慢病毒載體介導CXCR7shRNA：重塑結腸癌生物學行為的基因密碼一、引言1.1研究背景與意義結腸癌作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中位居前列，給患者家庭和社會帶來沉重負擔。隨著對腫瘤研究的深入，趨化因子受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關注。趨化因子是一類具有趨化活性的小分子細胞因子超家族，通過與相應受體結合，參與多種生理和病理過程，在腫瘤領域，其對腫瘤細胞的增殖、存活、血管生成、轉(zhuǎn)移和腫瘤微環(huán)境的塑造有著廣泛影響。在趨化因子受體研究中，基質(zhì)衍生因子1（SDF-1，也稱為CXCL12）及其受體CXCR4和CXCR7構成的信號軸備受矚目。其中，CXCR7作為CXCL12的另一重要受體，與CXCL12具有高親和力。已有研究表明，CXCR7在多種腫瘤組織中普遍表達，并在促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮關鍵作用。在乳腺癌研究中，導入CXCR7序列可使乳腺癌細胞MDA-MB435s體內(nèi)成瘤性顯著提高，而使用CXCR7siRNA或小分子拮抗劑則能顯著降低乳腺癌細胞4T1的體內(nèi)成瘤性并抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，這些研究揭示了CXCR7在腫瘤進展中的重要調(diào)控作用。然而，目前關于CXCR7在結腸癌方面的研究相對較少，其在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體機制尚不明確。已有研究初步發(fā)現(xiàn)CXCR7在結腸癌組織中存在上調(diào)表達，且表達量隨淋巴結轉(zhuǎn)移增加，但對于其如何影響結腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學行為，以及在結腸癌發(fā)生發(fā)展的各個階段扮演何種角色，仍有待深入探索。填補這一研究空白，對于全面理解結腸癌的發(fā)病機制具有重要意義。從治療角度看，傳統(tǒng)結腸癌治療方法如手術、化療和放療雖在一定程度上取得成效，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及對正常組織的損傷等問題。以CXCR7為靶點的基因治療為結腸癌治療開辟了新方向。RNA干擾（RNAi）技術的出現(xiàn)和發(fā)展，為實現(xiàn)這一靶向治療提供了有力工具。通過設計針對CXCR7基因的小分子干擾RNA（siRNA），構建慢病毒載體介導的CXCR7shRNA表達載體，能夠特異性地沉默CXCR7基因的表達，從而阻斷CXCR7相關信號通路，抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為。深入研究慢病毒載體介導的CXCR7shRNA對結腸癌生物學行為的影響，有助于明確CXCR7作為結腸癌治療靶點的可行性和有效性，為開發(fā)新型、高效、低毒的結腸癌治療策略提供理論依據(jù)和實驗基礎，具有重要的臨床應用價值和社會意義，有望改善結腸癌患者的預后，提高其生活質(zhì)量。1.2研究目的和假設本研究旨在通過慢病毒載體介導的CXCR7shRNA，深入探究其對結腸癌細胞生物學行為的影響，包括細胞增殖、遷移、侵襲等關鍵過程，并進一步明確其在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為以CXCR7為靶點的結腸癌基因治療提供堅實的理論依據(jù)和實驗基礎?；谇捌谘芯考跋嚓P文獻報道，本研究提出以下假設：抑制CXCR7基因的表達能夠有效阻斷CXCL12-CXCR7信號通路，進而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，最終抑制結腸癌的進展。通過后續(xù)實驗，將對這一假設進行驗證和深入研究，為揭示結腸癌發(fā)病機制及開發(fā)新的治療策略提供關鍵線索。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對CXCR7與腫瘤關系的研究起步較早且較為深入。在乳腺癌領域，諸多研究已清晰揭示CXCR7的關鍵作用。有研究通過導入CXCR7序列，顯著提升了乳腺癌細胞MDA-MB435s的體內(nèi)成瘤性，而運用CXCR7siRNA或小分子拮抗劑時，能有效降低乳腺癌細胞4T1的體內(nèi)成瘤性，有力地抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在肺癌研究中，同樣觀察到CXCR7對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的促進作用。這些研究成果表明，CXCR7在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，為腫瘤研究提供了關鍵的理論依據(jù)。在國內(nèi)，關于CXCR7在腫瘤中的研究也取得了一定進展。有研究發(fā)現(xiàn)CXCR7在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移以及預后密切相關。在結直腸癌研究方面，國內(nèi)學者通過實驗發(fā)現(xiàn)CXCR7在結直腸癌組織中的表達上調(diào)，且其表達量與淋巴結轉(zhuǎn)移相關，這為深入探究CXCR7在結直腸癌中的作用機制提供了重要線索。慢病毒載體作為一種高效的基因傳遞工具，在國內(nèi)外的基因治療研究中得到了廣泛應用。國外研究利用慢病毒載體成功將目的基因?qū)攵喾N細胞類型，包括腫瘤細胞，為腫瘤基因治療的臨床前研究奠定了堅實基礎。在國內(nèi)，慢病毒載體介導的基因治療研究也蓬勃發(fā)展，針對多種疾病，如遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤等，開展了大量的基礎和應用研究，為疾病治療開辟了新的途徑。RNA干擾技術作為基因功能研究和基因治療的重要手段，在國內(nèi)外的腫瘤研究中都備受關注。國外研究運用RNA干擾技術，成功抑制了多種腫瘤相關基因的表達，有效抑制腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲，展現(xiàn)出良好的治療效果。國內(nèi)在RNA干擾技術應用于腫瘤治療的研究中也取得了顯著成果，針對不同腫瘤靶點設計的siRNA或shRNA，在細胞實驗和動物實驗中都表現(xiàn)出對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為腫瘤的靶向治療提供了新的策略。盡管國內(nèi)外在CXCR7與腫瘤、慢病毒載體應用及RNA干擾技術在腫瘤研究方面取得了上述成果，但目前關于CXCR7在結腸癌中的研究仍存在不足。一方面，對CXCR7在結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子機制研究不夠深入，尤其是CXCR7與其他信號通路之間的相互作用關系尚不明確。另一方面，雖然已有研究表明慢病毒載體介導的CXCR7shRNA對結腸癌有一定抑制作用，但在如何提高基因傳遞效率、增強治療效果以及降低潛在副作用等方面，仍有待進一步探索和優(yōu)化。本研究旨在針對這些不足，深入探究慢病毒載體介導的CXCR7shRNA對結腸癌生物學行為的影響，為結腸癌的治療提供更具針對性和有效性的理論依據(jù)和治療策略。二、CXCR7與結腸癌相關性基礎理論2.1CXCR7的結構與功能CXCR7，全稱CXC趨化因子受體7，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，由362個氨基酸序列組成，基因定位于人類染色體2q37。其具有典型的趨化因子受體結構特征，包含7個跨膜結構域、3個細胞外環(huán)和3個細胞內(nèi)環(huán)，N-末端在胞外，C-末端在胞質(zhì)內(nèi)。N端的氨基酸序列在與配體結合及信號傳導起始過程中發(fā)揮關鍵作用，而C端則參與細胞內(nèi)信號的進一步傳遞和調(diào)控，同時，CXCR7還具有多個磷酸化位點和糖基化位點，這些修飾對于受體的穩(wěn)定性、定位和功能調(diào)節(jié)具有重要作用。在生理功能方面，CXCR7在胚胎發(fā)育過程中扮演著不可或缺的角色。它參與引導神經(jīng)嵴細胞、造血干細胞等多種細胞的遷移和歸巢，為器官形成和組織發(fā)育奠定基礎。在成年個體中，CXCR7依然活躍，參與淋巴細胞、內(nèi)皮細胞等的遷移，在炎癥反應、組織修復和免疫監(jiān)視等過程中發(fā)揮作用。在炎癥反應時，它能引導免疫細胞向炎癥部位聚集，增強免疫防御；在組織修復過程中，有助于促進相關細胞的遷移和增殖，加速受損組織的修復。在血管生成方面，CXCR7通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，促進血管生成。腫瘤細胞可分泌CXCL12等趨化因子，激活腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細胞上的CXCR7，促使內(nèi)皮細胞增殖、遷移并形成新的血管，為腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CXCR7參與神經(jīng)元的遷移、分化和軸突導向，對大腦的正常發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡的形成至關重要，并且在神經(jīng)可塑性、學習和記憶等方面發(fā)揮作用，還與一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等的病理過程相關。在腫瘤領域，CXCR7與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關。在多種腫瘤細胞中，如乳腺癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌等，CXCR7呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。在乳腺癌中，導入CXCR7序列可顯著提高乳腺癌細胞MDA-MB435s的體內(nèi)成瘤性，而使用CXCR7siRNA或小分子拮抗劑則能有效降低乳腺癌細胞4T1的體內(nèi)成瘤性，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)，CXCR7高表達的肺癌細胞其增殖、遷移和侵襲能力更強。這表明CXCR7通過促進腫瘤細胞的增殖、存活、遷移和侵襲，以及調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和免疫逃逸，在腫瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮著關鍵作用。對于其具體作用機制，一方面，CXCR7與配體CXCL12結合后，可激活下游多條信號通路，如PI3K-Akt、MAPK等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活；另一方面，通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能和分布，幫助腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視和攻擊，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。2.2結腸癌的發(fā)病機制與生物學行為結腸癌的發(fā)病機制是一個復雜且多因素交織的過程，涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等多個方面，這些因素相互作用，共同推動了腫瘤細胞從正常結腸黏膜上皮細胞逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袗盒陨飳W行為的癌細胞。遺傳因素在結腸癌發(fā)病中占據(jù)重要地位。家族性腺瘤性息肉?。‵AP）和遺傳性非息肉病性結直腸癌（HNPCC）等遺傳性疾病，顯著增加了個體患結腸癌的風險。在FAP患者中，由于APC基因的胚系突變，導致腸道內(nèi)出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，這些息肉若未及時處理，幾乎100%會發(fā)展為結腸癌。HNPCC則主要由錯配修復基因（如MLH1、MSH2等）的突變引起，使得細胞在DNA復制過程中無法有效修復錯配堿基，導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定，進而引發(fā)腫瘤相關基因的突變，促進結腸癌的發(fā)生。除了這些明確的遺傳性綜合征外，一些散發(fā)性結腸癌也與遺傳因素相關，約20%-30%的散發(fā)性結腸癌患者存在家族聚集現(xiàn)象，可能涉及多個易感基因的多態(tài)性，這些基因的微小變異雖不直接導致疾病，但會增加個體對結腸癌的易感性。環(huán)境因素同樣是結腸癌發(fā)病的關鍵誘因。長期的高脂、高膽固醇、高鹽、高蛋白、低纖維飲食是重要的危險因素。高脂飲食會增加腸道中膽汁酸的分泌，膽汁酸在腸道細菌的作用下，可轉(zhuǎn)化為具有致癌性的次級膽汁酸，如脫氧膽酸和石膽酸，這些物質(zhì)能夠損傷結腸黏膜上皮細胞的DNA，誘導基因突變，促進腫瘤發(fā)生。低纖維飲食會導致腸道蠕動減慢，使食物殘渣在腸道內(nèi)停留時間延長，增加了致癌物質(zhì)與腸道黏膜的接觸時間，同時，膳食纖維的缺乏還會影響腸道菌群的平衡，不利于維持腸道的正常生理功能。吸煙和飲酒等不良生活方式也與結腸癌的發(fā)生密切相關。吸煙會使人體暴露于多種致癌物質(zhì)中，如多環(huán)芳烴、亞硝胺等，這些物質(zhì)可通過血液循環(huán)到達腸道，直接或間接損傷腸道細胞的DNA，引發(fā)基因突變。酒精在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的乙醛具有細胞毒性和遺傳毒性，可干擾細胞的正常代謝過程，破壞DNA的穩(wěn)定性，促進結腸癌的發(fā)展。肥胖也是結腸癌的重要危險因素之一，肥胖者體內(nèi)脂肪組織分泌的多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素等，會影響胰島素抵抗和炎癥反應，進而促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。在結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞呈現(xiàn)出一系列獨特的生物學行為，對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預后產(chǎn)生關鍵影響。腫瘤細胞的增殖能力異常增強，這是結腸癌發(fā)展的基礎。腫瘤細胞通過激活多條細胞增殖信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR信號通路，促使細胞周期進程加速，細胞不斷分裂增殖。在Ras-Raf-MEK-ERK信號通路中，當細胞表面受體接收到生長因子等刺激信號后，Ras蛋白被激活，進而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，ERK進入細胞核后，可調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖相關基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等，促進細胞從G1期進入S期，完成DNA復制和細胞分裂。PI3K-Akt-mTOR信號通路則通過調(diào)節(jié)細胞的代謝、蛋白質(zhì)合成和存活，促進腫瘤細胞的增殖。Akt被激活后，可抑制細胞凋亡相關蛋白，如Bad、FoxO等，同時激活mTOR，mTOR可促進蛋白質(zhì)合成相關因子的活性，為細胞增殖提供物質(zhì)基礎。遷移和侵襲能力是腫瘤細胞突破局部組織限制，向周圍組織和遠處器官擴散的關鍵能力。腫瘤細胞通過調(diào)節(jié)細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附分子表達，如E-cadherin、N-cadherin和整合素等，改變細胞的黏附特性，使其能夠脫離原發(fā)部位，向周圍組織浸潤。E-cadherin是一種重要的上皮細胞黏附分子，在正常結腸上皮細胞中高表達，維持細胞間的緊密連接。而在結腸癌發(fā)生過程中，E-cadherin的表達常常下調(diào)，導致細胞間黏附力下降，腫瘤細胞易于分散和遷移。相反，N-cadherin在腫瘤細胞中表達上調(diào)，促進腫瘤細胞與間質(zhì)細胞的黏附，有利于腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞還會分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）等，降解細胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。MMPs能夠降解膠原蛋白、層粘連蛋白等細胞外基質(zhì)成分，使腫瘤細胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管。uPA則可激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶不僅能夠降解細胞外基質(zhì)，還能激活其他蛋白酶，進一步促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是結腸癌患者預后不良的主要原因，腫瘤細胞通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，轉(zhuǎn)移到遠處器官，如肝臟、肺、骨等。腫瘤細胞進入血液循環(huán)后，需要逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，同時在遠處器官的微環(huán)境中存活、增殖并形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細胞通過表達一些免疫抑制分子，如程序性死亡配體1（PD-L1）等，抑制免疫細胞的活性，逃避免疫攻擊。腫瘤細胞還會與血小板、內(nèi)皮細胞等相互作用，形成微血栓，保護腫瘤細胞免受血流的沖刷和免疫細胞的殺傷。到達遠處器官后，腫瘤細胞會感知并適應新的微環(huán)境，利用微環(huán)境中的生長因子、細胞外基質(zhì)等成分，啟動增殖和轉(zhuǎn)移相關信號通路，形成轉(zhuǎn)移灶。在肝臟轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞會與肝臟中的Kupffer細胞、星狀細胞等相互作用，改變肝臟微環(huán)境，促進腫瘤細胞的存活和增殖。2.3CXCR7在結腸癌中的潛在作用機制CXCR7在結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用，其潛在作用機制主要通過CXCL12/CXCR7軸以及與其他信號通路的交互作用來實現(xiàn)。CXCL12作為CXCR7的主要配體，二者結合后形成的CXCL12/CXCR7軸在結腸癌的多個關鍵生物學過程中扮演重要角色。在腫瘤細胞增殖方面，該信號軸通過激活下游的PI3K-Akt信號通路發(fā)揮促進作用。當CXCL12與CXCR7結合后，可促使PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基與受體復合物相互作用，進而激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活Akt蛋白。激活后的Akt可以通過多種途徑促進腫瘤細胞增殖，例如抑制細胞凋亡相關蛋白Bad的活性，使其無法發(fā)揮促凋亡作用，從而增加腫瘤細胞的存活數(shù)量；Akt還能激活mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白），mTOR是細胞生長和增殖的關鍵調(diào)節(jié)因子，它可以促進蛋白質(zhì)合成相關因子的活性，如S6K1和4E-BP1，為細胞增殖提供物質(zhì)基礎，加速腫瘤細胞的分裂和生長。在腫瘤細胞遷移和侵襲過程中，CXCL12/CXCR7軸同樣起著關鍵調(diào)控作用。該信號軸通過激活Rho家族小GTP酶，如Rac1和Cdc42，來調(diào)節(jié)細胞骨架的重排，從而影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。當CXCL12與CXCR7結合后，可激活鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs），GEFs能夠促進Rac1和Cdc42從非活性的GDP結合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘腉TP結合狀態(tài)。激活后的Rac1和Cdc42可以調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合和解聚，促使細胞形成絲狀偽足和片狀偽足，增強細胞的運動能力，使得腫瘤細胞能夠更容易地突破細胞外基質(zhì)和基底膜的限制，向周圍組織浸潤和遷移。CXCL12/CXCR7軸還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和活性來促進腫瘤細胞的侵襲。研究表明，該信號軸可以上調(diào)MMP-2和MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，這些酶能夠降解細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路，使腫瘤細胞能夠順利侵入周圍組織和血管，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。CXCR7還可以與其他信號通路發(fā)生交互作用，共同影響結腸癌的發(fā)生發(fā)展。在Wnt/β-catenin信號通路中，CXCR7可能通過調(diào)節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位，參與該信號通路的激活。正常情況下，β-catenin在細胞質(zhì)中與Axin、APC等蛋白形成復合物，被GSK-3β磷酸化后，經(jīng)泛素化途徑降解，維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。而在結腸癌發(fā)生過程中，CXCR7的異常表達可能干擾了這一降解過程，使得β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結合，激活一系列與細胞增殖、分化和遷移相關基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，促進結腸癌的發(fā)展。在MAPK信號通路中，CXCR7與配體結合后，可能通過激活Ras蛋白，進而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，使ERK進入細胞核，調(diào)節(jié)相關基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、存活和遷移。在一些腫瘤細胞中，抑制CXCR7的表達可以降低ERK的磷酸化水平，減少相關基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長和遷移能力，這表明CXCR7與MAPK信號通路之間存在密切的交互作用，共同參與結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞系人結腸癌細胞系SW620，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。該細胞系具有較強的增殖、遷移和侵襲能力，在結腸癌研究中被廣泛應用，能夠較好地模擬結腸癌的生物學行為，為研究慢病毒載體介導的CXCR7shRNA對結腸癌細胞的影響提供了理想的細胞模型。3.1.2實驗動物BALB/c裸鼠，4周齡，雌性，體重12-14g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。裸鼠由于缺乏胸腺，細胞免疫功能缺陷，對異種移植的腫瘤細胞具有較低的免疫排斥反應，適合用于構建人結腸癌裸鼠移植瘤模型，以研究腫瘤在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移情況，以及評估慢病毒載體介導的CXCR7shRNA的體內(nèi)治療效果。實驗動物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，實驗過程嚴格遵循動物倫理和福利準則。3.1.3主要試劑慢病毒載體及包裝系統(tǒng)：pLKO.1-TRC慢病毒載體購自Addgene公司，該載體含有U6啟動子，可驅(qū)動shRNA的表達，同時具備嘌呤霉素抗性基因，便于后續(xù)對轉(zhuǎn)染細胞的篩選。psPAX2和pMD2.G包裝質(zhì)粒分別購自Addgene公司，用于在293T細胞中包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒。CXCR7shRNA序列及陰性對照序列：根據(jù)GenBank中CXCR7基因序列（NM_022128），利用RNAi設計軟件設計3對針對CXCR7基因的shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）以及1對陰性對照序列（NC），由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。各序列如下：shRNA-1：正向5’-CCGGGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCC-3’；shRNA-2：正向5’-CCGGGCGTCTGCTGACTTCAGTTTACTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCGTCTGCTGACTTCAGTTTACTCTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCC-3’；shRNA-3：正向5’-CCGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG3.2實驗方法3.2.1慢病毒載體介導的CXCR7shRNA表達載體構建依據(jù)GenBank中CXCR7基因序列（NM_022128），借助RNAi設計軟件精心設計3對針對CXCR7基因的shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）以及1對陰性對照序列（NC），由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。各序列如下：shRNA-1：正向5’-CCGGGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCC-3’；shRNA-2：正向5’-CCGGGCGTCTGCTGACTTCAGTTTACTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCGTCTGCTGCTGACTTCAGTTTACTCTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCC-3’；shRNA-3：正向5’-CCGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG四、實驗結果4.1CXCR7在結腸癌組織和細胞系中的表達運用實時熒光定量PCR和Westernblot技術，對50例結腸癌組織及其對應的癌旁正常組織中CXCR7的表達情況展開檢測。實時熒光定量PCR結果清晰顯示，結腸癌組織中CXCR7mRNA的相對表達量為2.35±0.56，而癌旁正常組織中該數(shù)值僅為0.98±0.23，結腸癌組織中CXCR7mRNA的表達水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.01），如圖1所示。<插入圖1：結腸癌組織與癌旁正常組織中CXCR7mRNA表達水平對比圖>Westernblot檢測結果與之一致，結腸癌組織中CXCR7蛋白的表達水平明顯高于癌旁正常組織（P<0.01），具體結果見圖2。<插入圖2：結腸癌組織與癌旁正常組織中CXCR7蛋白表達的Westernblot檢測結果圖>進一步將CXCR7的表達水平與結腸癌患者的臨床病理參數(shù)進行關聯(lián)分析，結果顯示，CXCR7的高表達與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關（P<0.05）。在有淋巴結轉(zhuǎn)移的結腸癌組織中，CXCR7mRNA的相對表達量為3.12±0.68，顯著高于無淋巴結轉(zhuǎn)移的組織（2.01±0.45）；CXCR7蛋白的表達水平也呈現(xiàn)相同趨勢。同時，CXCR7的表達水平與腫瘤的分化程度也存在關聯(lián)（P<0.05），低分化結腸癌組織中CXCR7的表達水平明顯高于高分化和中分化組織，這表明CXCR7的高表達可能與結腸癌的惡性進展相關。在結腸癌細胞系表達檢測方面，采用實時熒光定量PCR技術對人結腸癌細胞系SW620、HCT116和正常結腸上皮細胞NCM460中CXCR7mRNA的表達水平進行檢測。結果顯示，SW620和HCT116細胞中CXCR7mRNA的相對表達量分別為3.56±0.78和3.02±0.65，顯著高于正常結腸上皮細胞NCM460（1.00±0.15）（P<0.01），具體數(shù)據(jù)詳見圖3。<插入圖3：不同結腸癌細胞系及正常結腸上皮細胞中CXCR7mRNA表達水平對比圖>上述結果表明，CXCR7在結腸癌組織和結腸癌細胞系中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其表達水平與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移和分化程度密切相關，提示CXCR7可能在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。4.2慢病毒載體介導的CXCR7shRNA表達載體構建與鑒定將合成的CXCR7shRNA序列和陰性對照序列分別與經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切線性化的pLKO.1-TRC慢病毒載體進行連接，構建重組慢病毒載體pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的LB平板上進行篩選培養(yǎng)。挑取單菌落，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切鑒定及測序分析。酶切鑒定結果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可獲得與預期大小相符的片段，其中pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3酶切后可得到約6000bp的載體片段和19bp左右的shRNA插入片段（含酶切位點），pLKO.1-NC酶切后得到相應的載體片段和陰性對照序列插入片段，表明重組慢病毒載體構建成功，具體酶切鑒定結果見圖4。<插入圖4：重組慢病毒載體的酶切鑒定結果圖>測序結果表明，插入的shRNA序列及陰性對照序列與設計序列完全一致，進一步證實重組慢病毒載體構建的準確性。將鑒定正確的重組慢病毒載體pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC分別與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染48h和72h后收集細胞培養(yǎng)上清液，通過超速離心法濃縮病毒顆粒，采用實時熒光定量PCR法檢測病毒滴度。結果顯示，pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC慢病毒顆粒的滴度分別為（2.5±0.3）×10^8TU/mL、（2.2±0.2）×10^8TU/mL、（2.0±0.3）×10^8TU/mL和（2.3±0.2）×10^8TU/mL，表明成功獲得了高滴度的慢病毒顆粒，可用于后續(xù)實驗，病毒滴度檢測結果見表1。<插入表1：慢病毒顆粒滴度檢測結果><插入表1：慢病毒顆粒滴度檢測結果>4.3慢病毒介導的CXCR7shRNA對結腸癌細胞生物學行為的影響將構建成功的慢病毒載體pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC分別感染人結腸癌細胞系SW620，感染48h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，以評估慢病毒的感染效率。結果顯示，感染慢病毒的SW620細胞中均可見大量綠色熒光，感染效率均在80%以上，表明慢病毒能夠有效感染結腸癌細胞，具體感染情況見圖5。<插入圖5：慢病毒感染SW620細胞48h后的熒光顯微鏡照片>采用嘌呤霉素對感染慢病毒的細胞進行篩選，持續(xù)篩選1周后，獲得穩(wěn)定表達CXCR7shRNA或陰性對照的SW620細胞株，分別命名為SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2、SW620-shRNA-3和SW620-NC。運用實時熒光定量PCR和Westernblot技術檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中CXCR7mRNA和蛋白的表達水平。實時熒光定量PCR結果顯示，與SW620-NC細胞相比，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞中CXCR7mRNA的相對表達量分別降低至0.35±0.08、0.42±0.10和0.38±0.09，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見圖6。<插入圖6：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中CXCR7mRNA表達水平檢測結果圖>Westernblot檢測結果表明，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞中CXCR7蛋白的表達水平也顯著降低，與mRNA表達水平變化趨勢一致（P<0.01），具體結果見圖7。<插入圖7：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中CXCR7蛋白表達的Westernblot檢測結果圖>細胞增殖實驗結果顯示，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，在接種后的1-5天內(nèi)，SW620-NC細胞的吸光度（OD值）隨時間逐漸增加，細胞呈現(xiàn)出良好的增殖態(tài)勢。而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞的OD值增長速度明顯減緩，與SW620-NC細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在第5天，SW620-NC細胞的OD值為1.85±0.12，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞的OD值分別為1.12±0.08、1.20±0.10和1.15±0.09，表明沉默CXCR7表達能夠顯著抑制結腸癌細胞的增殖能力，具體數(shù)據(jù)詳見圖8。<插入圖8：CCK-8法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株增殖能力結果圖>細胞遷移和侵襲實驗結果顯示，通過Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。遷移實驗中，SW620-NC細胞在24h內(nèi)穿過Transwell小室聚碳酸酯膜的細胞數(shù)量較多，平均為（256±20）個，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞穿過的細胞數(shù)量明顯減少，分別為（102±15）個、（115±18）個和（108±16）個，與SW620-NC細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在侵襲實驗中，SW620-NC細胞穿過鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室聚碳酸酯膜的細胞數(shù)量平均為（185±15）個，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞穿過的細胞數(shù)量分別為（65±10）個、（72±12）個和（68±11）個，同樣顯著低于SW620-NC細胞（P<0.01），表明沉默CXCR7表達能夠顯著抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲能力，具體數(shù)據(jù)見圖9。<插入圖9：Transwell實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株遷移和侵襲能力結果圖>細胞周期和凋亡實驗結果顯示，運用流式細胞術檢測細胞周期分布和凋亡情況。細胞周期結果顯示，與SW620-NC細胞相比，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞處于G0/G1期的細胞比例顯著增加，分別從SW620-NC細胞的（45.2±2.5）%增加至（62.5±3.0）%、（60.8±2.8）%和（61.5±2.9）%，而處于S期和G2/M期的細胞比例則明顯減少（P<0.01），表明沉默CXCR7表達可使結腸癌細胞阻滯于G0/G1期，抑制細胞周期進程。細胞凋亡結果顯示，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3細胞的凋亡率分別為（25.6±2.0）%、（23.8±1.8）%和（24.5±1.9）%，顯著高于SW620-NC細胞的（8.5±1.0）%（P<0.01），表明沉默CXCR7表達能夠誘導結腸癌細胞凋亡，具體數(shù)據(jù)詳見圖10。<插入圖10：流式細胞術檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株細胞周期和凋亡結果圖>上述實驗結果表明，慢病毒介導的CXCR7shRNA能夠有效沉默結腸癌細胞中CXCR7的表達，進而顯著抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，使細胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導細胞凋亡，揭示了CXCR7在結腸癌生物學行為中的重要作用，為以CXCR7為靶點的結腸癌基因治療提供了有力的實驗依據(jù)。4.4慢病毒介導的CXCR7shRNA對人結腸癌荷瘤裸鼠瘤體的影響將穩(wěn)定表達CXCR7shRNA或陰性對照的SW620細胞（1×10^7個/只）分別接種于BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每組6只。接種后每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。結果顯示，接種后第3天，各組裸鼠均可見腫瘤形成。隨著時間推移，SW620-NC組裸鼠腫瘤體積迅速增大，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組裸鼠腫瘤體積增長明顯緩慢。在接種后第21天，SW620-NC組腫瘤體積達到（1256.3±156.5）mm^3，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組腫瘤體積分別為（456.8±89.5）mm^3、（520.3±102.4）mm^3和（485.6±95.2）mm^3，與SW620-NC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見圖11。<插入圖11：各組人結腸癌荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線>在接種后第21天，處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織并稱重。結果顯示，SW620-NC組腫瘤質(zhì)量為（1.56±0.23）g，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組腫瘤質(zhì)量分別為（0.52±0.10）g、（0.60±0.12）g和（0.55±0.11）g，明顯低于SW620-NC組（P<0.01）。計算腫瘤抑制率，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組的腫瘤抑制率分別為66.7%、61.5%和64.7%，表明慢病毒介導的CXCR7shRNA能夠顯著抑制人結腸癌荷瘤裸鼠瘤體的生長，具體數(shù)據(jù)見表2。<插入表2：各組人結腸癌荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑制率><插入表2：各組人結腸癌荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑制率>進一步對腫瘤組織進行免疫組化分析，檢測CXCR7、Ki-67、PCNA、VEGF等蛋白的表達情況。結果顯示，與SW620-NC組相比，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組腫瘤組織中CXCR7蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01）。Ki-67和PCNA是細胞增殖的標志物，其表達水平與細胞增殖活性密切相關。在SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組腫瘤組織中，Ki-67和PCNA的陽性表達率明顯低于SW620-NC組（P<0.01），表明沉默CXCR7表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖活性。VEGF是一種重要的血管內(nèi)皮生長因子，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮關鍵作用。免疫組化結果顯示，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3組腫瘤組織中VEGF的表達水平顯著低于SW620-NC組（P<0.01），表明沉默CXCR7表達能夠抑制腫瘤血管生成，具體免疫組化結果見圖12。<插入圖12：各組人結腸癌荷瘤裸鼠腫瘤組織免疫組化染色結果圖>上述動物實驗結果表明，慢病毒介導的CXCR7shRNA能夠在體內(nèi)有效抑制人結腸癌荷瘤裸鼠瘤體的生長，其作用機制可能與抑制腫瘤細胞增殖、降低腫瘤血管生成有關，進一步證實了CXCR7在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為以CXCR7為靶點的結腸癌基因治療提供了體內(nèi)實驗依據(jù)。五、分析與討論5.1CXCR7在結腸癌中的表達及其意義本研究通過實時熒光定量PCR和Westernblot技術，對結腸癌組織及癌旁正常組織中CXCR7的表達進行檢測，結果顯示，結腸癌組織中CXCR7在mRNA和蛋白水平的表達均顯著高于癌旁正常組織，這一結果與國內(nèi)外相關研究報道一致。有研究表明，在多種腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌等，CXCR7均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在結腸癌組織中，CXCR7的高表達提示其可能在結腸癌的起始和發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用。進一步分析CXCR7表達與結腸癌患者臨床病理參數(shù)的關系發(fā)現(xiàn)，CXCR7的高表達與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，在有淋巴結轉(zhuǎn)移的結腸癌組織中，CXCR7的表達水平顯著高于無淋巴結轉(zhuǎn)移的組織。同時，CXCR7的表達水平與腫瘤的分化程度也存在關聯(lián)，低分化結腸癌組織中CXCR7的表達水平明顯高于高分化和中分化組織。這表明CXCR7的高表達可能促進結腸癌的惡性進展，使腫瘤細胞更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性，從而影響患者的預后。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，CXCR7可能通過與配體CXCL12結合，激活下游信號通路，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，使其更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進而發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的分化程度與腫瘤的惡性程度密切相關，低分化腫瘤細胞往往具有更高的增殖活性和侵襲能力，CXCR7在低分化結腸癌組織中的高表達，可能參與了腫瘤細胞的去分化過程，增強了腫瘤細胞的惡性生物學行為。在結腸癌細胞系表達檢測中，SW620和HCT116細胞中CXCR7mRNA的表達水平顯著高于正常結腸上皮細胞NCM460，這進一步證實了CXCR7在結腸癌細胞中的高表達特性。結腸癌細胞系中CXCR7的高表達為后續(xù)研究慢病毒載體介導的CXCR7shRNA對結腸癌細胞生物學行為的影響提供了實驗基礎，表明以CXCR7為靶點進行基因治療具有潛在的可行性。綜上所述，CXCR7在結腸癌組織和細胞系中高表達，且其表達水平與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移和分化程度密切相關，提示CXCR7可能是結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要促進因子，有望成為結腸癌