ICS11.220

B41

團體標準

T/CVMA1—2018

口蹄疫病毒田間分離株與疫苗株抗原關(guān)系

（r值）測定方法

Protocolofmatchingtest(rvalue)forfoot-and-mouthdiseasevirus

fieldstrainsandvaccinestrains

（征求意見稿）

xxxx-xx-xx發(fā)布xxxx-xx-xx實施

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布

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口蹄疫病毒田間分離株與疫苗株抗原關(guān)系（r值）測定方法

1范圍

本文件規(guī)定了口蹄疫病毒（FMDV）田間分離株與疫苗株抗原關(guān)系（r值）測定用試劑和器材、實驗

程序、試驗成立條件、血清抗體滴度計算、r值計算及結(jié)果解釋。

本文件適用于評價FMDV田間分離株與疫苗株的抗原關(guān)系（r值）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18935口蹄疫診斷技術(shù)

GB19489實驗室生物安全通用要求

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4試劑和器材

4.1試劑

4.1.1胎牛血清（或新生牛血清）

培養(yǎng)細胞用。

4.1.2陽性對照血清

FMDV感染動物或口蹄疫疫苗免疫動物血清，56℃水浴滅活30min。

4.1.3陰性對照血清

未接觸過FMDV的動物血清，56℃水浴滅活30min。

4.1.4待檢血清

待檢血清經(jīng)56℃水浴滅活30min。

2

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4.1.5病毒

FMDV分別適應(yīng)于BHK-21或IB-RS-2單層細胞。收獲的病毒液測定TCID50后，分裝于小管，-70℃保

存?zhèn)溆?。FMDV可用GB/T18935所述方法進行血清型、毒株譜系鑒定。病毒培養(yǎng)實驗室應(yīng)符合GB19489。

4.1.6細胞

BHK-21或IB-RS-2傳代細胞，傳代代次應(yīng)在15代以內(nèi)。

4.1.7EDTA胰蛋白酶溶液

消化、分散細胞用。

4.1.8細胞營養(yǎng)液

含10%胎牛（新生牛）血清的細胞維持液（pH7.4）（按照附錄A.1配制），培養(yǎng)細胞用。

4.1.9細胞維持液

Eagle’s-MEM與含5%水解乳蛋白的Earle's液等量混合配成（pH7.6～7.8）（按照附錄A.2配制），在

中和試驗中作稀釋液用。

4.1.10細胞染色液

用10%福爾馬林配制的0.05%亞甲基蘭溶液。

4.2器材

生物安全柜、恒溫CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、倒置生物顯微鏡、96孔細胞培養(yǎng)板、無菌試管、凍

存管、微量可調(diào)移液器及配套吸頭。

5試驗程序

5.1FMDVTCID50預(yù)測定

將FMDV在96孔培養(yǎng)板上作10倍連續(xù)稀釋，即10-1，10-2，10-3……10-11，每孔50μL病毒液，100μL

細胞懸液（細胞懸液的濃度以在24h內(nèi)長滿單層為度，一般每毫升100～150萬個細胞），每個稀釋度8

孔。每塊板的最后一列設(shè)8孔細胞對照，每孔補加50μL稀釋液（不加病毒）。置37℃5%CO2溫箱培養(yǎng)。

觀察CPE，72h將板固定并作常規(guī)染色（先用10%福爾馬林固定30min，然后置于用10%福爾馬林配制的

0.05%亞甲基蘭溶液中浸泡染色30min，最后將培養(yǎng)板用水沖洗）。未病變細胞呈藍色，病變細胞脫落

或不著色。依據(jù)CPE情況，按Reed-Muench法計算病毒TCID50。

5.2稀釋血清

3

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用細胞維持液將待檢血清在培養(yǎng)板上從1:4開始作2倍連續(xù)稀釋，每份血清至少平行稀釋2排孔，每孔

50μL。

5.3加入病毒

在上述每孔中加入50μL含100TCID50的病毒液。

5.4對照設(shè)立

正常細胞對照：每塊培養(yǎng)板上均設(shè)立2～4孔不接種病毒的正常細胞對照，每孔加入50μL。

陰性對照血清：設(shè)2~4孔，每孔加50μL血清及50μL含100TCID50的病毒液。

陽性對照血清：陽性對照血清和被檢血清平行稀釋（如：2排孔），每孔加入50μL含100TCID50的

病毒液。

病毒對照：另設(shè)一塊培養(yǎng)板測定本次試驗中病毒的實際滴度（TCID50），用以計算病毒的實際使用

量。

5.5中和反應(yīng)

封閉培養(yǎng)板，置37℃培養(yǎng)1h。

5.6加入細胞

血清與病毒中和1h后，每孔加入50μL細胞懸液，置37℃5%CO2溫箱培養(yǎng)。對照孔體積不足150μL

時，用稀釋液補全體積。

5.7染色

48h后，顯微鏡下預(yù)先作適當判讀。第3天，將板固定，并作常規(guī)染色。

6試驗成立條件

正常細胞對照：在整個試驗中一直保持良好的生長形態(tài)，染色呈藍色；

陰性對照血清：陰性對照血清孔應(yīng)全部出現(xiàn)CPE，染色不著色；

陽性對照血清：陽性對照血清抗體滴度應(yīng)在預(yù)期2倍以內(nèi)。

病毒對照：根據(jù)試驗中病毒的實際滴度（TCID50），計算病毒的實際使用量。每孔使用的病毒量應(yīng)

32TCID50～320TCID50范圍內(nèi)。

當以上對照均成立時，試驗有效。

7血清抗體滴度計算

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以血清/病毒混合物的50%終點表示血清的最終滴度，可通過Spearman–K?rber方法計算。

8r值計算及結(jié)果解釋

8.1r值計算公式

疫苗血清與田間流行毒株中和滴度的倒數(shù)

r=

疫苗血清與疫苗毒株中和滴度的倒數(shù)

8.2結(jié)果解釋

利用中和實驗測定r值，一般認為當r值大于0.3，表明田間分離株與疫苗株相似，該毒株配制的疫苗

能夠保護田間流行毒株的攻擊。當r值低于0.3，表明田間毒株明顯不同于疫苗株，該毒株配制的疫苗不

能有效保護田間流行毒；在這種情況下，應(yīng)通過本動物交叉攻毒保護實驗進行驗證現(xiàn)有的疫苗對田間分

離株的保護效果。

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

A.1Eagle’s-MEM

10×Eagle’s-MEM營養(yǎng)液：Eagle’s-MEM營養(yǎng)劑9.5g，加超純水100.0mL。溶解后過濾除菌。用無菌

超純水將10×營養(yǎng)液按1:10稀釋，即100mL營養(yǎng)液中加入900mL無菌超純水中即為使用濃度營養(yǎng)液，4℃

保存?zhèn)溆谩?/p>

A.20.5%水解乳白蛋白/Earle’s液

氯化鈉(NaCl)6.8g

氯化鉀(KCl)0.4g

氯化鈣((CaCl2)0.2g

硫酸鎂(MgSO4?7H2O)0.2g

磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O)0.14g

葡萄糖1.0g

10%酚紅2.0mL

水解乳白蛋白5.0g

加超純水至1000m

按配方稱取各成分并逐個溶解，最后加超純水至1000mL，過濾除菌。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

————————————

6

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前??言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件不涉及專利。

本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。

本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

本文件主要起草人：靳野、何繼軍、楊亞民、吳錦艷、劉永杰、呂律、馬維民、盧炳州、郭建宏、

張強、劉湘濤、李俊平。

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口蹄疫病毒田間分離株與疫苗株抗原關(guān)系（r值）測定方法

1范圍

本文件規(guī)定了口蹄疫病毒（FMDV）田間分離株與疫苗株抗原關(guān)系（r值）測定用試劑和器材、實驗

程序、試驗成立條件、血清抗體滴度計算、r值計算及結(jié)果解釋。

本文件適用于評價FMDV田間分離株與疫苗株的抗原關(guān)系（r值）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18935口蹄疫診斷技術(shù)

GB19489實驗室生物安全通用要求

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4試劑和器材

4.1試劑

4.1.1胎牛血清（或新生牛血清）

培養(yǎng)細胞用。

4.1.2陽性對照血清

FMDV感染動物或口蹄疫疫苗免疫動物血清，56℃水浴滅活30min。

4.1.3陰性對照血清

未接觸過FMDV的動物血清，56℃水浴滅活30min。

4.1.4待檢血清

待檢血清經(jīng)56℃水浴滅活30min。

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4.1.5病毒

FMDV分別適應(yīng)于BHK-21或IB-RS-2單層細胞。收獲的病毒液測定TCID50后，分裝于小管，-70℃保

存?zhèn)溆?。FMDV可用GB/T18935所述方法進行血清型、毒株譜系鑒定。病毒培養(yǎng)實驗室應(yīng)符合GB19489。

4.1.6細胞

BHK-21或IB-RS-2傳代細胞，傳代代次應(yīng)在15代以內(nèi)。

4.1.7EDTA胰蛋白酶溶液

消化、分散細胞用。

4.1.8細胞營養(yǎng)液

含10%胎牛（新生牛）血清的細胞維持液（pH7.4）（按照附錄A.1配制），培養(yǎng)細胞用。

4.1.9細胞維持液

Eagle’s-MEM與含5%水解乳蛋白的Earle's液