慢性牙髓炎與慢性根尖周炎中P.n.與P.i.的實時熒光定量PCR檢測：菌群定量分析與臨床意義探究一、引言1.1研究背景慢性牙髓炎和慢性根尖周炎是口腔疾病中極為常見的類型，嚴重影響著人們的口腔健康和生活質量。根據(jù)相關流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內這兩種疾病的發(fā)病率居高不下，在不同年齡段和地區(qū)均有廣泛分布。在我國，隨著人口老齡化的加劇以及人們生活方式的改變，其患病人數(shù)也呈上升趨勢。細菌感染在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的發(fā)病過程中扮演著至關重要的角色，是引發(fā)炎癥的主要始動因素。牙髓腔及根管系統(tǒng)為細菌的滋生和繁殖提供了適宜的環(huán)境，當細菌突破牙體組織的防御機制侵入牙髓和根尖周組織后，會引發(fā)一系列復雜的免疫炎癥反應，導致組織的損傷和破壞。根管內的細菌種類繁多，形成了復雜的微生物群落，不同細菌之間相互作用、協(xié)同致病，共同推動著疾病的發(fā)展。其中，普氏菌屬作為革蘭氏陰性厭氧桿菌，在感染根管樣本中具有較高的檢出率。中間普沃雷菌（Prevotellaintermedia，P.i.）與變黑普沃雷菌（Prevotellanigrescens，P.n.）在感染根管中的出現(xiàn)頻率尤為突出，有時甚至在菌群中占比最高。深入研究根管內細菌，尤其是像P.i.和P.n.這樣的關鍵細菌，對于全面理解慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的發(fā)病機制具有不可替代的重要性。不同細菌的致病特性、代謝產物以及它們與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用方式各異，明確這些細菌在疾病發(fā)生發(fā)展不同階段的作用和變化規(guī)律，能夠為揭示疾病的本質提供關鍵線索。同時，研究根管內細菌還有助于指導臨床治療方案的制定和優(yōu)化。通過準確了解根管內的優(yōu)勢菌和潛在致病菌，醫(yī)生可以更加精準地選擇合適的治療方法和藥物，提高治療效果，減少不必要的治療手段對患者造成的傷害。此外，對根管內細菌的研究也為預防這兩種疾病的發(fā)生和復發(fā)提供了理論依據(jù)，有助于制定更加有效的預防策略，降低疾病的發(fā)生率，提升人們的口腔健康水平。1.2研究目的本研究旨在運用實時熒光定量PCR技術，對慢性牙髓炎及慢性根尖周炎患牙根管內的P.n.與P.i.進行精確的定量檢測。通過系統(tǒng)分析兩種細菌在這兩種疾病中的數(shù)量差異，初步明確它們在根管感染不同時期的數(shù)量變化規(guī)律。這不僅有助于進一步揭示牙髓病及根尖周病的病因，加深對疾病發(fā)病機制的理解，還能為臨床治療中抗生素的合理應用提供科學依據(jù)，從而提高治療效果，改善患者的口腔健康狀況。二、相關理論基礎2.1慢性牙髓炎和慢性根尖周炎概述2.1.1疾病定義與癥狀表現(xiàn)慢性牙髓炎是臨床上最為常見的一類牙髓炎，是指牙髓組織發(fā)生的慢性炎癥反應。當侵入牙髓的細菌毒力偏低，而機體抵抗力比較強時，牙髓組織炎癥反應多表現(xiàn)為慢性過程，就會引發(fā)慢性牙髓炎。此外，當急性牙髓炎的滲出物得到引流，但炎癥未能徹底消除時，也可轉變?yōu)槁匝浪柩?。慢性牙髓炎的癥狀通常不典型，部分患者可能沒有自發(fā)性疼痛，但會出現(xiàn)陣發(fā)性隱痛或者定時出現(xiàn)鈍痛。當患牙受到冷熱刺激時，會出現(xiàn)疼痛，且常會伴有咬合不適或者輕微咬合疼痛。不同類型的慢性牙髓炎癥狀又存在一定差異，慢性閉鎖性牙髓炎無明顯自發(fā)痛，但有過急性發(fā)作或劇烈自發(fā)痛史，有長期的冷、熱刺激痛癥狀，探診患牙感覺較為遲鈍，無肉眼可見的穿髓孔，多為熱測引起遲緩性痛，多有叩痛或不適；慢性潰瘍性牙髓炎多無自發(fā)痛，食物嵌入洞內會出現(xiàn)劇烈疼痛，冷熱刺激時疼痛劇烈，有深齲、充填物或其他近髓的牙體硬組織病變，去除腐質可見穿髓孔，溫度測驗表現(xiàn)為敏感，一般沒有叩痛或有叩診不適；慢性增生性牙髓炎一般無自發(fā)痛，進食時可有疼痛或出血，患牙深齲洞內有紅色、蘑菇狀肉芽組織，探易出血。慢性根尖周炎則是指根管內長期存在感染及病原刺激物而導致的根尖周圍組織慢性炎癥反應，表現(xiàn)為炎癥性肉芽組織形成和牙槽骨的破壞。慢性根尖周炎一般沒有明顯的疼痛癥狀，病變類型包括根尖肉芽腫、慢性根尖周膿腫、根尖周囊腫和根尖周致密性骨炎?；颊呖赡軙霈F(xiàn)咀嚼不適，常由于繼發(fā)牙髓病而來，臨床上多可問出有牙髓病病史、反復腫痛史或牙髓治療史。檢查可見有深齲洞和充填體，牙髓活力測試無反應，叩診一般不松動、無明顯異?；騼H有不適感。根尖周肉芽腫的患牙多有深齲，或由于牙髓壞死導致牙齒變色和失去光澤，咀嚼乏力或咀嚼不適，偶有疼痛感，X線片可見根尖區(qū)牙周膜間隙增寬，根尖部有橢圓形低密度影，邊界清晰；慢性根尖周膿腫的患牙伴有牙髓病史，在患牙的根尖部黏膜可見瘺孔，有膿液從內溢出，患牙一般無明顯癥狀，少數(shù)可有疼痛感，咀嚼乏力或咀嚼不適；根尖周囊腫患者多有牙髓病史，患牙變色，牙髓失去活力，根尖部位有膨隆，表面黏膜顏色正常，X線片上可見患牙根尖周圍有圓形或橢圓形密度減低區(qū)，邊界清晰整齊，周圍有清楚的白色不透光射線所包繞，稱為骨白線，較大囊腫可壓迫鄰牙，使其牙根吸收或移位，感染的根尖囊腫其透光區(qū)邊緣不規(guī)則；根尖周致密性骨炎在臨床上比較少見，沒有任何的癥狀，一般都是在拍X片時發(fā)現(xiàn)。2.1.2發(fā)病機制與病因分析細菌感染是慢性牙髓炎和慢性根尖周炎發(fā)病的主要病因。在口腔環(huán)境中，多種細菌可以通過牙體硬組織的破損處，如深齲、楔狀缺損、牙隱裂等途徑侵入牙髓腔。當細菌突破牙體組織的防御機制后，會在牙髓和根管系統(tǒng)內大量繁殖，產生毒素和代謝產物，這些物質會刺激牙髓組織和根尖周組織，引發(fā)免疫炎癥反應。例如，革蘭氏陰性厭氧菌可以釋放內毒素，激活宿主的免疫細胞，導致炎癥介質的釋放，如白細胞介素、腫瘤壞死因子等，這些炎癥介質會進一步引起組織的損傷和破壞。物理刺激也是不容忽視的發(fā)病因素。長期的咬合創(chuàng)傷會導致根尖周組織的損傷，使根尖周組織的血液循環(huán)受到影響，降低組織的抵抗力，從而為細菌感染創(chuàng)造條件。此外，溫度刺激，如過冷或過熱的食物、飲料等，也可能導致牙髓組織的損傷，引發(fā)牙髓炎?；瘜W刺激同樣在疾病發(fā)生發(fā)展中起到作用。在牙齒治療過程中，使用的某些藥物，如消毒藥物、充填材料等，如果使用不當，可能會對牙髓和根尖周組織產生刺激，引發(fā)炎癥反應。例如，酚類消毒劑如果溢出根尖孔，會對根尖周組織造成化學性損傷。免疫反應在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的發(fā)病機制中也占據(jù)重要地位。當細菌及其產物侵入牙髓和根尖周組織后，機體的免疫系統(tǒng)會被激活，產生免疫應答。免疫細胞會聚集到感染部位，試圖清除病原體，但在這個過程中，免疫細胞釋放的炎癥介質和細胞因子也會對周圍組織造成損傷，導致炎癥的持續(xù)發(fā)展和組織的破壞。2.2實時熒光定量PCR技術原理與應用2.2.1技術原理實時熒光定量PCR技術，又稱qPCR技術，是在傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應（PCR）基礎上發(fā)展而來的一種核酸定量檢測技術。其核心原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，通過監(jiān)測熒光信號的變化來實時反映PCR擴增過程中產物的生成量，進而實現(xiàn)對起始模板的定量分析。在PCR反應過程中，DNA聚合酶以引物為起點，沿著模板DNA進行擴增，每經(jīng)過一個循環(huán)，DNA模板數(shù)量就會翻倍。隨著擴增反應的進行，PCR產物不斷積累，與之結合的熒光基團也隨之增加，熒光信號強度逐漸增強。通過特定的熒光檢測儀器，可以實時監(jiān)測反應體系中熒光信號的變化情況。為了實現(xiàn)對起始模板的準確定量，引入了循環(huán)閾值（Ct值）的概念。Ct值是指在PCR反應過程中，每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系。起始模板量越大，其達到熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)就越少，即Ct值越小；反之，起始模板量越小，Ct值越大。在實驗中，通過制備已知起始拷貝數(shù)的標準樣品，進行PCR擴增并測定其Ct值，從而繪制出標準曲線。隨后，對待測樣本進行同樣的PCR擴增和Ct值測定，根據(jù)標準曲線即可計算出待測樣本的起始拷貝量，實現(xiàn)對樣本中目標DNA的定量分析。實時熒光定量PCR技術常用的熒光檢測方法主要有兩種，分別是DNA染料法和熒光探針法。DNA染料法以SYBRGreenI為代表，該染料能夠特異性地嵌入雙鏈DNA中，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光信號。隨著PCR產物的不斷生成，與染料結合的雙鏈DNA數(shù)量增加，熒光信號也隨之增強。DNA染料法操作相對簡單，成本較低，可用于檢測所有雙鏈DNA擴增產物，但它無法區(qū)分特異性擴增產物和非特異性擴增產物，如引物二聚體等，容易產生假陽性結果。熒光探針法則具有更高的特異性。以Taqman探針為例，該探針是一段與目標DNA序列互補的寡核苷酸，其兩端分別標記有一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。在PCR擴增過程中，當引物與模板DNA結合并延伸時，Taq酶的5'-3'外切酶活性會將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離。此時，報告熒光基團發(fā)出的熒光信號不再被淬滅基團吸收，從而被熒光檢測系統(tǒng)接收。每擴增一條DNA鏈，就會有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。由于探針與目標DNA序列的特異性結合，熒光探針法能夠有效避免非特異性擴增的干擾，提高檢測的準確性和特異性，但合成探針的成本相對較高，且針對不同的靶序列需要設計合成不同的探針。2.2.2在口腔細菌檢測中的優(yōu)勢與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法相比，實時熒光定量PCR技術在口腔細菌檢測方面具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法需要將采集的口腔樣本接種到特定的培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，使細菌生長繁殖形成菌落，然后通過觀察菌落形態(tài)、生化反應等特征來鑒定細菌種類和數(shù)量。這種方法操作繁瑣，耗時較長，一般需要2-7天才能得到結果。而且，口腔內的細菌種類繁多，部分細菌對生長環(huán)境要求苛刻，在普通培養(yǎng)基上難以生長，容易導致漏檢。此外，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只能檢測出能夠在培養(yǎng)基上生長的細菌，對于一些處于休眠狀態(tài)或難以培養(yǎng)的細菌則無法檢測。實時熒光定量PCR技術則能夠快速、準確地檢測口腔細菌。它不需要細菌在培養(yǎng)基上生長繁殖，直接從樣本中提取細菌的DNA進行擴增和檢測，大大縮短了檢測時間，一般幾個小時即可完成檢測。該技術靈敏度極高，能夠檢測到樣本中微量的細菌DNA，即使樣本中細菌數(shù)量很少也能被檢測出來。同時，實時熒光定量PCR技術具有很強的特異性，通過設計特異性的引物和探針，可以準確地識別目標細菌的DNA序列，避免了其他細菌的干擾，提高了檢測的準確性。與其他分子生物學技術相比，如普通PCR結合凝膠電泳檢測方法，實時熒光定量PCR技術也具有明顯的優(yōu)勢。普通PCR結合凝膠電泳檢測只能判斷樣本中是否存在目標細菌的DNA，但無法對細菌進行準確定量。而實時熒光定量PCR技術不僅能夠檢測出目標細菌的存在，還能精確地測定其數(shù)量，為研究口腔細菌的感染程度和疾病發(fā)展提供了更有價值的信息。此外，實時熒光定量PCR技術實現(xiàn)了PCR擴增和檢測的一體化，整個過程在封閉的反應管中進行，減少了交叉污染的風險，提高了檢測的可靠性。綜上所述，實時熒光定量PCR技術以其快速、靈敏、特異、能精確定量等優(yōu)勢，在口腔細菌檢測領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力，為深入研究口腔疾病的病因和發(fā)病機制提供了強有力的技術支持。2.3P.n.與P.i.細菌特性及在口腔疾病中的作用P.n.（變黑普沃雷菌）和P.i.（中間普沃雷菌）同屬于普氏菌屬，是革蘭氏陰性厭氧桿菌。它們的形態(tài)較為相似，均為短桿菌，有時呈球桿狀。P.n.在血瓊脂平板上可形成黑色或褐色的菌落，這是由于其能產生黑色素，使菌落顏色發(fā)生改變。P.i.在血瓊脂平板上的菌落較小，呈灰白色，通常具有微弱的溶血現(xiàn)象。這兩種細菌對生長環(huán)境要求較為苛刻，需要在厭氧環(huán)境下生長，并且對溫度、濕度等條件也有一定的要求。它們在口腔內主要定植于齦溝、牙周袋以及感染根管等部位。在感染根管中，P.n.與P.i.的檢出率較高，多項研究表明，在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎患者的根管樣本中，這兩種細菌的檢出率可達到30%-70%。在口腔疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，P.n.與P.i.發(fā)揮著重要作用。它們能夠產生多種毒力因子，如蛋白酶、膠原酶、脂多糖等。這些毒力因子可以破壞牙周組織和牙髓組織的細胞外基質，導致組織的損傷和破壞。例如，蛋白酶可以分解牙周組織中的膠原蛋白，使牙周組織失去支持和保護作用，進而引發(fā)牙周炎。脂多糖則是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，具有很強的免疫原性，能夠激活宿主的免疫細胞，引發(fā)炎癥反應。P.n.與P.i.還可以通過與其他細菌相互作用，協(xié)同致病。它們能夠與牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌等牙周致病菌形成復雜的微生物群落，共同作用于口腔組織，加劇炎癥的發(fā)展。在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的發(fā)病過程中，P.n.與P.i.可能通過釋放毒力因子，刺激牙髓和根尖周組織的免疫細胞，導致炎癥介質的釋放，如白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等。這些炎癥介質會引起血管擴張、通透性增加，導致組織水腫和疼痛。同時，炎癥介質還會吸引更多的免疫細胞聚集到感染部位，進一步加重炎癥反應，導致牙髓和根尖周組織的壞死和破壞。三、研究設計與方法3.1實驗對象選擇3.1.1病例納入標準本研究選取在[醫(yī)院名稱]口腔科就診，且符合慢性牙髓炎和慢性根尖周炎診斷標準的患者作為實驗對象。具體納入標準如下：慢性牙髓炎患者：有長期的冷熱刺激痛史，近期疼痛加重，可表現(xiàn)為陣發(fā)性隱痛、鈍痛或脹痛；患牙有深齲洞，且齲洞已穿髓，或有牙髓治療史；牙髓活力測試表現(xiàn)為遲鈍或無反應；X線片顯示根尖周無明顯異?；騼H有牙周膜間隙輕度增寬。慢性根尖周炎患者：患牙有牙髓病史，或有反復腫痛史；患牙無明顯自覺癥狀，或有咀嚼不適、咬合痛；檢查可見患牙有深齲洞、充填體或其他牙體硬組織病變，牙髓活力測試無反應；X線片顯示根尖周有低密度影像，根據(jù)病變類型不同，可表現(xiàn)為根尖周肉芽腫的橢圓形低密度影、慢性根尖周膿腫的不規(guī)則低密度影、根尖周囊腫的圓形或橢圓形低密度影且邊界清晰并伴有骨白線。年齡范圍：患者年齡在18-60歲之間，以確保研究對象具有相對穩(wěn)定的生理狀態(tài)和免疫功能，減少年齡因素對實驗結果的影響。簽署知情同意書：所有患者均充分了解本研究的目的、方法、可能的風險和受益，并自愿簽署知情同意書，以保證研究的合法性和倫理合理性。3.1.2樣本采集方法在進行樣本采集前，首先對患者的患牙進行常規(guī)臨床檢查，包括視診、探診、叩診、牙髓活力測試等，進一步確認患牙的病情。同時，拍攝X線片，詳細了解患牙的牙根數(shù)目、根管形態(tài)、根尖周病變情況等，為樣本采集提供準確的影像學依據(jù)。樣本采集過程嚴格遵循無菌操作原則，以避免外界細菌污染。使用一次性口腔器械盒，包括鑷子、探針、口鏡等，對患者口腔進行清潔和消毒。先用3%過氧化氫溶液沖洗患牙周圍的牙齦組織，再用生理鹽水沖洗干凈，以去除表面的污垢和細菌。采用專用的根管采樣器械進行樣本采集。使用無菌的根管銼，根據(jù)X線片確定的根管長度，將根管銼緩慢插入根管內，到達根尖1/3處，然后輕輕旋轉根管銼，使根管內的細菌和組織碎屑附著在根管銼上。對于根管較細或彎曲的患牙，可使用小號的根管銼，并采用逐步深入的方法進行采樣，確保能夠采集到根管內不同部位的樣本。采集后的樣本立即放入無菌的離心管中，每管加入1ml無菌生理鹽水，以保持樣本的濕潤和活性。為防止樣本中的細菌發(fā)生變異或死亡，將裝有樣本的離心管迅速放入冰盒中，并在30分鐘內送至實驗室進行后續(xù)處理。若不能及時進行檢測，將樣本離心后棄去上清液，加入適量的細菌保存液，如甘油-生理鹽水溶液，然后置于-80℃冰箱中冷凍保存。3.2實驗材料與儀器3.2.1主要試劑SYBRGreenI熒光染料：購自[具體品牌]公司，貨號為[具體貨號]。該染料能夠特異性地嵌入雙鏈DNA中，在實時熒光定量PCR反應過程中，隨著雙鏈DNA的擴增，SYBRGreenI與雙鏈DNA結合，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光信號，通過檢測熒光信號的強度變化來實時監(jiān)測PCR擴增進程，從而實現(xiàn)對目標DNA的定量分析。其具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，廣泛應用于實時熒光定量PCR實驗中。DNA提取試劑：采用[品牌]的細菌基因組DNA提取試劑盒，貨號為[具體貨號]。該試劑盒包含多種試劑，如裂解液、蛋白酶K、結合液、洗滌液、洗脫液等。裂解液可破壞細菌細胞壁和細胞膜，使細胞內容物釋放出來；蛋白酶K能夠降解蛋白質，去除蛋白質對DNA的污染；結合液可使DNA與硅膠膜特異性結合；洗滌液用于去除雜質和鹽分；洗脫液則用于將結合在硅膠膜上的DNA洗脫下來，得到高純度的細菌基因組DNA，為后續(xù)的PCR擴增提供高質量的模板。PCR反應相關試劑：包括dNTPMix（脫氧核糖核苷三磷酸混合物）、TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、MgCl?溶液等。dNTPMix由dATP、dTTP、dCTP、dGTP組成，為PCR反應提供合成DNA所需的原料；TaqDNA聚合酶具有5'-3'聚合酶活性，能夠以DNA為模板，將dNTP逐個添加到引物的3'-OH末端，合成新的DNA鏈；10×PCR緩沖液為PCR反應提供合適的反應環(huán)境，維持酶的活性和穩(wěn)定性；MgCl?溶液中的Mg2?是TaqDNA聚合酶的激活劑，能夠影響酶的活性和PCR反應的特異性。這些試劑均購自[品牌]公司，貨號分別為[對應貨號]。引物：根據(jù)P.n.與P.i.的16SrRNA基因序列，利用專業(yè)的引物設計軟件PrimerPremier5.0設計特異性引物。引物由[引物合成公司名稱]合成，序列如下：P.n.上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；P.i.上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。引物的設計遵循特異性、互補性、避免形成引物二聚體等原則，以確保在PCR反應中能夠特異性地擴增目標基因片段。其他試劑：如無菌生理鹽水，用于樣本的稀釋和保存，維持樣本中細菌的活性；DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水，用于配制各種試劑，以去除水中的RNA酶，防止RNA被降解。這些試劑均購自[相應的供應商名稱]。3.2.2儀器設備實時熒光定量PCR儀：使用[儀器品牌]的[具體型號]實時熒光定量PCR儀。該儀器具有高精度的溫度控制模塊，能夠實現(xiàn)快速升降溫，確保PCR反應在精確的溫度條件下進行，提高反應效率和特異性。其熒光檢測系統(tǒng)靈敏度高，能夠準確地檢測到反應體系中熒光信號的微小變化。通過配套的數(shù)據(jù)分析軟件，可對實驗數(shù)據(jù)進行實時監(jiān)測、分析和處理，繪制標準曲線、計算Ct值等，從而實現(xiàn)對樣本中目標DNA的定量分析。離心機：型號為[離心機品牌及型號]，最大轉速可達[具體轉速]。主要用于樣本的離心分離，如在DNA提取過程中，通過離心使細胞碎片、蛋白質等雜質沉淀，從而獲得純凈的DNA溶液。在樣本采集后，也可利用離心機將樣本中的細菌沉淀下來，便于后續(xù)的處理和檢測。移液器：選用[移液器品牌]的多量程移液器，包括1-10μl、10-100μl、100-1000μl等不同規(guī)格。移液器具有高精度的移液功能，能夠準確地吸取和分配各種試劑和樣本，保證實驗操作的準確性和重復性。在PCR反應體系的配制、樣本的轉移等實驗步驟中，移液器發(fā)揮著重要作用。旋渦振蕩器：品牌為[旋渦振蕩器品牌]，型號為[具體型號]。用于使試劑和樣本充分混合，確保反應體系中各成分均勻分布。在DNA提取過程中，使用旋渦振蕩器振蕩裂解液和樣本，可加速細胞的裂解；在PCR反應體系配制時，振蕩混勻各種試劑，有助于提高反應的均一性。核酸蛋白分析儀：型號為[儀器品牌及型號]，可用于測定DNA樣本的濃度和純度。通過檢測DNA在260nm和280nm波長處的吸光度，計算出DNA的濃度和A???/A???比值，評估DNA的質量，為后續(xù)的實驗提供重要參考。3.3實驗步驟3.3.1DNA提取將采集的樣本從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍。向裝有樣本的離心管中加入500μl裂解液，充分振蕩，使樣本與裂解液均勻混合，確保細菌細胞能夠充分接觸裂解液。接著，向離心管中加入20μl蛋白酶K，渦旋振蕩15秒，使蛋白酶K均勻分散在溶液中，然后將離心管置于56℃恒溫金屬浴中孵育1小時。在此過程中，蛋白酶K能夠降解細菌細胞內的蛋白質，破壞細胞結構，使DNA釋放出來。孵育結束后，將離心管取出，冷卻至室溫。向管中加入500μl酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）混合液，上下顛倒離心管10次，使溶液充分混勻，隨后在室溫下12000rpm離心10分鐘。離心后，溶液會分層，上層為水相，含有DNA；中間層為蛋白質和細胞碎片；下層為有機相。小心吸取上層水相轉移至新的離心管中，注意不要吸到中間層和下層有機相，以免污染DNA。向含有水相的離心管中加入等體積的氯仿，上下顛倒離心管10次，混勻后室溫下12000rpm離心5分鐘。再次離心的目的是進一步去除殘留的蛋白質和酚，提高DNA的純度。離心后，同樣吸取上層水相轉移至新的離心管中。向水相中加入2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒離心管，使DNA沉淀出來。然后將離心管置于-20℃冰箱中靜置30分鐘，促進DNA沉淀。30分鐘后，將離心管取出，在4℃條件下12000rpm離心10分鐘，此時DNA會沉淀在離心管底部。小心棄去上清液，避免吸走沉淀的DNA。向沉淀中加入1ml75%乙醇，輕輕顛倒離心管，洗滌DNA沉淀，以去除殘留的鹽分和雜質。隨后在4℃條件下7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。重復洗滌步驟一次，確保DNA沉淀的純度。洗滌完成后，將離心管置于室溫下晾干，使乙醇完全揮發(fā)，但要注意避免過度干燥，以免影響DNA的溶解。待乙醇揮發(fā)后，向離心管中加入50μlTE緩沖液，輕輕吹打沉淀，使DNA充分溶解。將溶解后的DNA溶液保存于-20℃冰箱中，以備后續(xù)實驗使用。為了檢測提取的DNA質量和濃度，取2μlDNA溶液，使用核酸蛋白分析儀測定其在260nm和280nm波長處的吸光度，計算A???/A???比值。理想情況下，A???/A???比值應在1.8-2.0之間，表明提取的DNA純度較高，無蛋白質和RNA污染。若比值偏離此范圍，可能需要進一步純化DNA或重新提取。3.3.2引物設計與合成運用專業(yè)的引物設計軟件PrimerPremier5.0，根據(jù)P.n.與P.i.的16SrRNA基因序列設計特異性引物。引物設計嚴格遵循以下原則：引物長度一般控制在18-25bp之間，以保證引物與模板的特異性結合。引物的GC含量維持在40%-60%，有助于穩(wěn)定引物與模板的結合。同時，避免引物內部形成發(fā)卡結構和引物二聚體，防止其影響PCR擴增效率。引物3'端的堿基盡量選擇A、T、C，避免使用G，以減少非特異性擴增。在設計過程中，還對引物與模板的互補性進行了嚴格比對，確保引物能夠準確地與目標基因序列結合。經(jīng)過多次篩選和優(yōu)化，最終確定的引物序列如下：P.n.上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；P.i.上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。將設計好的引物序列發(fā)送至[引物合成公司名稱]進行合成。合成過程采用固相亞磷酰胺三酯法，該方法具有高效、準確的特點。在合成完成后，對引物進行質量控制。首先，通過高效液相色譜（HPLC）對引物進行純度檢測，確保引物的純度達到95%以上。同時，采用質譜分析法測定引物的分子量，驗證引物序列的準確性。只有經(jīng)過質量檢測合格的引物才能用于后續(xù)實驗。為了保證引物的穩(wěn)定性和活性，將合成好的引物用無菌水稀釋至100μmol/L的儲存濃度，然后分裝成小份，保存于-20℃冰箱中。使用時，根據(jù)實驗需要將引物稀釋至合適的工作濃度。3.3.3實時熒光定量PCR反應體系與條件在冰上配制PCR反應體系，總反應體積為20μl。各成分用量如下：SYBRGreenI熒光染料10μl，提供熒光信號，用于實時監(jiān)測PCR擴增進程；上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μmol/L）各0.5μl，引導DNA聚合酶對目標基因進行擴增；DNA模板2μl，為PCR反應提供起始的核酸模板；dNTPMix（10mmol/L）0.4μl，提供合成DNA所需的原料；TaqDNA聚合酶0.5μl，催化DNA合成反應；10×PCR緩沖液2μl，為反應提供適宜的緩沖環(huán)境，維持酶的活性；MgCl?溶液（25mmol/L）1.5μl，Mg2?是TaqDNA聚合酶的激活劑，影響酶的活性和反應的特異性；最后用無菌ddH?O補足至20μl。配制完成后，輕輕混勻反應體系，短暫離心，使溶液集中在管底。將配制好的PCR反應體系轉移至實時熒光定量PCR儀的反應管中，放入儀器樣品槽內。設置反應的溫度循環(huán)條件：首先進行預變性，95℃孵育3分鐘，使DNA模板充分變性，雙鏈解開；然后進入變性步驟，95℃15秒，使雙鏈DNA完全解鏈；退火溫度根據(jù)引物的Tm值（解鏈溫度）確定，本實驗中P.n.與P.i.引物的退火溫度均為60℃，退火時間為30秒，在此溫度下引物與模板特異性結合；延伸步驟在72℃進行，時間為30秒，TaqDNA聚合酶在該溫度下催化dNTP按照模板鏈的堿基序列合成新的DNA鏈。以上變性、退火、延伸步驟構成一個循環(huán)，共進行40個循環(huán)。循環(huán)結束后，進行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，升溫速率為0.1℃/秒，同時實時監(jiān)測熒光信號的變化，繪制熔解曲線，用于判斷PCR擴增產物的特異性。3.3.4數(shù)據(jù)分析方法運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行深入分析。首先，對實驗所得數(shù)據(jù)進行全面的統(tǒng)計描述。對于計量資料，如Ct值，計算其均值（x）和標準差（s），以直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。同時，制作數(shù)據(jù)分布直方圖和箱線圖，進一步觀察數(shù)據(jù)的分布特征，檢查是否存在異常值。采用獨立樣本t檢驗對慢性牙髓炎組和慢性根尖周炎組中P.n.與P.i.的Ct值進行比較。假設檢驗的原假設（H?）為兩組中細菌的Ct值無差異，備擇假設（H?）為兩組中細菌的Ct值存在差異。在檢驗過程中，根據(jù)數(shù)據(jù)的分布情況和方差齊性檢驗結果，選擇合適的t檢驗方法。若兩組數(shù)據(jù)方差齊，采用常規(guī)的獨立樣本t檢驗；若方差不齊，則采用校正的t檢驗。通過計算t值和相應的P值，判斷差異是否具有統(tǒng)計學意義。設定顯著性水平α=0.05，當P≤0.05時，拒絕原假設，認為兩組中細菌的Ct值存在顯著差異，即兩種細菌在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎患牙根管內的數(shù)量存在明顯差異；當P>0.05時，不拒絕原假設，表明兩組中細菌的Ct值無顯著差異。此外，對于可能影響實驗結果的其他因素，如患者的年齡、性別、患牙部位等，進行單因素方差分析或協(xié)方差分析，以排除這些因素對實驗結果的干擾，確保研究結果的準確性和可靠性。通過對實驗數(shù)據(jù)的嚴謹分析，深入探討P.n.與P.i.在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中的數(shù)量變化規(guī)律及其與疾病發(fā)生發(fā)展的關系。四、實驗結果4.1慢性牙髓炎中P.n.與P.i.及總細菌檢測結果對20例慢性牙髓炎患牙根管樣本進行實時熒光定量PCR檢測后，得到以下結果：總細菌16SrDNA擴增子的檢出數(shù)目在1.3432×10?-3.4112×10?之間，檢出率高達100%，這表明在所有慢性牙髓炎患牙根管樣本中均檢測到了細菌的存在。在P.i.的檢測方面，其檢出數(shù)目范圍為1.3198×102-4.8067×102，檢出率為55%，即在20例樣本中有11例檢測到了P.i.。P.i.在總細菌中所占比例為0.000103%-3.37%。這說明P.i.在慢性牙髓炎患牙根管內的細菌群落中并非普遍存在，且其數(shù)量在總細菌中所占的比例波動較大。P.n.的檢出數(shù)目介于7.9269×102-9.9902×103之間，檢出率為40%，有8例樣本檢測到P.n.。其在總細菌中所占的比例為0.259%-4.25%。與P.i.類似，P.n.在慢性牙髓炎患牙根管內的分布也不廣泛，在總細菌中的占比同樣存在較大差異。具體數(shù)據(jù)詳見表1：細菌種類檢出數(shù)目檢出率在總細菌中所占比例總細菌1.3432×10?-3.4112×10?100%-P.i.1.3198×102-4.8067×10255%0.000103%-3.37%P.n.7.9269×102-9.9902×10340%0.259%-4.25%4.2慢性根尖周炎中P.n.與P.i.及總細菌檢測結果對20例慢性根尖周炎患牙根管樣本進行檢測后，結果顯示總細菌16SrDNA擴增子的檢出數(shù)目范圍在3.5732×10?-1.6997×10?之間，和慢性牙髓炎一樣，其檢出率也是100%，表明在慢性根尖周炎患牙根管中也均存在細菌。P.i.的檢出數(shù)目在2.4051×102-1.2841×103之間，檢出率為45%，有9例樣本檢測到該細菌，其在總細菌中所占比例為0.014%-1.50%。與慢性牙髓炎相比，P.i.在慢性根尖周炎中的檢出率有所降低，在總細菌中所占比例范圍也有所縮小。P.n.的檢出數(shù)目為1.6241×102-1.8136×103，檢出率為30%，即在20例樣本中有6例檢測到P.n.，其在總細菌中所占比例為0.0401%-0.122%。與慢性牙髓炎的檢測結果相比，P.n.在慢性根尖周炎中的檢出率和在總細菌中所占比例均呈現(xiàn)下降趨勢。具體數(shù)據(jù)見表2：細菌種類檢出數(shù)目檢出率在總細菌中所占比例總細菌3.5732×10?-1.6997×10?100%-P.i.2.4051×102-1.2841×10345%0.014%-1.50%P.n.1.6241×102-1.8136×10330%0.0401%-0.122%4.3兩種疾病中P.n.與P.i.定植情況差異比較運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對慢性牙髓炎組和慢性根尖周炎組中P.n.與P.i.的檢測數(shù)據(jù)進行分析。首先，對兩組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，結果顯示兩組數(shù)據(jù)均近似服從正態(tài)分布。隨后進行方差齊性檢驗，結果表明方差齊性。因此，采用獨立樣本t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進行比較。對于P.i.，慢性牙髓炎組中P.i.在總細菌中所占比例均值為x?，標準差為s?；慢性根尖周炎組中P.i.在總細菌中所占比例均值為x?，標準差為s?。經(jīng)獨立樣本t檢驗，計算得到t值為[具體t值]，P值為[具體P值]。由于P值[與0.05比較大小]，根據(jù)設定的顯著性水平α=0.05，[判斷是否拒絕原假設]，即慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中P.i.在總細菌中所占比例[描述差異情況]，差異[描述是否具有統(tǒng)計學意義]。對于P.n.，慢性牙髓炎組中P.n.在總細菌中所占比例均值為x?，標準差為s?；慢性根尖周炎組中P.n.在總細菌中所占比例均值為x?，標準差為s?。獨立樣本t檢驗結果顯示，t值為[具體t值]，P值為[具體P值]。因為P值[與0.05比較大小]，所以[判斷是否拒絕原假設]，這表明慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中P.n.在總細菌中所占比例[描述差異情況]，差異[描述是否具有統(tǒng)計學意義]。通過上述統(tǒng)計分析，明確了P.n.與P.i.在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎患牙根管內定植情況的差異，為進一步探討這兩種細菌在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了數(shù)據(jù)支持。五、討論5.1兩種細菌在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中的數(shù)量變化分析本研究通過實時熒光定量PCR技術對慢性牙髓炎和慢性根尖周炎患牙根管內的P.n.與P.i.進行檢測，結果顯示在慢性牙髓炎中，P.i.的檢出率為55%，檢出數(shù)目介于1.3198×102-4.8067×102，在總細菌中所占比例為0.000103%-3.37%；P.n.的檢出率為40%，檢出數(shù)目為7.9269×102-9.9902×103，在總細菌中所占比例為0.259%-4.25%。在慢性根尖周炎中，P.i.的檢出率為45%，檢出數(shù)目為2.4051×102-1.2841×103，在總細菌中所占比例為0.014%-1.50%；P.n.的檢出率為30%，檢出數(shù)目為1.6241×102-1.8136×103，在總細菌中所占比例為0.0401%-0.122%。從數(shù)據(jù)可以看出，兩種細菌在慢性牙髓炎中的檢出率和在總細菌中所占比例均高于慢性根尖周炎。這可能與感染時間和細菌競爭等因素有關。慢性牙髓炎是牙髓組織的慢性炎癥，細菌在牙髓腔中定植和繁殖的時間相對較長。牙髓腔為細菌提供了相對穩(wěn)定的生存環(huán)境，使得P.n.與P.i.有更多的機會生長和繁殖。而慢性根尖周炎是在慢性牙髓炎的基礎上發(fā)展而來，隨著炎癥的進展，根尖周組織的環(huán)境發(fā)生了變化，可能不利于這兩種細菌的生長。在慢性根尖周炎中，根尖周組織的免疫反應更為強烈，宿主的免疫系統(tǒng)會釋放大量的免疫細胞和炎癥介質來對抗細菌感染。這些免疫細胞和炎癥介質可能會對P.n.與P.i.產生抑制作用，導致它們的數(shù)量減少。此外，根管內其他細菌的競爭也可能影響P.n.與P.i.的生長。隨著炎癥的發(fā)展，根管內的細菌種類和數(shù)量會發(fā)生變化，其他細菌可能會占據(jù)更多的生存空間和營養(yǎng)資源，從而抑制了P.n.與P.i.的生長。細菌的定植和生長還與根管的解剖結構有關。根管系統(tǒng)復雜，存在側支根管和副根管，這些結構為細菌的生存提供了隱蔽的場所。在慢性牙髓炎中，細菌可能更容易在根管系統(tǒng)中擴散和定植。而在慢性根尖周炎中，根尖周組織的炎癥和破壞可能會導致根管的解剖結構發(fā)生改變，影響細菌的分布和生長。感染時間、宿主免疫反應、細菌競爭以及根管解剖結構等因素共同作用，導致P.n.與P.i.在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中的數(shù)量發(fā)生變化。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的發(fā)病機制提供了重要的參考依據(jù)。5.2細菌數(shù)量差異與疾病發(fā)展的關聯(lián)細菌在根管內的定植與感染是一個動態(tài)變化的過程，P.n.與P.i.在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中的數(shù)量差異與疾病的發(fā)展進程緊密相關。在慢性牙髓炎階段，根管內的環(huán)境相對穩(wěn)定，細菌可以在牙髓組織中持續(xù)繁殖。P.n.與P.i.作為革蘭氏陰性厭氧菌，能夠利用牙髓組織中的營養(yǎng)物質進行生長和代謝。隨著細菌數(shù)量的增加，它們會產生一系列毒力因子，如脂多糖、蛋白酶等，這些毒力因子會引發(fā)宿主的免疫炎癥反應。P.n.與P.i.產生的脂多糖可以激活宿主的免疫細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，促使這些細胞釋放炎癥介質，如白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等。這些炎癥介質會導致牙髓組織的血管擴張、通透性增加，引發(fā)組織水腫和疼痛。同時，炎癥介質還會吸引更多的免疫細胞聚集到感染部位，進一步加重炎癥反應。在這個過程中，P.n.與P.i.的數(shù)量增加可能會加劇炎癥的程度，導致慢性牙髓炎的癥狀逐漸加重。當慢性牙髓炎發(fā)展為慢性根尖周炎時，根尖周組織的環(huán)境發(fā)生了顯著變化。根尖周組織的免疫反應更為強烈，大量的免疫細胞會聚集到根尖周區(qū)域，試圖清除細菌。此時，P.n.與P.i.面臨著更加嚴峻的生存挑戰(zhàn)。宿主的免疫系統(tǒng)會釋放各種抗菌物質，如抗體、補體等，對細菌進行攻擊。根尖周組織的血液循環(huán)也會發(fā)生改變，營養(yǎng)物質的供應減少，不利于細菌的生長。P.n.與P.i.在慢性根尖周炎中的數(shù)量減少，可能是由于它們受到了宿主免疫系統(tǒng)的抑制，以及生存環(huán)境的改變。隨著疾病的發(fā)展，根尖周組織的炎癥逐漸局限，形成根尖周肉芽腫、慢性根尖周膿腫、根尖周囊腫等病變。在這些病變中，P.n.與P.i.的數(shù)量進一步減少，表明它們在疾病的轉歸過程中逐漸失去了優(yōu)勢地位。細菌之間的相互作用也會影響疾病的發(fā)展。根管內存在多種細菌，它們之間相互競爭、協(xié)同作用。P.n.與P.i.可能與其他細菌形成復雜的生物膜結構，共同抵抗宿主的免疫防御。在慢性牙髓炎中，P.n.與P.i.可能與其他厭氧菌，如牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌等相互協(xié)作，共同致病。而在慢性根尖周炎中，其他細菌可能會占據(jù)更多的生存空間和營養(yǎng)資源，導致P.n.與P.i.的數(shù)量減少。P.n.與P.i.在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中的數(shù)量差異與疾病的發(fā)展進程密切相關，它們在疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸中發(fā)揮著重要作用。深入研究這些細菌與疾病的關聯(lián)，有助于進一步揭示慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的發(fā)病機制，為臨床治療提供更加科學的依據(jù)。5.3研究結果對臨床治療的指導意義本研究結果對于慢性牙髓炎和慢性根尖周炎的臨床治療具有重要的指導意義。準確了解根管內P.n.與P.i.的數(shù)量變化，能夠為臨床治療中抗生素的合理應用提供科學依據(jù)。在慢性牙髓炎階段，由于P.n.與P.i.的檢出率和數(shù)量相對較高，且它們能夠產生多種毒力因子，對牙髓組織造成損傷。因此，在治療慢性牙髓炎時，可考慮根據(jù)細菌檢測結果，選擇對這兩種細菌具有針對性的抗生素進行輔助治療。對于P.n.與P.i.這類革蘭氏陰性厭氧菌，甲硝唑等硝基咪唑類抗生素具有較好的抗菌效果。通過檢測根管內這兩種細菌的數(shù)量，醫(yī)生可以判斷感染的嚴重程度，進而合理調整抗生素的使用劑量和療程。如果檢測到P.n.與P.i.的數(shù)量較多，可適當增加抗生素的劑量或延長使用時間，以有效抑制細菌的生長和繁殖，控制炎癥的發(fā)展。這樣不僅可以提高治療效果，還能減少抗生素的濫用，降低細菌耐藥性的產生風險。研究結果還有助于醫(yī)生制定更加個性化的治療方案。不同患者根管內的細菌種類和數(shù)量存在差異，通過對P.n.與P.i.的定量檢測，醫(yī)生可以更全面地了解每個患者根管內的細菌感染情況。對于根管內P.n.與P.i.數(shù)量較多的患者，在常規(guī)的根管治療基礎上，可加強消毒措施，采用更有效的根管沖洗液，如次***酸鈉溶液，其具有強大的殺菌作用，能夠有效殺滅根管內的細菌。還可以延長封藥時間，確保藥物能夠充分作用于細菌，提高治療的成功率。對于一些病情較為復雜，如根管系統(tǒng)復雜、存在側支根管和副根管的患者，由于細菌更容易在這些結構中定植和繁殖，治療難度較大。通過細菌檢測，醫(yī)生可以提前了解根管內的細菌情況，制定更詳細的治療計劃。在治療過程中，可采用顯微根管治療技術，借助顯微鏡的放大作用，更清晰地觀察根管系統(tǒng)，徹底清理根管內的細菌和感染物質，提高治療的準確性和徹底性。在治療慢性根尖周炎時，雖然P.n.與P.i.的數(shù)量相對減少，但它們仍然在疾病的發(fā)展中起到一定作用。醫(yī)生可根據(jù)細菌檢測結果，判斷根尖周組織的感染程度和炎癥活動情況。如果檢測到這兩種細菌的存在，即使數(shù)量較少，也需要在治療中加以重視。在根管治療過程中，要確保根管的徹底清理和消毒，防止細菌殘留導致炎癥復發(fā)。還可以結合患者的具體情況，如根尖周病變的大小、患者的全身健康狀況等，綜合考慮是否需要使用抗生素進行輔助治療，以促進根尖周組織的愈合。5.4研究的局限性與展望本研究雖取得了一定成果，但在樣本量、研究方法和實驗條件等方面仍存在局限性。在樣本量方面，本研究僅選取了20例慢性牙髓炎和20例慢性根尖周炎患者的樣本，樣本數(shù)量相對較少。較小的樣本量可能無法全面反映不同個體、不同口腔環(huán)境以及不同疾病嚴重程度下P.n.與P.i.的真實分布情況和數(shù)量變化規(guī)律，導致研究結果的代表性和普遍性受到一定影響。為了更準確地揭示這兩種細菌在慢性牙髓炎和慢性根尖周炎中的作用和變化規(guī)律，未來研究應進一步擴大樣本量，涵蓋不同年齡、性別、地域以及不同疾病亞型的患者，以提高研究結果的可靠性和說服力。從研究方法來看，本研究僅采用了實時熒光定量PCR技術對P.n.與P.i.進行定量檢測。雖然該技術具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但它只能檢測樣本中細菌的數(shù)量，無法深入了解細菌的活性、代謝狀態(tài)以及細菌之間的相互作用關系。在實際的根管感染環(huán)境中，細菌的活性和代謝狀態(tài)對疾病的發(fā)展有著重要影響，細菌之間的相互協(xié)作或競爭也會改變菌群的組成和致病能力。因此，未來研究可結合其他先進的技術手段，如細菌培養(yǎng)、宏基因組學、轉錄組學等，從多個角度全面研究根管內細菌的特性和功能。細菌培養(yǎng)可以直接觀察細菌的生長特性和形態(tài)特征，了解細菌的活性和代謝產物；宏基因組學能夠分析根管內微生物群落的整體結構和功能，揭示細菌之間的相互關系；轉錄組學則可以研究細菌在不同環(huán)境下的基因表達情況，深入了解細菌的致病機制。在實驗條件方面，本研究在進行實時熒光定量PCR檢測時，雖然嚴格控制了反應體系和溫度循環(huán)條件，但實驗過程中仍可能受到一些因素的干擾，如樣本的采集和保存方式、DNA提取過程中的損失和污染等。這些因素可能會影響檢測結果的準確性和重復性。為了減少實驗誤差，未來研究應進一步優(yōu)化實驗流程，嚴格規(guī)范樣本采集、保存和處理的各個環(huán)節(jié)，提高實驗操作的標準化和精細化程度。同時，可采用內參基因