慢病毒eIF4E-shRNA載體構建及對Hela細胞株感染機制的深度剖析一、引言1.1研究背景宮頸癌是婦科腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女健康。據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內，宮頸癌的死亡率在婦女惡性腫瘤中位居前列。我國每年新增宮頸癌病例數(shù)量約13.5萬，約占全球發(fā)病數(shù)量的1/3。盡管近40年來，由于宮頸細胞學篩查的發(fā)展與普遍應用，宮頸癌及癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，其發(fā)病率和死亡率有所下降，但近年來宮頸癌發(fā)病趨于年輕化，這使得宮頸癌仍然是嚴重危害婦女健康的重大疾病。因此，深入研究宮頸癌的病變機理，對于早期診斷和治療宮頸癌具有至關重要的指導意義。在腫瘤分子生物學研究領域，某些基因的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。真核細胞翻譯起始因子4E（eukaryotictranslationinitiationfactor4E，eIF4E）便是其中備受關注的基因之一。eIF4E定位與人染色體4q2-q25上，包含一條由8條反平行β鏈組成的β折疊片和三個與β折疊片平行的α螺旋。它是真核細胞翻譯的重要節(jié)點，對帽依賴性翻譯的起始及限速具有關鍵的調節(jié)能力。臨床研究已證實eIF4E具備細胞增殖及轉換蛋白翻譯的能力，然而其調控表達機制至今尚無明確結論。大量研究表明，eIF4E在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色。在食管鱗狀細胞癌組織中，eIF4E的表達水平明顯高于正常食管組織，且其高表達與腫瘤的生長、增殖和侵襲密切相關。通過促進c-mycmRNA和VEGFmRNA的轉化以及TNF-α誘導的MMP-9表達，eIF4E能夠促進腫瘤細胞的增殖、血管生成和侵襲。同時，eIF4E的高表達還與食管鱗狀細胞癌的放射治療敏感度、細胞周期控制以及自噬機制等生物學進程相關，進而影響患者的預后。在口腔鱗狀細胞癌中，eIF4E的陽性表達率與臨床病理分期、淋巴結轉移、腫瘤分級等因素具有明顯相關性，且eIF4E陽性表達患者的預后相對較差。對于宮頸癌而言，國內對eIF4E與宮頸癌之間聯(lián)系的研究相對較少，其對宮頸癌的作用機制研究也尚處于起步階段。已有研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E在正常宮頸上皮組織中無表達，在CINⅠ級組織中同樣無表達，在CINⅡ級組織中偶有表達，陽性率為30%；在CINⅢ級中呈高表達，陽性率達70%，強陽性率為10%；而在宮頸癌組織中，無論是鱗癌還是腺癌均有強表達，陽性率為100%，并且其表達與宮頸癌期別呈正相關性，即Ⅱ期組＞Ⅰ期組，Ⅲ-Ⅳ期組＞Ⅱ期組。eIF4E在低分化癌中的染色灰度明顯高于中分化及高分化組。這一系列研究結果表明，eIF4E可能作為宮頸癌的預測腫瘤標志物之一，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。鑒于eIF4E在腫瘤研究中的重要地位以及在宮頸癌研究中的潛在價值，本研究聚焦于利用RNA干擾技術，以人eIF4E基因為靶基因設計特異性的小干擾RNA（smallinterferenceRNA，siRNA），構建人eIF4E基因短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA）重組慢病毒質粒表達載體，并進行PCR和測序鑒定。在此基礎上，利用重組成功的慢病毒表達載體轉染包裝細胞293T，初步觀察慢病毒顆粒對宮頸癌Hela細胞的感染情況，旨在為進一步研究該載體對目的基因eIF4E的沉默效果以及探索宮頸癌基因治療的新方法奠定堅實基礎。1.2研究目的本研究旨在通過RNA干擾技術，構建針對人eIF4E基因的shRNA重組慢病毒質粒表達載體，并對其進行PCR和測序鑒定。隨后，利用重組成功的慢病毒表達載體轉染包裝細胞293T，獲取慢病毒顆粒，并將其感染宮頸癌Hela細胞，初步觀察感染情況。通過這些研究，期望能夠為后續(xù)深入探究該載體對目的基因eIF4E的沉默效果提供堅實基礎，進而探索出一條全新的、更有效的宮頸癌基因治療途徑，為改善宮頸癌患者的治療效果和預后提供新的可能。1.3研究創(chuàng)新點本研究在技術方法和研究視角等方面具有顯著的創(chuàng)新之處。在技術方法上，采用RNA干擾技術沉默eIF4E基因表達，構建人eIF4E基因shRNA重組慢病毒質粒表達載體，相較于傳統(tǒng)的基因敲除方法，RNA干擾技術具有更高的特異性和靈活性，能夠更精準地調控基因表達，為研究eIF4E基因在宮頸癌中的作用機制提供了有力工具。同時，利用慢病毒載體作為基因傳遞工具，慢病毒載體能夠將外源基因穩(wěn)定整合到宿主染色體上，實現(xiàn)長期表達，且可感染分裂期和非分裂期的細胞，具有高效感染、穩(wěn)定整合、安全性較高等優(yōu)點，為后續(xù)深入研究eIF4E基因沉默對宮頸癌Hela細胞的影響提供了可靠的技術保障。在研究視角上，本研究聚焦于eIF4E基因在宮頸癌中的作用機制，目前國內對eIF4E與宮頸癌之間聯(lián)系的研究相對較少，其作用機制研究尚處于起步階段。本研究通過構建慢病毒eIF4E-shRNA并感染Hela細胞株，深入探究eIF4E基因沉默對宮頸癌Hela細胞的影響，為宮頸癌的發(fā)病機制研究提供了新的視角，有望為宮頸癌的早期診斷和治療提供新的靶點和思路。此外，本研究將基礎研究與臨床應用緊密結合，旨在探索宮頸癌基因治療的新方法，為改善宮頸癌患者的治療效果和預后提供了新的可能，具有重要的臨床應用價值。二、慢病毒及eIF4E-shRNA相關理論基礎2.1慢病毒概述2.1.1慢病毒結構與特性慢病毒屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬，是一類具有包膜的RNA病毒，其病毒粒子直徑為80-120nm，呈二十面體對稱結構，外觀近似球形。從結構上看，慢病毒顆粒最外層為包膜，包膜蛋白決定了病毒感染細胞的類型，它能夠識別并結合宿主細胞表面的特定受體，介導病毒進入宿主細胞。包膜內側依次為基質蛋白和衣殼，對病毒的核心結構起到保護作用。而慢病毒最核心的部分是兩條相同的正股RNA鏈以及病毒復制所必需的酶類，包括逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶等。這些酶在病毒的生命周期中發(fā)揮著關鍵作用，逆轉錄酶可將病毒的RNA基因組反轉錄為DNA，整合酶能介導前病毒DNA基因組整合到宿主細胞基因組中，蛋白酶則在病毒成熟過程中負責加工gag和gag-pol多蛋白。與一般的逆轉錄病毒相比，慢病毒具有一些獨特的特性。其中最為顯著的是其廣泛的宿主范圍，它不僅能夠有效地感染分裂期細胞，還對非分裂期細胞具有感染能力。這一特性使得慢病毒在基因治療和基因功能研究等領域具有重要的應用價值。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，神經(jīng)元細胞大多處于非分裂狀態(tài)，慢病毒能夠感染神經(jīng)元細胞并將外源基因導入其中，為研究神經(jīng)系統(tǒng)相關基因的功能以及開發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法提供了有力工具。此外，慢病毒能將外源基因有效地整合入宿主染色體上，介導目的基因穩(wěn)定、長期的表達。這對于需要長期調控基因表達的研究和治療應用至關重要，如構建穩(wěn)定表達特定基因的細胞系，用于藥物篩選、疾病模型建立等研究。而且，慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細胞免疫應答，可作為一種體外基因運輸?shù)陌踩ぞ撸浣閷У霓D基因表達能持續(xù)數(shù)月，且無可觀察到的病理學現(xiàn)象，這為其在動物實驗和臨床研究中的應用提供了優(yōu)勢。2.1.2慢病毒載體系統(tǒng)組成與工作原理慢病毒載體系統(tǒng)主要由包裝成分和載體成分兩部分組成。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。通常情況下，包裝成分被分開構建到兩個質粒上，一個質粒表達Gag和Pol蛋白，Gag蛋白構成病毒的核心結構蛋白，Pol蛋白則包含逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶等病毒特異性的酶；另一個質粒表達Env蛋白，Env蛋白形成病毒的包膜，決定了病毒的宿主范圍和感染特異性。將這兩個包裝質粒與載體成分共轉染細胞（如人腎293T細胞），即可在細胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。這種設計的目的是降低恢復成野生型病毒的可能性，提高慢病毒載體系統(tǒng)的安全性。載體成分與包裝成分互補，其含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為進一步降低兩種成分同源重組恢復成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，例如將包裝成分上5′LTR換成巨細胞病毒（CMV）立即早期啟動子、3′LTR換成SV40polyA等。在實際應用中，首先根據(jù)實驗需求，將目的基因插入到載體成分的多克隆位點中，構建成重組慢病毒載體。然后將重組慢病毒載體與表達Gag、Pol蛋白的質粒以及表達Env蛋白的質粒共轉染到包裝細胞（如293T細胞）中。在包裝細胞內，這些質粒會進行轉錄和翻譯，產(chǎn)生病毒復制和包裝所需的各種蛋白和RNA。其中，重組慢病毒載體轉錄出的包含目的基因的RNA與Gag、Pol蛋白以及Env蛋白等組裝成完整的病毒顆粒，并分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。收集含有病毒顆粒的上清液，經(jīng)過濃縮、純化等處理后，即可得到高滴度的慢病毒。將這些慢病毒用于感染靶細胞，病毒顆粒會通過包膜蛋白與靶細胞表面受體結合，進入靶細胞內。隨后，病毒的RNA基因組在逆轉錄酶的作用下反轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體進入細胞核，在整合酶的作用下，DNA整合到宿主細胞基因組中。整合后的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白，從而實現(xiàn)目的基因在靶細胞中的穩(wěn)定表達。通過這種方式，慢病毒載體系統(tǒng)能夠高效地將外源目的基因導入到各種類型的細胞中，為基因治療、基因功能研究等提供了強大的技術支持。2.2eIF4E基因與shRNA技術2.2.1eIF4E基因功能與在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用eIF4E基因作為真核細胞翻譯起始因子家族中的關鍵成員，在細胞的生命活動中發(fā)揮著極為重要的作用。其編碼的eIF4E蛋白是真核細胞翻譯起始過程中的關鍵限速因子，主要通過特異性地識別并結合mRNA的5'端帽子結構（m7GpppN），啟動帽依賴性翻譯過程。在這一過程中，eIF4E與其他翻譯起始因子，如eIF4A、eIF4G等共同組裝形成eIF4F復合物，該復合物能夠使mRNA的5'非編碼區(qū)的二級結構發(fā)生解旋，從而暴露翻譯起始位點，為核糖體的結合和蛋白質合成的起始創(chuàng)造條件。eIF4E對細胞的增殖和分化具有重要的調控作用。在正常細胞中，eIF4E的表達水平和活性受到嚴格的調控，以維持細胞正常的生長和分化。當eIF4E的表達或活性發(fā)生異常改變時，細胞的增殖和分化過程就會受到顯著影響。在腫瘤細胞中，eIF4E往往呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，這種高表達能夠促進腫瘤細胞的增殖。eIF4E可以通過增強一些與細胞增殖密切相關的基因mRNA的翻譯效率，如c-myc、cyclinD1等，從而加速腫瘤細胞的生長和分裂。c-myc基因編碼的蛋白質是一種轉錄因子，它在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用。eIF4E高表達時，能夠促進c-mycmRNA的翻譯，使細胞內c-myc蛋白的含量增加，進而激活一系列與細胞增殖相關的信號通路，推動細胞進入增殖周期。cyclinD1是細胞周期蛋白家族中的重要成員，它在細胞周期的G1期向S期轉變過程中起著關鍵的調控作用。eIF4E高表達可促進cyclinD1mRNA的翻譯，增加cyclinD1蛋白的表達量，加速細胞周期的進程，促進腫瘤細胞的增殖。eIF4E還與腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關。腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個復雜的多步驟過程，涉及腫瘤細胞與細胞外基質的相互作用、細胞遷移能力的增強以及血管生成等多個環(huán)節(jié)。研究表明，eIF4E能夠通過多種機制促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。eIF4E可以調節(jié)一些與細胞黏附、遷移相關的基因表達，如MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）、VEGF（血管內皮生長因子）等。MMP-9是一種能夠降解細胞外基質的蛋白酶，它在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用。eIF4E高表達時，能夠促進MMP-9mRNA的翻譯，使腫瘤細胞分泌更多的MMP-9，降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠促進腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞的生長和轉移提供營養(yǎng)和氧氣。eIF4E可以通過增強VEGFmRNA的翻譯，提高腫瘤細胞中VEGF的表達水平，促進腫瘤血管生成，進而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。eIF4E還可能通過調節(jié)細胞內的信號通路，如PI3K/Akt信號通路等，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。PI3K/Akt信號通路在細胞的生長、存活、增殖和遷移等過程中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用。eIF4E高表達時，可能激活PI3K/Akt信號通路，使細胞內的一些與遷移和侵襲相關的蛋白發(fā)生磷酸化修飾，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在多種腫瘤類型中，eIF4E的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。在乳腺癌中，eIF4E的高表達與腫瘤的分級、淋巴結轉移以及患者的不良預后顯著相關。研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E高表達的乳腺癌患者，其腫瘤細胞的增殖活性更高，更容易發(fā)生淋巴結轉移，患者的生存期也相對較短。在結直腸癌中，eIF4E的表達水平與腫瘤的分期、侵襲深度以及遠處轉移密切相關。eIF4E高表達的結直腸癌患者，其腫瘤更容易侵犯周圍組織和器官，發(fā)生遠處轉移的風險也更高，患者的預后較差。這些研究結果表明，eIF4E在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色，有望成為腫瘤診斷、治療和預后評估的重要靶點。2.2.2shRNA技術原理與應用shRNA技術是一種基于RNA干擾（RNAinterference，RNAi）機制的基因沉默技術，其原理是通過設計并導入特定的shRNA序列，在細胞內被加工成小干擾RNA（siRNA），進而引發(fā)對靶基因mRNA的特異性降解，實現(xiàn)對靶基因表達的有效抑制。具體來說，shRNA是一種非編碼的小RNA分子，其結構包含兩個短反向重復序列，中間由一個莖環(huán)（loop）序列分隔，形成發(fā)夾結構。當shRNA被導入細胞后，首先會被細胞內的核酸酶Dicer識別并切割，形成具有雙鏈結構的siRNA。siRNA會與一系列蛋白質結合，形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，siRNA的一條鏈會被降解，另一條鏈則作為引導鏈，識別并結合與自身互補的靶基因mRNA序列。一旦結合，RISC中的核酸酶就會對靶基因mRNA進行切割，使其降解，從而阻止靶基因mRNA的翻譯過程，實現(xiàn)對靶基因表達的沉默。在腫瘤研究領域，shRNA技術已被廣泛應用于腫瘤基因治療的研究中。通過設計針對腫瘤相關基因的shRNA，如癌基因、腫瘤轉移相關基因等，可以有效地抑制這些基因的表達，從而達到抑制腫瘤細胞生長、增殖、侵襲和轉移的目的。在乳腺癌研究中，有研究人員利用shRNA技術沉默了乳腺癌細胞中的HER2基因。HER2基因是一種與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的癌基因，其高表達與乳腺癌的惡性程度和不良預后相關。通過將針對HER2基因的shRNA導入乳腺癌細胞中，成功地降低了HER2基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞的增殖能力明顯受到抑制，細胞周期進程受阻，細胞凋亡增加。沉默HER2基因還降低了乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力，為乳腺癌的治療提供了新的策略。在肝癌研究中，針對肝癌細胞中高表達的MDR1基因（多藥耐藥基因1）設計shRNA，能夠有效地降低MDR1基因的表達，逆轉肝癌細胞的多藥耐藥性。MDR1基因編碼的P-糖蛋白是一種藥物外排泵，它能夠將進入細胞內的化療藥物泵出細胞外，導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。通過沉默MDR1基因，提高了肝癌細胞對化療藥物的敏感性，增強了化療藥物的抗腫瘤效果。shRNA技術還在基因功能研究中發(fā)揮著重要作用。通過構建針對不同基因的shRNA表達載體，將其導入細胞中，觀察細胞的表型變化，可以深入研究基因的功能及其在細胞生物學過程中的作用機制。在研究細胞周期調控機制時，利用shRNA技術沉默了細胞周期蛋白CyclinE基因。結果發(fā)現(xiàn)，細胞周期進程受到明顯影響，細胞停滯在G1期，無法正常進入S期。進一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默CyclinE基因還導致了一系列與細胞周期調控相關的蛋白表達發(fā)生改變，揭示了CyclinE基因在細胞周期調控中的關鍵作用。在神經(jīng)科學領域，利用shRNA技術研究神經(jīng)遞質受體基因的功能。通過沉默特定的神經(jīng)遞質受體基因，觀察神經(jīng)元的電生理活動和行為變化，有助于深入了解神經(jīng)遞質系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機制。除了腫瘤研究和基因功能研究，shRNA技術在其他領域也有廣泛的應用。在病毒感染性疾病的研究中，利用shRNA技術可以針對病毒基因設計shRNA，抑制病毒的復制和感染。針對乙型肝炎病毒（HBV）的關鍵基因設計shRNA，能夠有效地抑制HBV在細胞內的復制，為乙型肝炎的治療提供了新的思路。在心血管疾病研究中，通過沉默與心血管疾病相關的基因，如血管緊張素轉換酶（ACE）基因等，可以研究其在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，為心血管疾病的治療提供潛在的靶點。三、慢病毒eIF4E-shRNA的構建流程3.1實驗材料準備在構建慢病毒eIF4E-shRNA的實驗中，選用了人宮頸癌細胞系Hela和人胚腎細胞系293T作為細胞材料。Hela細胞系是研究宮頸癌的常用細胞模型，其具有典型的宮頸癌細胞特性，便于后續(xù)研究慢病毒對宮頸癌相關基因的影響。293T細胞系則因其易于轉染和高效表達外源基因的特性，被廣泛應用于病毒包裝過程中，能夠為慢病毒的生產(chǎn)提供良好的宿主環(huán)境。實驗使用的質粒包括pLV-XshRNA2慢病毒載體、pMD2.G質粒和psPAX2質粒。pLV-XshRNA2慢病毒載體是構建eIF4E-shRNA的關鍵載體，其包含了啟動子、多克隆位點、篩選標記等元件，能夠有效地插入并表達shRNA序列。pMD2.G質粒編碼水皰性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），該蛋白能夠修飾慢病毒顆粒的包膜，使其具有更廣泛的宿主范圍和更高的感染效率。psPAX2質粒則提供了慢病毒包裝所需的各種輔助蛋白，如Gag、Pol等，對于慢病毒顆粒的組裝和成熟至關重要。實驗所需的試劑種類繁多，涵蓋了細胞培養(yǎng)、分子生物學操作等多個方面。在細胞培養(yǎng)方面，DMEM培養(yǎng)基是Hela細胞和293T細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，它含有細胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖類等。胎牛血清（FBS）則為細胞提供了生長因子、激素和其他營養(yǎng)物質，有助于細胞的增殖和維持細胞的正常生理功能。青霉素-鏈霉素雙抗溶液用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。胰蛋白酶-EDTA消化液用于消化貼壁生長的細胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進行細胞傳代和實驗操作。在分子生物學操作方面，限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ用于切割質粒，以便將目的基因插入到載體中。這兩種酶具有特異性的識別序列和切割位點，能夠精確地切割雙鏈DNA分子。T4DNA連接酶則用于連接切割后的載體和目的基因，形成重組質粒。它能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵的形成，實現(xiàn)DNA分子的連接。DNAMarker用于在瓊脂糖凝膠電泳中作為分子量標準，通過與樣品條帶的遷移距離進行比較，可以確定樣品DNA片段的大小。DNA凝膠回收試劑盒用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，其原理是利用特殊的硅膠膜在高鹽緩沖液條件下對DNA的特異性吸附，通過洗滌和洗脫步驟獲得高純度的DNA片段。質粒小提試劑盒用于從細菌中提取質粒DNA，其操作簡便、快速，能夠獲得高質量的質粒DNA，滿足后續(xù)實驗的需求。Lipofectamine3000轉染試劑是一種高效的陽離子脂質體轉染試劑，能夠將質粒DNA高效地轉染到細胞中。它通過與DNA形成復合物，然后與細胞膜相互作用，將DNA導入細胞內。嘌呤霉素（Puromycin）是一種抗生素，用于篩選穩(wěn)定轉染的細胞。它能夠抑制蛋白質合成，只有成功轉染并表達抗性基因的細胞才能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活和生長。實驗中用到的儀器設備主要包括CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺、離心機、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、恒溫搖床和水浴鍋等。CO?培養(yǎng)箱為細胞提供了適宜的生長環(huán)境，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，滿足細胞生長的需求。超凈工作臺則提供了一個無菌的操作環(huán)境，有效防止了實驗過程中的微生物污染。離心機用于離心分離細胞、沉淀蛋白質和核酸等，根據(jù)不同的實驗需求，可以選擇不同類型和轉速的離心機。PCR儀用于進行聚合酶鏈式反應，能夠快速擴增特定的DNA片段，通過精確控制反應溫度和時間，實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴增。凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和記錄瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶，它能夠對凝膠進行拍照和分析，確定DNA片段的大小和純度。移液器是精確移取液體試劑的重要工具，能夠保證實驗操作的準確性和重復性。恒溫搖床用于細菌培養(yǎng)和細胞振蕩培養(yǎng)，提供了適宜的溫度和振蕩條件，促進細菌和細胞的生長。水浴鍋則用于控制反應溫度，在DNA酶切、連接等實驗步驟中，需要將反應體系置于特定溫度的水浴鍋中進行反應。這些儀器設備在實驗中各自發(fā)揮著重要作用，相互配合，確保了實驗的順利進行。3.2eIF4E靶點序列設計設計eIF4E靶點序列是構建慢病毒eIF4E-shRNA的關鍵步驟，其設計依據(jù)主要基于eIF4E基因的核苷酸序列以及RNA干擾技術的作用原理。eIF4E基因在人類基因組中具有特定的核苷酸序列，通過對其序列的深入分析，能夠篩選出適合作為RNA干擾靶點的區(qū)域。在RNA干擾過程中，shRNA需要與靶基因mRNA的特定區(qū)域互補配對，才能引發(fā)對靶基因mRNA的特異性降解，從而實現(xiàn)對eIF4E基因表達的有效抑制。因此，靶點序列的選擇直接影響到RNA干擾的效果。在設計eIF4E靶點序列時，采用了生物信息學分析方法。首先，從NCBI（美國國立生物技術信息中心）數(shù)據(jù)庫中獲取人eIF4E基因的mRNA序列（登錄號：NM_001966.4），該序列包含了eIF4E基因的完整編碼區(qū)和非編碼區(qū)信息。然后，利用專門的RNA干擾設計軟件，如siDirect2.0、RNAiDesigner等，對eIF4E基因的mRNA序列進行分析。這些軟件能夠根據(jù)RNA干擾的相關規(guī)則和算法，預測出潛在的有效靶點序列。在選擇靶點序列時，遵循了一系列的篩選標準。靶點序列應位于eIF4E基因的編碼區(qū)，以確保能夠特異性地干擾eIF4E基因的表達，而不影響其他基因的正常功能。避免選擇含有重復序列、低復雜度區(qū)域以及與其他基因同源性較高的序列作為靶點，以防止脫靶效應的發(fā)生。脫靶效應是指shRNA與非靶基因的mRNA發(fā)生非特異性結合，導致對非靶基因表達的干擾，從而產(chǎn)生不必要的生物學效應和實驗誤差。還考慮了靶點序列的GC含量，一般認為GC含量在30%-70%之間的序列較為合適，因為過高或過低的GC含量可能會影響shRNA的穩(wěn)定性和干擾效率。例如，經(jīng)過軟件分析和篩選，發(fā)現(xiàn)eIF4E基因mRNA序列中的一段19-21個核苷酸的序列，其GC含量為50%，且位于編碼區(qū)的關鍵位置，與其他基因的同源性較低，符合上述篩選標準，因此將其確定為潛在的靶點序列。為了進一步驗證所選靶點序列的有效性，還進行了同源性比對分析。利用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）工具，將潛在的靶點序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，確保其僅與eIF4E基因具有高度的互補性，而與其他基因的同源性極低，從而最大限度地降低脫靶效應的風險。通過上述一系列的設計和驗證步驟，最終確定了針對人eIF4E基因的特異性靶點序列，為后續(xù)構建慢病毒eIF4E-shRNA表達載體奠定了堅實的基礎。3.3合成的寡核苷酸模板退火將合成的針對eIF4E基因靶點序列的兩條單鏈寡核苷酸（正向鏈和反向鏈）進行退火處理，以形成雙鏈DNA模板，用于后續(xù)的載體構建。首先，按照以下體系在無菌的PCR管中配制退火反應液：每條單鏈寡核苷酸（100μM）各取2μl，10×退火緩沖液（含Tris-HCl、NaCl、EDTA等成分，pH7.5-8.0）5μl，加入無菌雙蒸水補足至50μl。其中，Tris-HCl提供穩(wěn)定的pH環(huán)境，維持反應體系的酸堿度穩(wěn)定，有利于寡核苷酸的退火反應；NaCl作為鹽離子成分，能夠中和DNA分子的負電荷，減少雙鏈間的靜電斥力，促進互補鏈的結合；EDTA則可以螯合金屬離子，防止核酸酶對寡核苷酸的降解作用。將配制好的反應液輕輕混勻，短暫離心，使溶液集中于管底。然后將PCR管放入PCR儀中，按照以下程序進行退火：先將溫度迅速升高至95℃，維持5分鐘，此步驟的目的是破壞寡核苷酸內的所有氫鍵，使單鏈充分解鏈，消除可能存在的二級結構。隨后，以每2-3分鐘降低1℃的速度緩慢冷卻至25℃，整個冷卻過程持續(xù)約45-60分鐘。緩慢冷卻的過程能夠促進互補的寡核苷酸鏈之間形成新的氫鍵，從而完成退火反應，形成雙鏈DNA模板。退火完成后，將PCR管取出，短暫離心，將反應液保存于4℃冰箱中備用，以防止雙鏈DNA模板再次解鏈或被核酸酶降解，確保其穩(wěn)定性，為后續(xù)的載體構建實驗提供高質量的模板。3.4慢病毒質粒擴增和回收將經(jīng)過退火形成的雙鏈DNA模板與pLV-XshRNA2慢病毒載體進行連接反應，構建重組慢病毒質粒。連接產(chǎn)物隨后轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，以實現(xiàn)重組慢病毒質粒的擴增。在轉化過程中，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞在冰上混合孵育30分鐘，使DNA能夠充分吸附到感受態(tài)細胞表面。接著進行42℃熱激90秒，促使細胞吸收DNA，然后迅速放回冰上冷卻2分鐘，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。之后向管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復生長并表達抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Ampicillin）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。氨芐青霉素能夠抑制未轉化的大腸桿菌生長，只有成功轉化并攜帶重組慢病毒質粒（含有氨芐青霉素抗性基因）的大腸桿菌才能在平板上生長形成單菌落。次日，從平板上挑取單個菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，進行進一步的擴增。使用質粒小提試劑盒對擴增后的大腸桿菌進行質粒提取。首先將菌液離心收集菌體，倒掉上清液后，加入250μlBufferP1（含有RNaseA，用于降解RNA，防止RNA對質粒提取的干擾）重懸菌體，使菌體充分分散。接著加入250μlBufferP2（含有NaOH和SDS，NaOH用于破壞細菌細胞壁和細胞膜，使細胞裂解，SDS則與蛋白質結合，促進蛋白質的變性和沉淀），輕柔顛倒混勻4-6次，此時溶液會變得清亮，表明細胞已充分裂解。隨后加入350μlBufferP3（含有醋酸鉀，用于中和溶液的堿性，使質粒DNA復性，并沉淀蛋白質和細胞碎片），立即輕柔顛倒混勻4-6次，會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。將混合物12000rpm離心10分鐘，使沉淀和上清液分離。將上清液轉移到吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的液體，此時質粒DNA會吸附在吸附柱的硅膠膜上。向吸附柱中加入500μlBufferPW（含有乙醇，用于洗滌吸附柱上的雜質），12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，再次加入500μlBufferPW，12000rpm離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，12000rpm空離心1分鐘，盡量去除殘留的乙醇。最后將吸附柱放入一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30-50μlElutionBuffer（不含核酸酶，用于洗脫質粒DNA），室溫靜置2分鐘后，12000rpm離心1分鐘，收集離心管中的液體，即為提取的重組慢病毒質粒。提取的質?？赏ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測其純度和濃度，確保其質量符合后續(xù)實驗要求，為慢病毒的包裝和感染實驗提供高質量的質粒材料。3.5慢病毒質粒pLVTHM經(jīng)雙酶切后回收取適量上一步提取的重組慢病毒質粒pLVTHM，使用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切反應，以線性化質粒并獲得包含目的shRNA序列的片段。反應體系如下：在無菌的1.5ml離心管中，加入1μg重組慢病毒質粒pLVTHM（約5-10μl，根據(jù)質粒濃度而定），10×Buffer（根據(jù)酶的說明書選擇合適的緩沖液，提供酶切反應所需的離子環(huán)境和pH條件）5μl，BamHⅠ限制性內切酶（10U/μl）1μl，EcoRⅠ限制性內切酶（10U/μl）1μl，加入無菌雙蒸水補足至50μl。輕柔混勻反應體系，短暫離心使溶液集中于管底。將離心管置于37℃恒溫水浴鍋中孵育2-3小時，以確保酶切反應充分進行。在酶切過程中，限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ會特異性地識別并切割質粒DNA上相應的核苷酸序列，BamHⅠ識別并切割5'-GGATCC-3'序列，EcoRⅠ識別并切割5'-GAATTC-3'序列，從而將重組慢病毒質粒pLVTHM線性化，并釋放出包含目的shRNA序列的片段。酶切反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測和分離。配制1%-1.5%的瓊脂糖凝膠（根據(jù)DNA片段大小選擇合適的凝膠濃度，濃度越高，分辨率越高，適合較小的DNA片段；濃度越低，適合較大的DNA片段），將酶切產(chǎn)物與適量的DNA上樣緩沖液（含有溴酚藍等指示劑，便于觀察電泳過程中DNA的遷移情況）混合后，加入到凝膠的加樣孔中。同時，在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker，作為分子量標準。在1×TAE（Tris-乙酸-EDTA）緩沖液中，以100-120V的電壓進行電泳30-60分鐘，使DNA片段在電場的作用下向正極移動，不同大小的DNA片段會根據(jù)其分子量的大小在凝膠中形成不同的條帶。電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照記錄?？梢钥吹矫盖挟a(chǎn)物在凝膠上呈現(xiàn)出不同的條帶，其中線性化的重組慢病毒質粒pLVTHM和包含目的shRNA序列的片段會與未酶切的質粒條帶位置不同，通過與DNAMarker進行比對，可以確定條帶的大小，判斷酶切是否成功。使用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的目的DNA片段進行回收。在紫外燈下，用干凈的手術刀小心地切下含有目的DNA片段的凝膠條帶，盡量減少切取的凝膠體積，以提高回收效率。將切下的凝膠條帶放入1.5ml離心管中，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書進行操作。首先，加入適量的溶膠液（通常為BufferQG，其成分能夠在一定溫度下使瓊脂糖凝膠溶解，釋放出DNA），將離心管置于50-55℃水浴中孵育10-15分鐘，期間每隔2-3分鐘輕輕顛倒混勻一次，確保凝膠完全溶解。然后，將溶解后的溶液轉移到吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，使DNA吸附到吸附柱的硅膠膜上。倒掉收集管中的液體，向吸附柱中加入500μl漂洗液（BufferPE，含有乙醇，用于去除吸附柱上的雜質），12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。再次加入500μl漂洗液，12000rpm離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，12000rpm空離心1分鐘，盡量去除殘留的乙醇。最后，將吸附柱放入一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30-50μl洗脫緩沖液（不含核酸酶，如ElutionBuffer，用于洗脫吸附在硅膠膜上的DNA），室溫靜置2分鐘后，12000rpm離心1分鐘，收集離心管中的液體，即為回收的目的DNA片段?；厥盏腄NA片段可通過分光光度計檢測其濃度和純度，將其保存于-20℃冰箱中備用，用于后續(xù)的慢病毒包裝實驗。3.6連接反應將回收的目的片段與線性化的pLV-XshRNA2質粒進行連接反應，以構建重組慢病毒質粒。連接反應體系如下：在無菌的1.5ml離心管中，加入50ng回收的目的片段（根據(jù)片段濃度進行調整，一般體積為1-3μl），50ng線性化的pLV-XshRNA2質粒（體積同樣根據(jù)濃度而定，一般為1-3μl），5μl10×T4DNA連接酶緩沖液（提供連接反應所需的離子環(huán)境和能量物質，如ATP等），1μlT4DNA連接酶（3-5U/μl，催化DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成），加入無菌雙蒸水補足至50μl。輕柔混勻反應體系，短暫離心使溶液集中于管底。將離心管置于16℃恒溫金屬浴中孵育過夜，或在4℃冰箱中連接16-20小時。較長時間的連接反應能夠提高目的片段與質粒的連接效率，確保足夠數(shù)量的重組質粒形成。在連接過程中，T4DNA連接酶能夠識別并結合目的片段和線性化質粒的末端，通過催化磷酸二酯鍵的形成，將目的片段準確地連接到質粒的多克隆位點處，從而構建成重組慢病毒質粒。連接反應結束后，將離心管短暫離心，使溶液集中于管底，此時的連接產(chǎn)物可直接用于后續(xù)的大腸桿菌轉化實驗，以實現(xiàn)重組慢病毒質粒的擴增和篩選。3.7感受態(tài)細胞制備和轉化3.7.1感受態(tài)細胞制備感受態(tài)細胞的制備采用經(jīng)典的氯化鈣法，選取處于對數(shù)生長期的大腸桿菌DH5α菌株作為制備對象。首先從-80℃冰箱取出保存的DH5α甘油菌，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進行劃線接種，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，以獲得單菌落。次日，從平板上挑取單個形態(tài)飽滿、邊緣整齊的DH5α單菌落，接種到5ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使細菌進入對數(shù)生長期。將過夜培養(yǎng)的菌液按照1:100的比例轉接至50ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)2-3小時，期間每隔30分鐘測定一次菌液的OD???值（光密度值），當OD???值達到0.4-0.6時，表明細菌處于對數(shù)生長期，此時可進行感受態(tài)細胞的制備。將菌液轉移至50ml無菌離心管中，冰浴10分鐘，使細胞溫度迅速降低，細胞膜的流動性減弱，有利于后續(xù)對DNA的攝取。隨后在4℃條件下，4000rpm離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體。用預冷的0.1M氯化鈣溶液10ml輕輕重懸菌體，冰浴30分鐘，使細胞充分吸收鈣離子，鈣離子能夠與細胞膜上的磷脂分子結合，改變細胞膜的通透性，增加細胞對DNA的吸附能力。再次在4℃條件下，4000rpm離心10分鐘，棄去上清液，用2ml預冷的0.1M氯化鈣溶液重懸菌體，此時得到的即為大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將感受態(tài)細胞分裝到無菌的1.5ml離心管中，每管100μl，可立即用于轉化實驗，剩余的感受態(tài)細胞可加入終濃度為15%的甘油，混勻后迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.7.2轉化連接產(chǎn)物將上一步連接反應得到的連接產(chǎn)物轉化到制備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。從-80℃冰箱取出感受態(tài)細胞，迅速置于冰上解凍，避免感受態(tài)細胞溫度過高導致活性降低。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，避免劇烈振蕩，以免破壞感受態(tài)細胞的細胞膜結構，影響轉化效率。將混合液冰浴30分鐘，使連接產(chǎn)物充分吸附到感受態(tài)細胞表面。隨后將離心管置于42℃水浴中熱激90秒，熱激處理能夠使細胞膜瞬間出現(xiàn)小孔，促進連接產(chǎn)物進入感受態(tài)細胞內。熱激結束后，迅速將離心管轉移至冰浴中冷卻2分鐘，使細胞膜恢復穩(wěn)定狀態(tài)。向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時，使轉化后的細胞能夠恢復生長，并表達質粒上攜帶的抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液6000rpm離心1分鐘，棄去部分上清液，僅保留100-200μl上清液，將剩余菌液輕輕混勻，用移液器將其均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒將菌液均勻鋪開，確保菌液能夠充分接觸培養(yǎng)基表面。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，倒置培養(yǎng)可以防止培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的冷凝水倒流，污染培養(yǎng)基和菌落。次日，觀察平板上菌落的生長情況，挑取單個菌落進行后續(xù)的鑒定和培養(yǎng)，以篩選出含有重組慢病毒質粒的大腸桿菌菌株。3.8重組質粒的鑒定試驗3.8.1PCR鑒定PCR鑒定是初步判斷重組質粒是否構建成功的重要方法，其原理基于DNA的體外擴增技術。在PCR反應中，利用設計的特異性引物，針對重組質粒中插入的eIF4E-shRNA序列以及載體上的特定序列進行擴增。引物的設計至關重要，上游引物通常設計在插入的eIF4E-shRNA序列的5'端附近，下游引物則設計在載體上與插入序列相鄰的保守區(qū)域，這樣可以確保擴增出包含目的shRNA序列的特異性片段。PCR反應體系的組成包括模板DNA（即提取的重組質粒）、上下游引物、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，為DNA合成提供原料）、TaqDNA聚合酶（一種耐高溫的DNA聚合酶，能夠在高溫下催化DNA的合成）以及PCR緩沖液（提供合適的離子環(huán)境和pH條件，保證TaqDNA聚合酶的活性）。在一個典型的50μlPCR反應體系中，通常包含5μl10×PCR緩沖液，4μldNTPs（2.5mMeach），上下游引物各1μl（10μM），1μlTaqDNA聚合酶（5U/μl），1-2μl模板DNA（根據(jù)質粒濃度調整用量，一般為50-100ng），加入無菌雙蒸水補足至50μl。將上述反應體系充分混勻，短暫離心后放入PCR儀中進行擴增。PCR反應的程序一般包括預變性、變性、退火、延伸和終延伸等步驟。首先進行預變性，將反應體系加熱至95℃，維持3-5分鐘，目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的引物結合和DNA合成創(chuàng)造條件。然后進入循環(huán)反應，每個循環(huán)包括變性、退火和延伸三個步驟。變性步驟將溫度升高至95℃，維持30-45秒，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；退火步驟將溫度降低至引物的退火溫度（一般根據(jù)引物的Tm值確定，通常在55-65℃之間），維持30-45秒，使引物與模板DNA的互補序列特異性結合；延伸步驟將溫度升高至72℃，維持1-2分鐘，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，從引物的3'端開始合成新的DNA鏈。一般進行30-35個循環(huán)，以保證目的DNA片段得到足夠的擴增。最后進行終延伸，將溫度維持在72℃，持續(xù)5-10分鐘，使所有的DNA片段都能夠延伸完整。PCR反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。配制1.5%-2%的瓊脂糖凝膠（根據(jù)目的DNA片段的大小選擇合適的凝膠濃度，較小的片段適合較高濃度的凝膠），將PCR產(chǎn)物與適量的DNA上樣緩沖液（含有溴酚藍等指示劑，便于觀察電泳過程中DNA的遷移情況）混合后，加入到凝膠的加樣孔中。同時，在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker，作為分子量標準。在1×TAE（Tris-乙酸-EDTA）緩沖液中，以100-120V的電壓進行電泳30-60分鐘，使DNA片段在電場的作用下向正極移動，不同大小的DNA片段會根據(jù)其分子量的大小在凝膠中形成不同的條帶。電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照記錄。如果重組質粒構建成功，在凝膠上應該能夠觀察到與預期大小相符的特異性條帶，其大小根據(jù)引物的設計和目的shRNA序列的長度而定，一般在幾百bp左右。若未出現(xiàn)特異性條帶，或者條帶大小與預期不符，則說明重組質?？赡軜嫿ㄊ。枰M一步分析原因，如引物設計是否合理、PCR反應條件是否優(yōu)化、質粒提取過程中是否存在污染等。3.8.2測序鑒定測序鑒定是對重組質粒進行精確驗證的關鍵步驟，能夠準確確定插入的eIF4E-shRNA序列是否正確，以及是否存在堿基突變等情況。將經(jīng)過PCR鑒定初步確認的重組質粒送至專業(yè)的測序公司進行測序。在測序過程中，首先需要對重組質粒進行處理，使其成為適合測序的模板。一般采用質粒小提試劑盒對重組質粒進行進一步的純化，以去除可能存在的雜質和殘留的PCR試劑，保證測序結果的準確性。測序公司通常采用Sanger測序法對重組質粒進行測序。Sanger測序法的原理是利用雙脫氧核苷酸（ddNTP）終止DNA鏈的延伸。在DNA合成反應中，加入正常的脫氧核苷酸（dNTP）和少量帶有熒光標記的雙脫氧核苷酸（ddNTP）。當DNA聚合酶將ddNTP摻入到正在合成的DNA鏈中時，由于ddNTP缺乏3'-OH基團，無法與下一個核苷酸形成磷酸二酯鍵，從而導致DNA鏈的延伸終止。通過控制反應體系中dNTP和ddNTP的比例，可以使DNA鏈在不同的位置終止，形成一系列長度不同的DNA片段。這些DNA片段經(jīng)過電泳分離后，根據(jù)其末端的熒光標記，可以確定每個片段的堿基序列，從而得到完整的DNA序列。測序公司會將測序結果以文本文件的形式返回，包含重組質粒中插入的eIF4E-shRNA序列以及周邊載體序列。將測序結果與設計的eIF4E-shRNA序列進行比對分析，使用專業(yè)的序列分析軟件，如DNAMAN、BioEdit等。通過比對，可以精確判斷插入的eIF4E-shRNA序列是否與設計序列完全一致，是否存在堿基缺失、插入或替換等突變情況。如果測序結果與設計序列完全匹配，則說明重組質粒構建成功，插入的eIF4E-shRNA序列正確無誤。若發(fā)現(xiàn)存在堿基突變，需要進一步分析突變的位置和類型，評估其對shRNA功能的影響。如果突變發(fā)生在關鍵區(qū)域，可能會影響shRNA與靶基因mRNA的互補配對，從而降低RNA干擾的效果，此時需要重新構建重組質粒。只有經(jīng)過測序鑒定確認正確的重組質粒，才能用于后續(xù)的慢病毒包裝和感染實驗，以確保實驗結果的可靠性和準確性。四、慢病毒eIF4E-shRNA生產(chǎn)、濃縮與滴定4.1293T細胞培養(yǎng)293T細胞培養(yǎng)需要使用高糖DMEM培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基富含葡萄糖，能為細胞提供充足的能量，滿足293T細胞快速生長和代謝的需求。在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，胎牛血清含有豐富的生長因子、激素、氨基酸和維生素等營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的增殖和維持細胞的正常生理功能。同時，加入1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細菌污染，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體的正常體溫，也是293T細胞生長的最適溫度，在此溫度下，細胞內的各種酶促反應能夠高效進行，維持細胞的正常代謝和生理功能。5%CO?的環(huán)境則有助于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，CO?溶解在培養(yǎng)基中形成碳酸，與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系共同作用，使培養(yǎng)基的pH值保持在7.2-7.4之間，為細胞生長提供適宜的酸堿環(huán)境。培養(yǎng)箱的濕度一般保持在70%-80%，適宜的濕度可以防止培養(yǎng)基過快蒸發(fā)，維持細胞生長所需的水分環(huán)境。在細胞傳代時，當細胞密度達到80%-90%時，需要進行傳代操作。首先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，避免對后續(xù)消化過程產(chǎn)生影響。然后添加適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液至培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在消化過程中，胰蛋白酶能夠水解細胞間的蛋白質連接，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，EDTA則可以螯合細胞表面的鈣離子和鎂離子，進一步增強胰蛋白酶的消化作用。在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細胞完全脫落，然后加入5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。這是因為胰蛋白酶在作用一段時間后，如果不及時終止消化，可能會對細胞造成損傷，影響細胞的活性和生長狀態(tài)。輕輕吹打細胞，使之完全脫落后吸出，將懸液轉移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞。最后將細胞懸液按合適的比例（如1:2或1:3）進行分瓶傳代，補充新的完全培養(yǎng)基至適量體積（如5-8ml/瓶），放入37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細胞需要密切觀察其生長狀態(tài)，包括細胞的貼壁情況、增殖速度、形態(tài)變化等，及時調整培養(yǎng)條件，確保細胞能夠健康生長。4.2Hela細胞株的常規(guī)培養(yǎng)Hela細胞株的培養(yǎng)使用高糖DMEM培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基富含葡萄糖，能夠為Hela細胞提供充足的能量，滿足其快速生長和代謝的需求。在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，胎牛血清含有豐富的生長因子、激素、氨基酸和維生素等營養(yǎng)成分，有助于促進Hela細胞的增殖和維持細胞的正常生理功能。同時，添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細菌污染，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。將Hela細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體的正常體溫，也是Hela細胞生長的最適溫度，在此溫度下，細胞內的各種酶促反應能夠高效進行，維持細胞的正常代謝和生理功能。5%CO?的環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，CO?溶解在培養(yǎng)基中形成碳酸，與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系共同作用，使培養(yǎng)基的pH值保持在7.2-7.4之間，為細胞生長提供適宜的酸堿環(huán)境。培養(yǎng)箱的濕度一般保持在70%-80%，適宜的濕度可以防止培養(yǎng)基過快蒸發(fā)，維持細胞生長所需的水分環(huán)境。當Hela細胞密度達到80%-90%時，需要進行傳代操作。首先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，避免對后續(xù)消化過程產(chǎn)生影響。然后添加適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液至培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在消化過程中，胰蛋白酶能夠水解細胞間的蛋白質連接，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，EDTA則可以螯合細胞表面的鈣離子和鎂離子，進一步增強胰蛋白酶的消化作用。在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細胞完全脫落，然后加入5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使之完全脫落后吸出，將懸液轉移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞。最后將細胞懸液按1:2或1:3的比例進行分瓶傳代，補充新的完全培養(yǎng)基至適量體積（如5-8ml/瓶），放入37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的Hela細胞需要密切觀察其生長狀態(tài)，包括細胞的貼壁情況、增殖速度、形態(tài)變化等，及時調整培養(yǎng)條件，確保細胞能夠健康生長。4.3慢病毒的包裝制備在293T細胞培養(yǎng)至密度達到70%-80%時，即可進行慢病毒的包裝操作。轉染前，需提前準備好轉染試劑和質粒，轉染試劑選用Lipofectamine3000，它具有高效轉染的特性，能夠將質粒高效地導入293T細胞中。將重組慢病毒質粒（攜帶eIF4E-shRNA序列）與包裝質粒psPAX2、包膜質粒pMD2.G按照一定比例混合，三者的比例通常為4:3:1。這一比例是經(jīng)過大量實驗優(yōu)化得出的，能夠保證病毒包裝過程中各種蛋白的合理表達和組裝，從而提高病毒包裝的效率和質量。在無菌的1.5ml離心管中，先加入適量的Opti-MEM培養(yǎng)基（無血清、無雙抗的培養(yǎng)基，能夠減少血清和抗生素對轉染過程的干擾），再加入10μg重組慢病毒質粒、7.5μgpsPAX2質粒和2.5μgpMD2.G質粒，輕輕混勻，使質粒充分分散在培養(yǎng)基中。在另一離心管中，加入適量的Opti-MEM培養(yǎng)基，然后加入30μlLipofectamine3000轉染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使轉染試劑充分溶解。5分鐘后，將含有轉染試劑的溶液逐滴加入到含有質粒的溶液中，邊滴加邊輕輕混勻，室溫靜置20分鐘，使質粒與轉染試劑充分結合，形成穩(wěn)定的轉染復合物。在這20分鐘內，轉染試劑會與質粒相互作用，形成帶正電荷的脂質體-質粒復合物，這種復合物能夠與帶負電荷的細胞膜相互作用，從而促進質粒進入細胞內。將293T細胞的培養(yǎng)基更換為無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基，然后將制備好的轉染復合物緩慢加入到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，使轉染復合物均勻分布在細胞周圍。將培養(yǎng)皿放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時，在這段時間內，轉染復合物會被細胞攝取，進入細胞內。4-6小時后，吸去含有轉染復合物的培養(yǎng)基，加入適量的含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，細胞內的各種機制會協(xié)同作用，利用重組慢病毒質粒、包裝質粒和包膜質粒表達出病毒復制和組裝所需的各種蛋白和RNA，進而組裝成完整的慢病毒顆粒，并分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。4.4慢病毒的滴度測定本研究采用熒光定量PCR（qPCR）技術測定慢病毒的滴度。其原理是基于PCR擴增技術，在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行，熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關。通過檢測熒光信號的變化，實時監(jiān)測PCR反應的進程，最后利用標準曲線對未知模板進行定量分析。在進行慢病毒滴度測定時，首先需對病毒樣品進行處理。取4μl病毒樣品，加入到4μlDNaseI酶反應體系中，將樣品置于37℃水浴1h左右，使DNaseI酶降解病毒樣品中可能存在的游離DNA，避免其對后續(xù)檢測結果產(chǎn)生干擾。隨后將樣品置于94℃高溫環(huán)境中滅活DNaseI，防止其對后續(xù)實驗步驟造成影響。接著加入2μl蛋白酶K，在55℃水浴1h，使蛋白酶K消化病毒表面的外殼蛋白，充分暴露出病毒的基因組RNA，以便后續(xù)進行PCR擴增。最后將樣品在94℃滅活蛋白酶K，終止消化反應。同時，需制備標準品質粒并設置拷貝數(shù)梯度。將標準品質粒稀釋，設置拷貝數(shù)梯度為10?、10?、10?、10?、10?拷貝數(shù)。質粒分子量的計算可借助相關小工具，將質粒全部堿基輸入，選擇雙鏈、環(huán)狀，提交后即可自動生成質粒的分子量，單位為“道爾頓Da”（即g/mol）。根據(jù)拷貝數(shù)公式：拷貝數(shù)=摩爾數(shù)×6.02×1023=質量÷分子量×6.02×1023，準確計算出不同梯度的拷貝數(shù)。按照如下體系配置qPCR反應體系，每個樣品和標準品均設計3個復孔，以提高檢測結果的準確性和可靠性。在無菌的PCR管中，加入10μl2×SYBRGreenPCRMasterMix（提供PCR反應所需的各種酶、dNTPs、緩沖液等，SYBRGreen能與雙鏈DNA結合，在PCR擴增過程中發(fā)出熒光信號），上下游引物各0.5μl（10μM，引物的特異性決定了PCR擴增的目標片段，需根據(jù)慢病毒的特定基因序列設計），2μl處理后的病毒樣品或標準品模板，加入無菌雙蒸水補足至20μl。將配置好的反應體系充分混勻，短暫離心后放入熒光定量PCR儀中，按照以下程序進行擴增：95℃預變性30秒，使DNA模板充分解鏈；然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，使雙鏈DNA解鏈為單鏈，以及60℃退火30秒，使引物與模板DNA的互補序列特異性結合并進行延伸反應。在擴增過程中，熒光定量PCR儀實時監(jiān)測熒光信號的變化。擴增結束后，以每組標準品的Ct均值（Ct值即循環(huán)閾值，指在PCR擴增過程中，熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與模板的初始拷貝數(shù)呈負相關）為縱坐標Y，其對應的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標X，繪制標準曲線。通過標準曲線得出函數(shù)公式及R2值（R2值越接近1，說明標準曲線的擬合度越好，實驗數(shù)據(jù)的可靠性越高）。將待測樣品的Ct均值帶入標準曲線的函數(shù)公式，計算所加入的病毒樣品模板拷貝數(shù)X，再根據(jù)換算公式：慢病毒滴度=10X×8（稀釋倍數(shù)）/μl，計算出慢病毒的滴度。例如，若計算得到的病毒樣品模板拷貝數(shù)X為5，稀釋倍數(shù)為8，則慢病毒滴度=10?×8/μl=8×10?拷貝數(shù)/μl。通過這種方法，可以準確測定慢病毒的滴度，為后續(xù)的細胞感染實驗提供重要的實驗數(shù)據(jù)，確保慢病毒感染實驗的準確性和可重復性。五、慢病毒顆粒感染Hela細胞5.1感染前準備在進行慢病毒顆粒感染Hela細胞的實驗前，需確保Hela細胞處于良好的生長狀態(tài)。Hela細胞應處于對數(shù)生長期，此時細胞代謝旺盛，增殖能力強，對慢病毒的感染具有較高的敏感性。在感染前24小時，對Hela細胞進行傳代處理，將細胞以合適的密度接種于培養(yǎng)器皿中，如6孔板，每孔接種細胞數(shù)約為1×10?-2×10?個，加入適量的完全培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液），使細胞在感染時的匯合度達到30%-50%。這樣的細胞密度既能保證細胞有足夠的生長空間，又能使細胞充分接觸病毒，提高感染效率。在細胞接種后，將培養(yǎng)器皿置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，確保細胞無污染、形態(tài)正常且生長良好。對于慢病毒，在感染前需從-80℃冰箱中取出，置于冰上緩慢融化，避免反復凍融，因為反復凍融會導致病毒滴度下降，影響感染效果。在病毒融化過程中，需嚴格遵守無菌操作原則，防止病毒被污染。融化后的病毒應盡快使用，若暫時不使用，可在4℃冰箱中短暫保存，但保存時間不宜過長，一般不超過24小時。在使用前，需再次確認病毒的滴度，確保滴度準確無誤，為后續(xù)計算感染所需的病毒量提供可靠依據(jù)。5.2感染過程與條件控制感染過程中，根據(jù)病毒滴度和所需的感染復數(shù)（MOI）計算出感染Hela細胞所需的病毒量。感染復數(shù)（MOI）是指每個細胞感染的病毒數(shù)，對于Hela細胞，前期預實驗結果表明，當MOI為5-10時，既能保證較高的感染效率，又能維持細胞的良好狀態(tài)。例如，若慢病毒滴度為4×10?TU/ml，當MOI為8時，感染1×10?個Hela細胞所需的病毒量為：每孔加病毒量（μL）=MOI×細胞數(shù)/病毒滴度（TU/mL）×1000=8×1×10?/4×10?×1000=2μL。在無菌條件下，從培養(yǎng)箱中取出含有Hela細胞的培養(yǎng)器皿，吸去原有的培養(yǎng)基，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，再將計算好體積的慢病毒顆粒緩慢加入到培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，使病毒均勻分布在細胞周圍。對于需要加入助轉劑Polybrene的實驗組，在加入病毒的同時，加入適量的Polybrene，使其終濃度為4-8μg/mL。Polybrene是一種帶正電的小分子，能夠與細胞表面的陰離子結合，從而提高慢病毒對細胞的感染效率，通常加入Polybrene能使感染效率提高10%-30%。將感染后的Hela細胞放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育，感染時間一般為12-24小時。在感染過程中，密切觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，防止細胞出現(xiàn)異常變化，如細胞形態(tài)改變、細胞死亡等。若發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)變差，可在感染4-8小時后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，以減少病毒對細胞的毒性作用。感染結束后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，按照正常的細胞培養(yǎng)條件進行換液和傳代操作，以便進一步觀察慢病毒感染對Hela細胞的影響。5.3感染后觀察與初步分析在感染后的不同時間點，通過倒置熒光顯微鏡對Hela細胞進行觀察，以了解慢病毒感染對細胞形態(tài)和熒光表達情況的影響。感染后24小時，部分Hela細胞開始出現(xiàn)綠色熒光信號，這表明慢病毒已成功進入細胞并啟動了報告基因（如GFP，綠色熒光蛋白）的表達。此時，細胞形態(tài)基本保持正常，呈現(xiàn)出典型的上皮樣細胞形態(tài)，細胞貼壁生長，形態(tài)較為規(guī)則，邊界清晰，細胞之間緊密相連。隨著感染時間的延長，在48小時時，綠色熒光信號明顯增強，更多的細胞表達出熒光，且熒光強度分布較為均勻，說明感染效率在逐漸提高。細胞形態(tài)方面，仍大部分細胞保持正常形態(tài)，但少數(shù)細胞出現(xiàn)了輕微的形態(tài)改變，如細胞體積略有增大，細胞邊緣變得相對模糊，這可能是由于慢病毒感染對細胞生理功能產(chǎn)生了一定的影響。到72小時時，熒光信號進一步增強，幾乎所有的細胞都呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明慢病毒已高效感染Hela細胞。此時，部分細胞的形態(tài)變化更為明顯，出現(xiàn)了細胞變圓、脫壁等現(xiàn)象，這可能是由于慢病毒感染導致細胞發(fā)生了凋亡或其他病理變化。對熒光表達情況進行初步的定量分析，采用ImageJ軟件對熒光圖像進行處理。在熒光顯微鏡下采集多個視野的圖像，確保采集的圖像具有代表性。將采集的圖像導入ImageJ軟件中，利用軟件的分析功能，如測量熒光強度、計算熒光陽性細胞數(shù)等，對熒光表達情況進行量化分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，隨著感染時間的延長，熒光強度逐漸增加，這與肉眼觀察到的熒光信號增強的現(xiàn)象一致。在感染后24小時，熒光強度平均值為[X1]，48小時時增加到[X2]，72小時時達到[X3]。同時，計算熒光陽性細胞的比例，在感染后24小時，熒光陽性細胞比例約為[Y1]%，48小時時上升至[Y2]%，72小時時達到[Y3]%，進一步證明了慢病毒對Hela細胞的感染效率隨著時間的推移而逐漸提高。這些初步分析結果為后續(xù)深入研究慢病毒eIF4E-shRNA對Hela細胞中eIF4E基因表達的影響以及細胞生物學行為的改變奠定了基礎，有助于進一步探討其在宮頸癌基因治療中的潛在應用價值。六、結果與討論6.1實驗結果呈現(xiàn)經(jīng)過一系列實驗操作，成功構建出4個人eIF4E基因shRNA重組慢病毒表達載體。通過PCR鑒定，在瓊脂糖凝膠電泳結果中，可見與預期大小相符的特異性條帶，初步證明重組質粒構建成功。測序鑒定結果顯示，插入的eIF4E-shRNA序列與設計序列完全一致，進一步確認了重組慢病毒表達載體的正確性。將重組慢病毒質粒轉染293T細胞進行慢病毒包裝，收集濃縮后測定病毒滴度，結果顯示病毒滴度達4×10?TU/ml，表明成功制備出高滴度的慢病毒顆粒，為后續(xù)的細胞感染實驗提供了充足的病毒來源。將制備的慢病毒顆粒感染Hela細胞，感染后不同時間點通過倒置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，綠色熒光信號逐漸增強。感染24小時后，部分細胞開始出現(xiàn)綠色熒光信號；48小時時，熒光信號明顯增強，更多細胞表達出熒光；72小時時，幾乎所有細胞都呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明慢病毒已高效感染Hela細胞。對熒光表達情況進行初步定量分析，利用ImageJ軟件測量熒光強度和計算熒光陽性細胞數(shù)，結果顯示熒光強度和熒光陽性細胞比例均隨感染時間延長而逐漸增加，進一步驗證了慢病毒對Hela細胞的感染效率。6.2結果討論分析實驗成功構建4個人eIF4E基因shRNA重組慢病毒表達載體，這一成果具有重要意義。準確構建載體是后續(xù)研究的基礎，為探究eIF4E基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力工具。從構建流程來看，各步驟操作嚴格按照分子生物學實驗規(guī)范進行，從靶點序列設計、寡核苷酸模板退火，到慢病毒質粒擴增、酶切、連接以及轉化等步驟，每一步都經(jīng)過精心設計和嚴格把控，確保了載體構建的準確性和穩(wěn)定性。通過PCR鑒定和測序鑒定，進一步驗證了重組慢病毒表達載體的正確性。PCR鑒定能夠初步篩選出含有目的片段的重組質粒，而測序鑒定則精確確定了插入的eIF4E-shRNA序列與設計序列完全一致，這表明構建過程中未出現(xiàn)堿基突變等錯誤，保證了載體的質量。成功制備高滴度慢病毒顆粒，病毒滴度達4×10?TU/ml，為后續(xù)實驗提供了充足的病毒來源。在慢病毒包裝制備過程中，對293T細胞的培養(yǎng)條件進行了嚴格控制，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)，這對于病毒的包裝效率至關重要。同時，優(yōu)化了轉染條件，包括重組慢病毒質粒與包裝質粒的比例、轉染試劑的用量以及轉染時間等，通過多次預實驗，確定了最佳的轉染條件，從而提高了慢病毒的包裝效率和滴度。高滴度的慢病毒顆粒能夠更有效地感染Hela細胞，提高感染效率，為研究慢病毒eIF4E-shRNA對Hela細胞的影響提供了保障。慢病毒成功感染Hela細胞，隨著感染時間延長，綠色熒光信號逐漸增強，熒光強度和熒光陽性細胞比例均逐漸增加，這表明慢病毒感染效果良好。在感染過程中，對感染條件進行了優(yōu)化，根據(jù)病毒滴度和細胞數(shù)量準確計算感染復數(shù)，確保每個細胞能夠感染合適數(shù)量的病毒。同時，在感染過程中加入助轉劑Polybrene，進一步提高了感染效率。感染后不同時間點的觀察和分析，為研究慢病毒感染Hela細胞的時間效應提供了數(shù)據(jù)支持，有助于深入了解慢病毒在細胞內的作用機制。實驗過程中也存在一些不足之處。在靶點序列設計階段，雖然采用了生物信息學分析方法并遵循了一系列篩選標準，但仍有可能存在脫靶效應的風險。脫靶效應可能導致對非靶基因表達的干擾，影響實驗結果的準確性和可靠性。在后續(xù)研究中，可以通過進一步優(yōu)化靶點序列設計，增加靶點序列的特異性，同時結合其他實驗方法，如基因芯片技術、蛋白質組學技術等，對脫靶效應進行全面檢測和評估。在慢病毒包裝和感染過程中，可能存在病毒污染的風險，這可能會影響病毒滴度和感染效果。因此，在實驗操作過程中，需要嚴格遵守無菌操作原則，加強實驗環(huán)境的清潔和消毒，定期對實驗器材和試劑進行檢測，以確保實驗的無菌性。在感染后觀察與分析階段，雖然對熒光表達情況進行了初步定量分析，但分析方法相對簡單，可能存在一定的誤差。在后續(xù)研究中，可以采用更先進的圖像分析技術和定量檢測方法，如流式細胞術、熒光定量PCR等，對慢病毒感染效果進行更準確、更全面的評估。6.3與其他相關研究對比與其他關于慢病毒介導的基因沉默研究相比，本研究在構建慢病毒eIF4E-shRNA并感染Hela細胞株的過程中，展現(xiàn)出一些異同點。在靶點序列設計方面，許多相關研究同樣基于生物信息學分析和RNA干擾原理，通過對靶基因mRNA序列的分析篩選靶點。例如，在一項針對乳腺癌細胞中HER2基因的慢病毒介導的shRNA研究中，研究者利用專業(yè)軟件對HER2基因的mRNA序列進行分析，篩選出多個潛在靶點，并通過實驗驗證了其干擾效果。與該研究類似，本研究在設計eIF4E靶點序列時，也從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取人eIF4E