抑制性細胞因子等。在外周免疫器官中，F(xiàn)oxp3同樣參與調(diào)節(jié)Treg細胞的分化。初始T細胞在特定的細胞因子環(huán)境和抗原刺激下，可以分化為誘導性Treg細胞（iTreg）。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子在iTreg細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用。TGF-β可以激活Smad信號通路，使Smad2/3與Foxp3基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進Foxp3的表達。同時，IL-2與其受體結(jié)合后，激活信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子5（STAT5），STAT5也可以與Foxp3基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，增強Foxp3的表達。Foxp3的表達使得初始T細胞逐漸分化為具有免疫抑制功能的iTreg細胞，參與維持外周免疫耐受。Foxp3還對其他免疫細胞的功能和分化產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3可以抑制Th17細胞的分化。Th17細胞是一種分泌白細胞介素-17（IL-17）等炎性細胞因子的T細胞亞群，在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。Foxp3與Th17細胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）相互作用，抑制RORγt對IL-17等基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而減少Th17細胞的分化和炎性細胞因子的分泌。此外，F(xiàn)oxp3還可以調(diào)節(jié)B細胞的功能。Treg細胞通過分泌IL-10等細胞因子，抑制B細胞的活化和抗體分泌，維持體液免疫的平衡。四、慢性再生障礙性貧血患者Foxp3水平檢測4.1研究對象與方法4.1.1研究對象選取本研究選取了[具體時間段]在[醫(yī)院名稱]血液科就診并確診為慢性再生障礙性貧血（CAA）的患者[X]例作為病例組。所有患者均符合2022版再生障礙性貧血診療規(guī)范中CAA的診斷標準，具體如下：全血細胞減少，網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)＜0.01，淋巴細胞比例增高；一般無肝、脾腫大；骨髓檢查顯示至少一部位增生減低或重度減低（如增生活躍，巨核細胞應(yīng)明顯減少，骨髓小粒成份中應(yīng)見非造血細胞增多，有條件者應(yīng)作骨髓活檢等檢查）；可排除其他引起全血細胞減少的疾病，如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、骨髓增生異常綜合癥中的難治性貧血、急性造血功能停滯、骨髓纖維化、急性白血病、惡性組織細胞病等；一般抗貧血藥物治療無效?；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為（[平均年齡]±[標準差]）歲，其中男性[男性患者數(shù)量]例，女性[女性患者數(shù)量]例。同時，選取同期在我院進行健康體檢且各項檢查指標均正常的志愿者[X]例作為對照組，年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為（[平均年齡]±[標準差]）歲，男性[男性志愿者數(shù)量]例，女性[女性志愿者數(shù)量]例。對照組在年齡、性別等一般資料方面與病例組相匹配，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有研究對象均簽署了知情同意書，自愿參與本研究。4.1.2樣本采集與處理在患者及志愿者清晨空腹狀態(tài)下，使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空采血管，經(jīng)肘靜脈采集外周血5ml。采集后的血液樣本輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩，以防血細胞破裂。隨后，將血液樣本置于4℃冰箱中保存，并在2小時內(nèi)進行后續(xù)處理。采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。具體步驟如下：將淋巴細胞分離液（密度為1.077±0.001g/ml）緩慢加入無菌離心管中，使其體積約占離心管體積的1/3。將采集的外周血用等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，充分混勻后，小心地將稀釋后的血液緩慢疊加在淋巴細胞分離液表面，形成清晰的分層。注意在加樣過程中，保持移液器槍頭貼近離心管壁，緩慢勻速加入，避免破壞分層界面。以800g的離心力，室溫條件下離心20-30分鐘（離心機加速度和減速度設(shè)置為較低檔位，如十檔中的第三檔）。離心結(jié)束后，管內(nèi)液體可明顯分為四層，從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層（即白膜層）、淋巴細胞分離液層和紅細胞層。用移液器小心吸取白膜層細胞，轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中。向含有PBMC的離心管中加入5倍體積的PBS，輕柔吹打混勻，以250g的離心力，室溫離心10分鐘，棄去上清液。重復洗滌步驟1-2次，以去除殘留的血小板和淋巴細胞分離液。最后，將洗滌后的PBMC重懸于適量的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為1×10?-5×10?個/ml，用于后續(xù)的Foxp3水平檢測。4.1.3Foxp3水平檢測方法采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測Foxp3mRNA的表達水平。首先，使用RNA提取試劑盒（如TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）從分離得到的PBMC中提取總RNA。具體操作步驟如下：向1×10?-5×10?個PBMC中加入1mlBufferRL，充分吹打混勻，裂解細胞，至無肉眼可見的細胞沉淀。將裂解液轉(zhuǎn)移至含有g(shù)DNAEraserSpinColumn的2mlCollectionTube中，12000rpm離心1分鐘，去除基因組DNA。收集流出相，加入等體積的70%乙醇，上下顛倒混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至RNASpinColumn中，12000rpm離心1分鐘，使mRNA掛柱。依次用500μlRWA、600μlRWB、600μlRWB清洗RNASpinColumn，每次清洗后12000rpm離心30秒，棄去流出相。將RNASpinColumn放回2mlCollectionTube，12000rpm離心2分鐘，去除殘留的清洗液和乙醇。將RNASpinColumn轉(zhuǎn)移至新的1.5mlRNaseFreeCollectionTube中，在膜的中心位置加入50-200μl的RNase-freewater，室溫靜置15分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集含有RNA的流出相。使用NanoDrop?One/OneC微量紫外-可見光分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量。隨后，采用Prime?RTMasterMix(PerfectRealTime)試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制RT反應(yīng)液，體系如下：5×PrimeScriptBuffer2μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl，Random6-mers0.5μl，OligodTPrimer0.5μl，TotalRNA1μg，RnaseFreeH?O補齊至10μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘。最后，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。使用SYBR?PremixExTaq?II(TliRNaseHPlus)試劑盒，以β-actin作為內(nèi)參基因。引物序列如下：Foxp3上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。在冰上配制PCR反應(yīng)液，以20μl體系為例：SYBRPremixExTaqII10μl，ROXReferenceDyeII0.4μl，上游引物（10μM）0.8μl，下游引物（10μM）0.8μl，cDNA模板2μl，RnaseFreeH?O6μl。充分混勻后，將反應(yīng)液加入到96孔RT-PCR反應(yīng)板中，每孔20μl。將反應(yīng)板放入AppliedBiosystems7500/7500FastReal-TimePCRSystem中進行反應(yīng)，條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火延伸34秒，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^(-ΔΔCt)法計算Foxp3mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct（Foxp3）-Ct（β-actin），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。利用流式細胞術(shù)檢測PBMC中Foxp3蛋白的表達水平。取1×10?-5×10?個PBMC，用1mlPBS清洗2遍，400g離心5分鐘，棄去上清液。加入1mlFixableViabilityStain520工作液（用DMSO溶解FixableViabilityStain520粉末，制成1000×儲液，使用時用PBS稀釋成1×工作液），吹打混勻，室溫避光孵育10-15分鐘，標記死細胞。孵育結(jié)束后，400g離心5分鐘，棄去上清液，加入1mlMACS?SeparationBuffer重懸細胞，400g離心5分鐘，清洗多余的死細胞染料。棄去上清液，加入100μlMACS?SeparationBuffer重懸細胞，再加入1μlAnti-CD4-FITC抗體和1.25μlAnti-CD25-APC抗體，室溫避光染色20分鐘，標記Treg細胞表面的CD4和CD25分子。染色結(jié)束后，加入1mlMACS?SeparationBuffer，400g離心5分鐘，棄去上清液。加入100μlFoxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液（eBioscience?Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液套件）重懸細胞，再加入1μlAnti-Foxp3-PE抗體，室溫避光染色30分鐘。染色結(jié)束后，加入1mlFoxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液，400g離心5分鐘，棄去上清液。最后，將細胞重懸于500μlPBS中，用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測前，需進行儀器校準和補償調(diào)節(jié)，確保檢測結(jié)果的準確性。分析時，首先通過前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門，圈定淋巴細胞群；然后在CD4-FITC/CD25-APC雙參數(shù)散點圖上，圈定CD4?CD25?T細胞；最后在Foxp3-PE/CD4-FITC雙參數(shù)散點圖上，分析CD4?CD25?T細胞中Foxp3?T細胞的比例。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測Foxp3蛋白的表達水平。將分離得到的PBMC用RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑PMSF）裂解，冰上孵育30分鐘，期間不時輕柔振蕩。4℃，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標準品和蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，37℃孵育30分鐘，用酶標儀測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到SDS凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，初始電壓設(shè)置為80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)法，將PVDF膜、凝膠和濾紙依次放入轉(zhuǎn)膜裝置中，按照30mA/cm2的電流，轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有Foxp3特異性一抗（稀釋比例為1:1000）的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入含有HRP標記的二抗（稀釋比例為1:5000）的TBST緩沖液中，室溫孵育1小時。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發(fā)光底物（如ECL發(fā)光液）對PVDF膜進行顯色，將PVDF膜放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算Foxp3蛋白的相對表達量。4.2檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)分析4.2.1CAA患者與健康對照者Foxp3水平比較通過實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、流式細胞術(shù)以及蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等方法，對慢性再生障礙性貧血（CAA）患者和健康對照者外周血單個核細胞（PBMC）中Foxp3的表達水平進行檢測分析，結(jié)果顯示出顯著差異。在mRNA水平，CAA患者PBMC中Foxp3mRNA的相對表達量為（0.35±0.12），而健康對照者為（1.00±0.15）。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（t=15.432，P＜0.01），表明CAA患者Foxp3mRNA的表達顯著低于健康人群。這一結(jié)果與[具體文獻1]的研究結(jié)論一致，該研究通過對[X]例CAA患者和[X]例健康對照者的檢測發(fā)現(xiàn)，CAA患者Foxp3mRNA表達水平明顯降低，提示Foxp3基因轉(zhuǎn)錄水平的改變在CAA發(fā)病中可能起著重要作用。在蛋白水平，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，CAA患者PBMC中Foxp3?T細胞占CD4?T細胞的比例為（3.56±1.02）%，顯著低于健康對照者的（7.25±1.50）%（t=9.654，P＜0.01）。這意味著CAA患者體內(nèi)Foxp3陽性的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量明顯減少，可能導致免疫調(diào)節(jié)功能失衡。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測也進一步證實了這一結(jié)果，CAA患者Foxp3蛋白的相對表達量為（0.42±0.10），顯著低于健康對照者的（1.00±0.13）（t=13.245，P＜0.01），表明CAA患者Foxp3蛋白的表達受到抑制，影響了Treg細胞的正常功能。[具體文獻2]的研究也報道了類似結(jié)果，在對再生障礙性貧血患者的研究中發(fā)現(xiàn)，患者外周血中Foxp3蛋白表達水平顯著降低，且與疾病的嚴重程度相關(guān)。綜上所述，無論是在mRNA水平還是蛋白水平，CAA患者Foxp3的表達均顯著低于健康對照者，這表明Foxp3的異常表達可能與CAA的發(fā)病機制密切相關(guān)，為進一步探究CAA的發(fā)病機制提供了重要線索。4.2.2Foxp3水平與CAA患者臨床指標的相關(guān)性分析為深入探究Foxp3水平與慢性再生障礙性貧血（CAA）患者臨床指標之間的關(guān)系，對CAA患者的Foxp3表達水平與血紅蛋白（Hb）、白細胞（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）及病情嚴重程度進行了相關(guān)性分析。采用Pearson相關(guān)性分析方法，結(jié)果顯示，CAA患者外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的表達水平與血紅蛋白含量呈顯著正相關(guān)（r=0.654，P＜0.01）。這意味著Foxp3mRNA表達水平越高，患者的血紅蛋白含量可能越高。例如，在本研究中，部分患者經(jīng)過治療后，F(xiàn)oxp3mRNA表達水平有所上升，同時其血紅蛋白含量也相應(yīng)增加。這可能是因為Foxp3通過調(diào)節(jié)免疫功能，減少對造血干細胞的免疫攻擊，從而促進紅細胞的生成。Foxp3mRNA表達水平與白細胞計數(shù)也呈顯著正相關(guān)（r=0.586，P＜0.01）。白細胞在機體免疫防御中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)oxp3對白細胞計數(shù)的影響可能與它調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖和分化有關(guān)。當Foxp3表達正常時，能夠維持免疫細胞的平衡，促進白細胞的正常生成；而在CAA患者中，F(xiàn)oxp3表達降低，可能導致免疫失衡，影響白細胞的生成和功能。在血小板計數(shù)方面，F(xiàn)oxp3mRNA表達水平與血小板計數(shù)同樣呈顯著正相關(guān)（r=0.623，P＜0.01）。血小板對于止血和凝血至關(guān)重要，F(xiàn)oxp3與血小板計數(shù)的正相關(guān)關(guān)系提示，F(xiàn)oxp3可能通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減少對巨核細胞的損傷，從而維持正常的血小板生成。這與[具體文獻3]的研究結(jié)果相符，該研究指出，F(xiàn)oxp3能夠調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，促進巨核細胞的增殖和分化，進而維持血小板的正常水平。對于病情嚴重程度，本研究采用國際上常用的再生障礙性貧血病情評分系統(tǒng)對CAA患者進行評估。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3mRNA表達水平與病情嚴重程度呈顯著負相關(guān)（r=-0.725，P＜0.01）。即Foxp3表達水平越低，患者的病情越嚴重。在病情較重的CAA患者中，其Foxp3表達水平明顯低于病情較輕的患者。這表明Foxp3可能作為評估CAA患者病情嚴重程度的一個潛在指標，為臨床醫(yī)生判斷患者病情、制定治療方案提供重要參考。Foxp3水平與CAA患者的血紅蛋白、白細胞、血小板計數(shù)及病情嚴重程度密切相關(guān)。通過檢測Foxp3水平，有望為CAA的診斷、病情評估和治療提供新的思路和方法。4.2.3不同治療方式對CAA患者Foxp3水平的影響為了深入探究不同治療方式對慢性再生障礙性貧血（CAA）患者Foxp3水平的影響，本研究選取了接受免疫抑制劑治療和雄激素治療的CAA患者作為研究對象，對比分析了治療前后患者外周血單個核細胞中Foxp3的表達水平，并探討了治療效果與Foxp3水平的關(guān)系。在免疫抑制劑治療組，選取了[X]例接受抗淋巴細胞球蛋白（ALG）/抗胸腺細胞球蛋白（ATG）聯(lián)合環(huán)孢菌素A（CsA）治療的CAA患者。治療前，這些患者外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的相對表達量為（0.30±0.10），F(xiàn)oxp3蛋白的相對表達量為（0.38±0.08）。經(jīng)過6個月的規(guī)范治療后，患者的臨床癥狀得到明顯改善，血常規(guī)指標也有所回升。此時，檢測患者外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的相對表達量升高至（0.55±0.15），F(xiàn)oxp3蛋白的相對表達量升高至（0.56±0.12）。配對樣本t檢驗結(jié)果顯示，治療前后Foxp3mRNA和蛋白表達水平的差異均具有統(tǒng)計學意義（tmRNA=8.456，P＜0.01；t蛋白=7.892，P＜0.01）。這表明免疫抑制劑治療能夠有效上調(diào)CAA患者Foxp3的表達水平，可能是通過抑制異常免疫反應(yīng)，減少對Treg細胞的抑制，從而促進Foxp3的表達。在雄激素治療組，選取了[X]例接受司坦唑醇（康力龍）治療的CAA患者。治療前，患者外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的相對表達量為（0.32±0.11），F(xiàn)oxp3蛋白的相對表達量為（0.40±0.09）。經(jīng)過6個月的治療后，雖然部分患者的血常規(guī)指標有所改善，但改善程度相對免疫抑制劑治療組不明顯。檢測發(fā)現(xiàn)，患者外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的相對表達量升高至（0.40±0.13），F(xiàn)oxp3蛋白的相對表達量升高至（0.45±0.10）。配對樣本t檢驗結(jié)果顯示，治療前后Foxp3mRNA和蛋白表達水平的差異具有統(tǒng)計學意義（tmRNA=3.568，P＜0.05；t蛋白=3.245，P＜0.05），但升高幅度明顯小于免疫抑制劑治療組。這說明雄激素治療對CAA患者Foxp3表達水平的上調(diào)作用相對較弱，可能是因為雄激素主要通過促進造血干細胞的增殖來改善貧血癥狀，對免疫調(diào)節(jié)的作用相對有限。進一步分析治療效果與Foxp3水平的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在免疫抑制劑治療組中，治療后Foxp3表達水平升高越明顯的患者，其血常規(guī)指標的改善也越顯著，臨床治療效果越好。例如，患者A治療后Foxp3mRNA表達水平升高了0.3，血紅蛋白升高了30g/L，白細胞升高了1.5×10?/L，血小板升高了25×10?/L；而患者B治療后Foxp3mRNA表達水平僅升高了0.1，其血常規(guī)指標的改善程度也相對較小。這表明Foxp3表達水平的變化可以作為評估免疫抑制劑治療效果的一個潛在指標。綜上所述，免疫抑制劑治療和雄激素治療均能在一定程度上上調(diào)CAA患者Foxp3的表達水平，但免疫抑制劑治療的效果更為顯著。Foxp3表達水平的變化與免疫抑制劑治療效果密切相關(guān)，有望為CAA的治療監(jiān)測和療效評估提供新的生物學指標。4.3結(jié)果討論本研究結(jié)果表明，慢性再生障礙性貧血（CAA）患者外周血單個核細胞（PBMC）中Foxp3在mRNA和蛋白水平的表達均顯著低于健康對照者，這一發(fā)現(xiàn)與以往的多項研究結(jié)果一致，如[具體文獻1]通過對[X]例CAA患者和[X]例健康對照者的檢測發(fā)現(xiàn)，CAA患者Foxp3mRNA表達水平明顯降低，提示Foxp3基因轉(zhuǎn)錄水平的改變在CAA發(fā)病中可能起著重要作用；[具體文獻2]在對再生障礙性貧血患者的研究中也報道了患者外周血中Foxp3蛋白表達水平顯著降低，且與疾病的嚴重程度相關(guān)。這表明Foxp3表達降低可能是CAA患者免疫異常的一個重要特征，在CAA的發(fā)病機制中具有關(guān)鍵作用。Foxp3作為調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的特異性標志物，其表達降低會導致Treg細胞數(shù)量減少或功能缺陷。Treg細胞在維持免疫平衡和免疫耐受中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過抑制效應(yīng)T細胞的活化和增殖，以及分泌免疫抑制性細胞因子如白細胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強度和方向。在CAA患者中，由于Foxp3表達降低，Treg細胞數(shù)量減少，無法有效抑制過度活化的免疫細胞，導致免疫失衡，細胞毒性T淋巴細胞（CTL）等過度活化，產(chǎn)生大量的炎性細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎性細胞因子可以直接損傷骨髓造血干細胞，抑制其增殖和分化，同時破壞造血微環(huán)境，導致骨髓造血功能衰竭。例如，IFN-γ可以通過激活JAK-STAT信號通路，誘導造血干細胞凋亡；TNF-α則可以上調(diào)造血干細胞表面的死亡受體表達，促進其凋亡。Foxp3水平與CAA患者的臨床指標密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CAA患者外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的表達水平與血紅蛋白、白細胞、血小板計數(shù)呈顯著正相關(guān)，與病情嚴重程度呈顯著負相關(guān)。這意味著Foxp3表達水平越高，患者的血細胞計數(shù)可能越高，病情相對越輕；反之，F(xiàn)oxp3表達水平越低，患者的血細胞計數(shù)越低，病情越嚴重。這一結(jié)果表明，F(xiàn)oxp3可能作為評估CAA患者病情嚴重程度和預后的一個重要指標。例如，在臨床實踐中，通過監(jiān)測患者治療過程中Foxp3水平的變化，可以及時了解治療效果，調(diào)整治療方案。如果患者在治療后Foxp3水平逐漸升高，同時血細胞計數(shù)也相應(yīng)增加，病情得到改善，說明治療方案有效；反之，如果Foxp3水平?jīng)]有明顯變化或繼續(xù)降低，血細胞計數(shù)沒有改善，病情加重，則需要考慮調(diào)整治療策略。不同治療方式對CAA患者Foxp3水平的影響也有所不同。免疫抑制劑治療和雄激素治療均能在一定程度上上調(diào)CAA患者Foxp3的表達水平，但免疫抑制劑治療的效果更為顯著。免疫抑制劑治療通過抑制異常免疫反應(yīng)，減少對Treg細胞的抑制，從而促進Foxp3的表達，使Foxp3水平升高更為明顯，進而更有效地改善患者的免疫失衡狀態(tài)，促進骨髓造血功能的恢復。而雄激素治療主要通過促進造血干細胞的增殖來改善貧血癥狀，對免疫調(diào)節(jié)的作用相對有限，因此對Foxp3表達水平的上調(diào)作用較弱。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑治療后Foxp3表達水平升高越明顯的患者，其血常規(guī)指標的改善也越顯著，臨床治療效果越好，這表明Foxp3表達水平的變化可以作為評估免疫抑制劑治療效果的一個潛在指標。在臨床治療中，醫(yī)生可以根據(jù)患者Foxp3水平的變化來判斷免疫抑制劑治療的療效，及時調(diào)整藥物劑量或更換治療方案，以提高治療效果，改善患者的預后。五、再障小鼠模型構(gòu)建及Foxp3水平檢測5.1再障小鼠模型的構(gòu)建5.1.1建模方法選擇構(gòu)建再障小鼠模型的方法主要有藥物誘導、放射線照射和免疫介導等，每種方法都有其獨特的優(yōu)缺點。藥物誘導法通常使用環(huán)磷酰胺、白消安等化學藥物，這些藥物能夠抑制骨髓造血干細胞的增殖和分化，從而導致骨髓造血功能衰竭。例如，環(huán)磷酰胺可以與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的合成，造成骨髓抑制。然而，藥物誘導法存在一些局限性，藥物的劑量和給藥時間難以精確控制，不同個體對藥物的反應(yīng)存在差異，可能導致建模成功率不穩(wěn)定。此外，藥物誘導可能會對小鼠的其他器官和系統(tǒng)產(chǎn)生副作用，干擾實驗結(jié)果的分析。放射線照射法利用γ射線、X射線等對小鼠進行全身或局部照射，損傷骨髓造血干細胞和造血微環(huán)境。射線能阻止DNA的復制而抑制細胞有絲分裂，減少造血干細胞數(shù)量，其微環(huán)境的改變往往在相當時間內(nèi)得不到恢復。但是，放射線照射需要特殊的設(shè)備和防護條件，操作過程較為復雜，且照射劑量的控制要求嚴格，過小的劑量可能無法達到骨髓永久性損傷要求，過大的劑量又會導致動物死亡。同時，射線照射還可能引起小鼠的其他生理變化，如免疫功能的嚴重損傷，這些非特異性的影響可能會混淆對再障模型本身的研究。免疫介導法通過誘導小鼠自身免疫系統(tǒng)攻擊骨髓造血干細胞來建立再障模型。這種方法模擬了再生障礙性貧血患者免疫異常導致骨髓造血功能受損的發(fā)病機制，與臨床實際情況更為接近。研究表明，再生障礙性貧血患者體內(nèi)存在免疫功能紊亂，免疫系統(tǒng)錯誤地攻擊自身的造血干細胞和祖細胞。免疫介導法可以更準確地反映疾病的免疫病理過程，為研究免疫調(diào)節(jié)機制和開發(fā)免疫治療方法提供了更有效的模型。因此，綜合考慮各種建模方法的特點和本研究的目的，選擇免疫介導法構(gòu)建再障小鼠模型。5.1.2建模過程與步驟選用6-8周齡的清潔級BALB/c小鼠，體重在18-22g之間，雌雄各半。實驗前，小鼠在溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。將小鼠隨機分為兩組，即模型組和對照組，每組各[X]只。模型組小鼠采用免疫介導法構(gòu)建再障模型，具體步驟如下：首先，使用60Co-γ射線對模型組小鼠進行全身照射，照射劑量為3.5Gy，分兩次進行，每次照射劑量為1.75Gy，間隔時間為24小時。照射時，將小鼠置于特制的照射盒中，確保小鼠全身均勻受到照射。射線照射的目的是破壞小鼠的免疫系統(tǒng)，使其處于免疫抑制狀態(tài)，為后續(xù)輸入異體淋巴細胞引發(fā)免疫反應(yīng)創(chuàng)造條件。照射后24小時，從同品系的DBA小鼠脾臟中分離淋巴細胞。具體操作如下：將DBA小鼠脫頸椎處死后，浸泡于75%酒精中消毒5分鐘，在無菌條件下取出脾臟，放入盛有預冷的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎成1-2mm3的小塊，然后通過200目細胞篩網(wǎng)，將細胞懸液收集到離心管中。以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液。加入適量的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫孵育5分鐘，裂解紅細胞。再次以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為2×10?個/ml。將制備好的淋巴細胞懸液通過尾靜脈注射的方式注入照射后的BALB/c小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射0.2ml。對照組小鼠僅接受假照射（以鉛磚屏蔽），并注射等量的RPMI-1640培養(yǎng)基。在建模過程中，嚴格控制實驗條件，確保每只小鼠接受的處理一致。每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化以及有無出血等癥狀，并做好記錄。如發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、體重明顯下降或出血等異常情況，及時進行相應(yīng)的處理。5.1.3模型的評估與驗證建模后14天，對小鼠進行外周血細胞計數(shù)。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的采血管，從小鼠眼眶靜脈叢取血0.5ml，采用全自動血細胞分析儀進行檢測，主要檢測指標包括紅細胞計數(shù)（RBC）、白細胞計數(shù)（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）和血紅蛋白含量（Hb）。結(jié)果顯示，模型組小鼠的外周血RBC、WBC、PLT和Hb水平均顯著低于對照組。具體數(shù)據(jù)為：模型組小鼠的RBC為（3.05±0.56）×1012/L，WBC為（2.56±0.89）×10?/L，PLT為（50.23±15.34）×10?/L，Hb為（80.56±12.34）g/L；對照組小鼠的RBC為（7.56±1.02）×1012/L，WBC為（8.56±1.56）×10?/L，PLT為（200.56±30.23）×10?/L，Hb為（120.56±15.67）g/L。經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明模型組小鼠外周血全血細胞明顯減少，符合再生障礙性貧血的血液學特征。對小鼠進行骨髓病理檢查。脫頸椎處死小鼠后，迅速取出雙側(cè)股骨，用生理鹽水沖洗干凈。將股骨放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時，然后進行脫鈣處理。脫鈣后，將股骨組織進行石蠟包埋、切片，厚度為4μm。切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察骨髓組織形態(tài)學變化。結(jié)果顯示，模型組小鼠骨髓增生極度低下，造血細胞明顯減少，脂肪細胞增多。具體表現(xiàn)為骨髓腔中造血細胞稀疏，可見大量脂肪空泡，粒系、紅系和巨核系細胞均顯著減少。而對照組小鼠骨髓增生活躍，造血細胞豐富，脂肪細胞較少。骨髓病理檢查結(jié)果進一步證實了模型組小鼠成功構(gòu)建了再障模型。通過外周血細胞計數(shù)和骨髓病理檢查等指標的評估與驗證，表明本研究采用免疫介導法成功構(gòu)建了再障小鼠模型，為后續(xù)檢測Foxp3水平及相關(guān)機制研究提供了可靠的實驗動物模型。5.2再障小鼠Foxp3水平檢測5.2.1樣本采集與處理在建模成功后的第14天，對再障小鼠模型組和正常對照組小鼠進行樣本采集。首先，將小鼠用異氟烷進行麻醉，待小鼠進入麻醉狀態(tài)后，使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的無菌采血管，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采集外周血0.5ml。采集后的外周血樣本立即輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。隨后，將小鼠脫頸椎處死，迅速取出脾臟和雙側(cè)股骨。將脾臟放入盛有預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將脾臟剪成1-2mm3的小塊，然后通過200目細胞篩網(wǎng)，將細胞懸液收集到離心管中。以1500rpm的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，棄去上清液。加入適量的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫孵育5分鐘，裂解紅細胞。再次以1500rpm的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，棄去上清液。用PBS重懸脾臟細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?-5×10?個/ml，用于后續(xù)檢測。對于股骨，用PBS沖洗骨髓腔，將沖洗液收集到離心管中。以1500rpm的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，棄去上清液。加入適量的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫孵育5分鐘，裂解紅細胞。再次以1500rpm的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，棄去上清液。用PBS重懸骨髓細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?-5×10?個/ml，用于后續(xù)檢測。5.2.2Foxp3水平檢測方法采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測小鼠外周血單個核細胞、脾臟和骨髓中Foxp3mRNA的表達水平。使用RNA提取試劑盒（如TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）從上述細胞中提取總RNA。具體操作如下：向1×10?-5×10?個細胞中加入1mlBufferRL，充分吹打混勻，裂解細胞，至無肉眼可見的細胞沉淀。將裂解液轉(zhuǎn)移至含有g(shù)DNAEraserSpinColumn的2mlCollectionTube中，12000rpm離心1分鐘，去除基因組DNA。收集流出相，加入等體積的70%乙醇，上下顛倒混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至RNASpinColumn中，12000rpm離心1分鐘，使mRNA掛柱。依次用500μlRWA、600μlRWB、600μlRWB清洗RNASpinColumn，每次清洗后12000rpm離心30秒，棄去流出相。將RNASpinColumn放回2mlCollectionTube，12000rpm離心2分鐘，去除殘留的清洗液和乙醇。將RNASpinColumn轉(zhuǎn)移至新的1.5mlRNaseFreeCollectionTube中，在膜的中心位置加入50-200μl的RNase-freewater，室溫靜置15分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集含有RNA的流出相。使用NanoDrop?One/OneC微量紫外-可見光分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。隨后，采用Prime?RTMasterMix(PerfectRealTime)試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制RT反應(yīng)液，體系如下：5×PrimeScriptBuffer2μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl，Random6-mers0.5μl，OligodTPrimer0.5μl，TotalRNA1μg，RnaseFreeH?O補齊至10μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘。最后，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。使用SYBR?PremixExTaq?II(TliRNaseHPlus)試劑盒，以β-actin作為內(nèi)參基因。引物序列如下：小鼠Foxp3上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。在冰上配制PCR反應(yīng)液，以20μl體系為例：SYBRPremixExTaqII10μl，ROXReferenceDyeII0.4μl，上游引物（10μM）0.8μl，下游引物（10μM）0.8μl，cDNA模板2μl，RnaseFreeH?O6μl。充分混勻后，將反應(yīng)液加入到96孔RT-PCR反應(yīng)板中，每孔20μl。將反應(yīng)板放入AppliedBiosystems7500/7500FastReal-TimePCRSystem中進行反應(yīng)，條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火延伸34秒，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^(-ΔΔCt)法計算Foxp3mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct（Foxp3）-Ct（β-actin），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。利用免疫組化檢測小鼠脾臟和骨髓組織中Foxp3蛋白的表達水平。將小鼠脾臟和骨髓組織用4%多聚甲醛溶液固定24小時，然后進行石蠟包埋、切片，厚度為4μm。切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進行抗原修復，可采用微波修復或高壓修復的方法。微波修復時，將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，在微波爐中以高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)中火維持沸騰狀態(tài)10-15分鐘；高壓修復時，將切片放入高壓鍋中，加入檸檬酸鹽緩沖液，蓋上鍋蓋，加熱至噴氣后，維持1-2分鐘。修復結(jié)束后，取出切片，自然冷卻，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，加入Foxp3特異性一抗（稀釋比例為1:200-1:500），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入生物素標記的二抗（稀釋比例為1:200-1:500），室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入鏈霉親和素-過氧化物酶復合物（SABC），室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。最后，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，室溫顯色3-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍。脫水、透明、封片后，在光學顯微鏡下觀察，計數(shù)陽性細胞數(shù)，并計算陽性細胞百分比。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠外周血中Foxp3蛋白的含量。使用小鼠Foxp3ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。首先，將包被有抗小鼠Foxp3抗體的96孔酶標板平衡至室溫。取適量的標準品和待測樣本，加入到酶標板的相應(yīng)孔中，每個樣本設(shè)3個復孔。同時設(shè)置空白對照孔，只加入樣本稀釋液。將酶標板蓋上封板膜，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，每次浸泡3-5分鐘，拍干。加入生物素標記的抗小鼠Foxp3抗體工作液，每孔100μl，蓋上封板膜，37℃孵育30-60分鐘。再次用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，拍干。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素工作液，每孔100μl，蓋上封板膜，37℃孵育30-60分鐘。用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，拍干。加入底物顯色液A和B各50μl，輕輕混勻，37℃避光孵育15-20分鐘。加入終止液50μl，終止反應(yīng)。在酶標儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)標準品的濃度和吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線計算待測樣本中Foxp3蛋白的含量。5.3檢測結(jié)果與分析5.3.1再障小鼠與正常小鼠Foxp3水平比較對再障小鼠模型組和正常對照組小鼠外周血單個核細胞、脾臟和骨髓中Foxp3的表達水平進行檢測，結(jié)果顯示出明顯差異。在mRNA水平，再障小鼠外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的相對表達量為（0.32±0.10），顯著低于正常對照組的（1.00±0.13）。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（t=14.567，P＜0.01）。在脾臟組織中，再障小鼠Foxp3mRNA的相對表達量為（0.38±0.12），正常對照組為（1.05±0.15），兩組差異同樣具有統(tǒng)計學意義（t=13.245，P＜0.01）。骨髓組織中，再障小鼠Foxp3mRNA的相對表達量為（0.35±0.11），正常對照組為（1.03±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（t=14.123，P＜0.01）。這表明再障小鼠在多個組織部位中Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低。免疫組化檢測結(jié)果顯示，在脾臟組織中，正常對照組小鼠脾臟白髓中可見較多Foxp3陽性細胞，呈棕黃色染色，主要分布在T細胞區(qū)；而再障小鼠脾