ICS11.040.20CCSC31液相色譜用于臨床維生素A、維生素E、25-羥基維生素D2/D3檢測通用技術要求Generaltechnicalrequirementsformeasurementof中國醫(yī)療器械行業(yè)協會發(fā)布 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 3.1液相色譜Highperformanceliquidchromatography,HPLC 3.2選擇性Selectivity 3.3殘留Residue 3.4定量下限Lowerlimitofquantification 3.5線性Linearity 3.6正確度Accuracy 23.7精密度Precision 23.8稀釋可靠性Dilutionreliability 23.9可報告范圍Reportablerange 23.10信噪比Signal-to-NoiseRatio；SNR 2 23.12穩(wěn)定性Stability 3.13脂溶性維生素fat-solublevitamins；FSV 24實驗基本要求 24.1實驗室基本要求 24.2人員要求 4.3液相色譜設備的基本要求 4.4樣品采集、運輸和存儲要求 34.4.1樣品采集 4.4.2樣品運輸 4.4.3樣品的保存 4.5試劑和耗材 35方法學建立 3 35.2標準品的選擇 45.3色譜條件建立與優(yōu)化 46方法學評價 46.1選擇性 46.2殘留 46.3定量下限 46.4線性 46.5正確度 46.6精密度 46.6.1批內精密度 46.6.2批間精密度 6.7可報告范圍驗證 6.7.1低值樣本準備 6.7.2高值樣本準備 6.7.3樣本測試 6.7.4結果計算 6.7.5可接受標準 6.8稀釋可靠性 56.9穩(wěn)定性考察 56.9.1樣本穩(wěn)定性考察 6.9.2系統(tǒng)穩(wěn)定性考察 6.10交叉驗證 6.10.1驗證條件 6.10.2驗證方案 7質量管理 7.1室內質控 7.1.2質控濃度范圍 7.1.3質控頻率 7.1.4質控規(guī)則 7.1.5質控的接受標準 7.1.6質控失控處理 7.2室間質量評價 7.3其他質量保證和質量控制措施 8結果報告 8.1制定標準 8.2不符合標準的處理 8.3警戒值報告 7 血液中維生素A、維生素E、25-羥基維生素D2/D3液相色譜法 8A.1.1標準儲備液的制備 A.1.2標準溶液的制備 A.1.3質控溶液的制備 A.2.1液相色譜柱 A.2.2流動相 8A.3.1蛋白沉淀法 A.3.2磁性固相萃取法 A.4.1色譜條件 A.4.2系統(tǒng)適用性測試 A.4.3樣品檢測 A.5.1工作曲線的建立 A.5.2濃度計算 參考文獻 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國醫(yī)療器械行業(yè)協會歸口。本文件起草單位：首都醫(yī)科大學附屬首都兒童醫(yī)學中心、首都兒科研究所、解放軍第九六〇醫(yī)院、中國科學院重慶綠色智能技術研究院、北京市豐臺區(qū)婦幼保健院、重慶醫(yī)療器械質量檢驗中心、南京艾迪邁科技有限公司、中國島津、蘇州納微生命科技有限公司。本文件主要起草人：王曉燕、張敏、郭晉敏、楊曉洪、相蕾、楊丹、石功名、劉麟、趙光耀1T/CAMDI165—2025液相色譜用于臨床維生素A、維生素E、25-羥基維生素D2/D3檢測通用技術要求本文件規(guī)定了采用高液相色譜法（HPLC）檢測血清/血漿/末梢血中脂溶性維生素（維生素A、維生素E、25-羥基維生素D2/D3）的實驗要求、方法驗證、質量管理及結果報告。本文件適用于HPLC檢測體系建立與實施、試劑盒的研發(fā)的技術要求。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T26792-2019高效液相色譜儀生物樣品定量分析方法驗證指導原則中國藥典生物分析方法驗證及樣品分析M10國際人用藥品注冊技術協調會ICH協調指導原則WS/T408—2024定量檢驗程序分析性能驗證指南GB/T20469-2006臨床實驗室設計總則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1液相色譜Highperformanceliquidchromatography,HPLC高效液相色譜法（HPLC）基于色譜分離原理，通過高壓輸液泵系統(tǒng)將特定流動相持續(xù)輸送至填充固定相的色譜柱中，實現對樣品的高效分離與檢測。根據分離維度可分為：一維色譜法：采用一根柱子進行分析，適用于常規(guī)成分分析；二維色譜法：是將分離機理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯起來構成的分離系統(tǒng)。樣品經過第一維的色譜柱進入接口中，通過濃縮、捕集或切割后被切換進入第二維色譜柱及檢測器中。顯著提升復雜混合物的分辨能力。3.2選擇性Selectivity該方法應有選擇性（Selectivity確保目標分析物在復雜基質（如生物體液或組織提取物）中與內源性干擾物質（如結構類似物、蛋白質）及外源性共存組分（如藥物聯用及其代謝物）有效分離，分離度（Resolution,Rs）應滿足藥典或方法驗證指南要求（通常Rs≥1.5）。3.3殘留Residue應在方法建立中考察殘留并使之最小。殘留不影響準確度和精密度。3.4定量下限Lowerlimitofquantification定量下限是指在樣品中能夠實現可靠定量的分析物最低濃度，應有可接受的準確度與精密度。該定量下限應與標準曲線的最低點相一致，并且必須與預期的濃度范圍以及試驗目的相適應，以確保檢測結果的有效性和可靠性。3.5線性Linearity在給定的分析測量范圍內，檢驗程序使其檢驗結果與樣品分析物濃度直接成比例的能力。注1：檢驗結果是指最終結果，而非儀器輸出的原始信號。注2：非線性對分析測量范圍內的單一濃度點表現為系統(tǒng)效應，對全部濃度點的影響可按隨機效應處理。[來源：WS/T408—2024，3.5]3.6正確度Accuracy分析方法的正確度是指該方法測得值與分析物標示濃度之間的接近程度，反映了方法的可靠性和可信性。正確度越高，測得值與標示濃度的偏差越小，表明方法在實際應用中越能真實反映分析物的濃度。3.7精密度Precision分析方法的精密度用于描述在重復測定分析物時，測得值之間的接近程度，通常以相對變異系數表示。精密度的評估應基于與準確度驗證相同的分析批樣品結果，以確保數據的一致性。應使用與證明準確度相同分析批樣品的結果，獲得在同一批內和不同批間定量下限以及低、中、高濃度質控樣品的精密度。3.8稀釋可靠性Dilutionreliability樣品稀釋操作應確保不影響分析方法的準確度和精密度，以保證測定結果的可靠性和一致性。稀釋過程需嚴格控制，避免因稀釋倍數、稀釋劑性質或操作條件的變化對分析結果產生偏差。3.9可報告范圍Reportablerange體外診斷醫(yī)療器械性能特征已被驗證的測量區(qū)間。[來源：CNAS-GL037,2019，3.1]3.10信噪比Signal-to-NoiseRatio；SNR信噪比是色譜系統(tǒng)適用性試驗中評價方法靈敏度的重要參數，通常用于確定方法的檢測限和定量下限。3.11基質Matrix基質是指樣本中除分析物以外的其他成分，這些成分可能會影響分析結果的準確性。3.12穩(wěn)定性Stability分析方法或樣本在指定儲存條件及時效范圍內保持其特性不變的能力，包括：樣本穩(wěn)定性和系統(tǒng)穩(wěn)定性。3.13脂溶性維生素fat-solublevitamins；FSV不溶于水而溶于脂肪及非極性有機溶劑的一類維生素。注：本文件涉及的脂溶性維生素特指25-羥基維生素D3、25-羥基維生素D2、α-生育酚、視黃醇。下列符號與縮略語適用于本文件：VA：視黃醇（vitaminA）VE：α-生育酚（vitaminE）25-OHD3：25羥基維生素D3（25-HydroxyvitaminD3）25-OHD2：25羥基維生素D2（25-HydroxyvitaminD2）4實驗基本要求4.1實驗室基本要求3T/CAMDI165—2025從事脂溶性維生素檢測的實驗室應符合GB/T20469臨床實驗室設計總則的要求，實驗室環(huán)境條件符合：環(huán)境溫度：10℃~30℃;環(huán)境濕度：20%～80%；大氣壓力：75kpa~106kpa；供電電源：交流電壓220V±22V，頻率50Hz±1Hz；接地電阻≤4Ω;室內應避免易燃、易爆和強腐蝕性氣體及強烈的振動、電磁干擾和空氣對流等；室內應有良好的通風。相關計量器具的檢定。4.2人員要求實驗室技術人員應具備醫(yī)學檢驗、分析化學、藥學、生物化學等相關教育背景或工作經歷，經培訓、考核合格后上崗。4.3液相色譜設備的基本要求HPLC設備應符合GB/T26792的要求。4.4樣品采集、運輸和存儲要求4.4.1樣品采集樣品采集注意以下事項：a)一般情況下，測試樣本為血清、血漿、全血或末梢血樣本；b)應考慮樣本采集容器等的影響，如評估所使用的采樣管中有無目標脂溶性維生素的干擾。4.4.2樣品運輸樣本采集后應2h內常溫送達實驗室，離心檢測。如外送樣本，宜離心后，分離血清或血漿，并在2℃-8℃避光條件下盡快送檢。4.4.3樣品的保存新鮮樣本若不立即檢測，應離心后分離血清,放于2℃-8℃避光保存。2℃-8℃避光可穩(wěn)定保存7d；-20℃及以下可穩(wěn)定保存28d。4.5試劑和耗材試劑和耗材的選擇一般需滿足下列要求：a)試劑選擇：優(yōu)先選擇色譜級試劑，并嚴格按照產品說明書的要求進行保存和使用，以確保試劑的純度和穩(wěn)定性。b)試驗用水：實驗過程中使用的水應為超純水，以避免雜質對檢測結果的干擾。c)耗材選擇：選用樣品采集管、加樣槍頭等耗材時，需評估其可能析出的雜質對檢測結果的影響，確保耗材的純凈性和適用性。d)更換驗證：更換試劑或耗材的種類或供應商時，應進行性能驗證，以確保新試劑或耗材的兼容性和可靠性。通過嚴格遵循以上要求，可以有效提高實驗的準確性和可靠性，確保檢測結果的科學性和一致5方法學建立5.1概述在分析之前，應全面評估目標分析物現有檢測方法的局限性，并明確選擇高效液相色譜（HPLC）檢測的必要性。基于評估結果，可根據實際需求開發(fā)針對單種或多種脂溶性維生素的聯合檢測方法，以確保檢測的準確性和可靠性。5.2標準品的選擇一般情況下純度應≥98.5%，使用有證參考物質除外。5.3色譜條件建立與優(yōu)化可參考附錄A，對色譜條件進行優(yōu)化。6方法學評價6.1選擇性應評價潛在的干擾物對脂溶性維生素的影響，應使用至少6個受試者的適宜樣本來證明選擇性，如結構類似物、高濃度血紅蛋白、膽紅素或脂質、抗凝劑、分離膠、防腐劑等。加入干擾物的定量下限附近的樣本與未加入干擾物的定量下限附近的樣本偏倚應小于±20%。6.2殘留高濃度樣品分析后，空白樣品中的殘留量應控制在定量下限的20%以內。6.3定量下限應對標準曲線定量下限附近的樣品，進行精密度及準確度驗證，滿足以下要求：a)定量下限不精密度（變異系數）CV≤20%；計算公式如公式（1b)定量下限相對偏差≤20%；計算公式如公式（2c)信噪比≥10。式中：CV—變異系數；SD—標準偏差；MN—平均值；相對偏差=測得值-參考值×100%6.4線性線性驗證程序如下：a)應該使用至少6個校正濃度水平，不包括空白樣品（不含分析物和內標的處理過的基質樣品）和零濃度樣品（含內標的處理過的基質）。b)在標示線性范圍內，線性相關系數r＞0.990，以驗證線性關系的可靠性；c)考察不同天內至少3個獨立批的校準曲線，定量下限的測得值應在標示值的±20%以內，其他水平應在標示濃度的±15%以內。d)定量下限和定量上限均符合準確度要求，且75%的標準曲線樣品需符合上述標準，且至少6個濃度水平需滿足要求。如果某個校正標樣結果不符合這些標準，應該拒絕這一標樣，不含這一標樣的標準曲線應被重新評價，包括回歸分析。6.5正確度應按照有證參考物質、正確度驗證室間質評樣品、正確度質控品的優(yōu)先順序進行準確度評價。定量下限附近的濃度準確度驗證結果在靶值±20%范圍內，其他濃度準確度驗證結果在靶值±15%范圍內。6.6精密度6.6.1批內精密度在不同工作日，開展至少連續(xù)3個獨立分析批的精密度評價實驗。每個分析批應包含2個不同5T/CAMDI165—2025濃度水平的待測樣本（如低值與高值質控品每個濃度水平需進行10～15次重復檢測。在每一批次測量過程中，應同時插入質控樣品進行監(jiān)測，確保分析系統(tǒng)的受控狀態(tài)與數據可靠性。[來源：CNAS-GL037，6.3.3]評估實驗室內精密度。依據已發(fā)布的行業(yè)標準等規(guī)范性文件，對方法的精密度進行驗證，定量下限濃度附近低值CV≤20%，其余濃度CV≤15%。[來源：生物分析方法驗證及樣品分析M10]6.6.2批間精密度至少連續(xù)檢測3個分析批，每批檢測2個水平的樣本，每個樣本重復檢測10～15次。在每一批次測量中，應同時測量質控品。評估批間精密度。依據已發(fā)布的行業(yè)標準等規(guī)范性文件，對方法的精密度進行驗證，定量下限濃度附近低值CV≤20%，其余濃度CV≤15%。6.7可報告范圍驗證可報告范圍驗證包括可報告低限（定量下限）與可報告高限（定量上限×樣品最大稀釋倍數）。稀釋的驗證按下述程序進行：6.7.1低值樣本準備將待測樣本（含被分析物）用混合人血清（含被分析物濃度水平較低）或5%牛血清白蛋白生理鹽水溶液進行稀釋，產生接近于方法測量區(qū)間低限（定量下限）濃度水平的樣本，通常為3～5個濃度水平，濃度間隔應小于測量區(qū)間低限的20%。6.7.2高值樣本準備使用混合血清或5%牛血清白蛋白生理鹽水溶液或測定方法要求的稀釋液對高值待測樣本（必要時可添加被分析物，并計算出理論值）進行稀釋，使其接近于線性范圍的上1/3區(qū)域內，并記錄稀釋倍數。至少選用3個高濃度樣本，稀釋倍數應為方法性能標明的最大稀釋倍數并適當增加或減小稀釋比例。6.7.3樣本測試在一次運行中將每個低值樣本重復測定5～10次，每個高值樣本重復測定3次。[來源：CNAS-GL037，6.5.3]6.7.4結果計算分別計算每個低值樣本的均值、SD、CV值。對高值樣本，計算乘以稀釋倍數后的還原濃度和相對偏差。6.7.5可接受標準式中：B—偏差；C—測定濃度（均值d—稀釋倍數；C0—理論濃度。6.8稀釋可靠性通過向基質中加入分析物至高于定量上限濃度，并用空白基質稀釋該樣品（每個稀釋因子至少5個測定值來證明稀釋的可靠性。準確度和精密度應在±15%之內，稀釋的可靠性應該覆蓋試驗樣品所用的稀釋倍數。6.9穩(wěn)定性考察6.9.1樣本穩(wěn)定性考察考察至少15個臨床血清樣本在預處理、儲存（常溫/冷藏/冷凍）、凍融循環(huán)等條件下分析物濃度的保持能力。6.9.2系統(tǒng)穩(wěn)定性考察考察至少30天色譜系統(tǒng)連續(xù)運行期間保留時間、峰面積響應等參數的波動范圍。6.10交叉驗證6.10.1驗證條件對于同一分析物（檢驗項目當實驗室存在以下情況時，需驗證不同檢驗程序在臨床適用范圍內患者樣本檢驗結果的一致性：a)檢驗的樣品類型不同但臨床預期用途相同，且測量單位相同或可換算時；b)不同的人員檢測。c)使用不同的檢測系統(tǒng)；d)使用多套相同的檢測系統(tǒng)；e)多地點或場所使用的檢測系統(tǒng)。6.10.2驗證方案1）樣本要求a)患者或受試者樣本數量應不少于20份（優(yōu)先選擇新鮮樣本被測物濃度在測量區(qū)間內應均勻分布，并涵蓋醫(yī)學相關水平的樣本。b)若使用室間質評樣本，樣本數量應不少于5份。c)若使用質控測試，質控應包含高、中、低三個水平，且每個水平樣本不少于5份。2）實驗室可根據實際使用情況，選擇使用與參比系統(tǒng)比對的方法或均值法進行可比性驗證：a)當實驗室使用的檢測系統(tǒng)數量≤4時，可選用與參比系統(tǒng)比對的方法。檢測結果與參比系統(tǒng)的測量結果進行比對，計算偏差，其中5份樣品中4份或90%以上結果應符合實驗室的接受標準；b)當實驗室使用檢測系統(tǒng)數量＞4時，可選用均值法。以全部系統(tǒng)結果的均值為參考值，計算全部檢測系統(tǒng)結果的極差，其中5份樣品中4份或90%以上結果應符合實驗室的接受標準；c)接受標準：待測目標物的相對偏差應小于15%。7質量管理7.1室內質控用于方法精密度的長期監(jiān)測、反映檢測結果的波動，質控數據結合各方面信息的回顧將有助實驗室分析并提升方法性能。7.1.1質控品質控品根據基質不同分為凍干質控品、純溶液基質和混合血清/血漿等。質控品應滿足以下要求：a)質控品盡量選用與待測樣品具有相同或相似的基質。質控品應均一、穩(wěn)定。b)自配質控品時，實驗室應確定其適用性，至少應評價均一性、穩(wěn)定性等指標。7.1.2質控濃度范圍質控濃度范圍宜滿足以下要求：a)應設置至少2個濃度水平的質控品，建議其中1個在3倍定量下限附近，1個在定量上限的75%-80%附近；如增加質控濃度水平應在線性范圍的中間位置。b)設置質控品濃度水平時宜考慮所選質控品的濃度應綜合考慮參考區(qū)間范圍，如缺乏及中毒附近等。7.1.3質控頻率質控頻率滿足以下要求：a)一個分析批內必須檢測質控品進行質量控制；b)應在每個分析批檢測前檢測質控品，宜在分析批結束時也進行質控品檢測。根據具體情況，可適當增加或減少質控品頻率。7.1.4質控規(guī)則7T/CAMDI165—2025室內質控的方法包括基于統(tǒng)計學的質量控制、控制限控制等?；诮y(tǒng)計學的質量控制，應對產生客觀結果/數據的檢驗過程進行監(jiān)測和評估，要求：a)質控品應當在常規(guī)標本檢測前或與常規(guī)標本一同檢測（相同條件、相同檢測次數b)對于定量試驗將質控結果繪制Levy-Jennings質控圖，并通過多規(guī)則以判定在控或失控。7.1.5質控的接受標準應依據所選質控規(guī)則，對質控結果進行判讀，一個分析批內質控品在控時，發(fā)布臨床樣品檢測結果。7.1.6質控失控處理質控失控處理按以下程序進行：a)應繪制質控圖，并通過適當的質控規(guī)則進行檢測程序狀態(tài)的判斷；b)質控失控后，應先增加一個質控測試，同時調查質控失控原因并記錄采取的所有措施；c)失控處理應至少考量峰型、干擾峰、基線噪音、保留時間漂移、攜帶污染、信號強度改變、干擾等因素。d）評估質控失控后對樣本檢測結果的影響：如質控配制或進樣錯誤等導致質控失控，不影響樣本檢測結果，重測質控合格后，可以正常出報告；如系統(tǒng)問題（進樣針堵塞、流速異常、流路污染等）導致質控失控，需維護系統(tǒng)，重測質控合格后，重新檢測樣本再出具報告。7.2室間質量評價室間質量評價（externalqualityassessment，EQA）宜按以下程序進行：a)通過參加EQA來評價實驗室檢測能力，對能力驗證結果進行分析總結，及時采取糾正或預防措施；b)無適用的EQA項目時，宜與外部實驗室進行比對；7.3其他質量保證和質量控制措施應同時選用其他質量保證程序用以保障檢測結果的準確性，如實驗室內部比對方案等方法進行質量保證。實驗室內部比對方法可參照6.10執(zhí)行。8結果報告在出具檢測結果報告時，實驗室應遵循以下要求：8.1制定標準實驗室應明確制定接受或拒絕某一分析批或檢測結果的標準，包括但不限于以下內容：a)室內質控是否符合要求；b)系統(tǒng)適用性是否符合規(guī)范；c)患者信息是否完整且與樣本匹配；d)樣本檢測結果及參考范圍；8.2不符合標準的處理若檢測結果不滿足上述標準，該分析批不得出具正式檢測報告。實驗室應立即重新測定，并及時通知臨床科室說明原因，確保后續(xù)檢測結果的可靠性。8.3警戒值報告當檢測結果達到實驗室設定的警戒值時，實驗室應在第一時間將結果報告給臨床科室，并確保信息傳遞的準確性和及時性。同時應明確，檢測結果僅對測試樣本在檢測時的狀態(tài)負責，不涉及樣本采集前或采集后的其他狀態(tài)。血液中維生素A、維生素E、25-羥基維生素D2/D3液相色譜法A.1標準溶液的制備A.1.1標準儲備液的制備配置方法如下：a)0.02%抗壞血酸（VC）甲醇溶液（現配現用準確稱量約2mgVC，加入100mL甲醇，充分混勻；b)準確稱量25-OHD2、25-OHD3各約10mg，于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容。c)準確稱量約VE10mg，取100μL濃度為5mg/mL的VA，取50μLb)項下配制的25-OHD2、25-OHD3溶液于5mL容量瓶中，加入0.02%VC定容；d)上下顛倒混勻不少于15次；e)標準溶液儲備液的濃度分別為：VA100μg/mL、VE2000μg/mL、f)分裝于玻璃小瓶-70℃及以下避光至少可保存6個月。A.1.2標準溶液的制備配置方法如下：a)0.02%抗壞血酸（VC）甲醇溶液（現配現用準確稱量2mgVC，加入100mL甲醇，充分混勻；b)取上述標準品儲備液50μL，加入950μL0.02%抗壞血酸（VC）甲醇溶液，充分混勻，得到標準品工作液1（S1C）替代基質（BSA稀釋液稱取2gBSA、0.5g氯化鈉、2g甘露醇，加入100mL的純水中溶解混勻即可。d)用替代基質將S1進行稀釋分別得到濃度范圍為：25OHD2和25OHD3:5ng/mL～100ng/mL、VA：50ng/mL~1000ng/mL、VE:1000ng/mL~26000ng/mL.A.1.3質控溶液的制備a)低值質控：用替代基質將標準溶液進行稀釋，得到濃度范圍為：25OHD2和25OHD3:15ng/mL、VA：150ng/mL、VE:3000ng/mL.b)高值質控：用替代基質將標準溶液進行稀釋，得到濃度范圍為：25OHD2和25OHD3:80ng/mL、VA：800ng/mL、VE:16000ng/mL.A.2色譜參數的建立和優(yōu)化A.2.1液相色譜柱液相色譜柱應滿足以下要求：a)根據脂溶性維生素的理化性質，選擇具有良好穩(wěn)定性及重現性的C18色譜柱(如C18-H4.6*100mm,5um)；也可根據實驗室情況選取合適的色譜柱。b)色譜峰應左右對稱性良好，無拖尾、前沿峰。拖尾因子應在0.85-1.15.c)系統(tǒng)適用性測試時，目標峰理論塔板數不低于3000，目標峰與相鄰峰分離度大于1.5。A.2.2流動相流動相A：可采用乙腈-甲醇作為流動相A，現用現配。流動相B：可采用純水作為流動相B，現用現配?？筛鶕褂蒙V柱匹配相應的流動相。9T/CAMDI165—2025A.3樣本前處理（包括標準品工作液和血液樣本）根據實驗情況選擇合適的前處理方法：不同儀器選擇不同的前處理方法。二維液相色譜可選用蛋白沉淀法；一維液相色譜可選用磁性固相萃取法。A.3.1蛋白沉淀法a)加樣：移取標準品工作液或血液樣本100~300μL，加入蛋白沉淀管中；b)移液：移取蛋白沉淀劑（如乙腈）300~900μL，加入蛋白沉淀管中；c)沉淀：充分混勻，13000rpm離心10min或磁珠吸附分離上清液；或正壓過濾分離過濾液。A.3.2磁性固相萃取法a)加樣：移取標準品工作液或血液樣本100~300μL，再移取稀釋劑（如純水）150μL，輔助提取劑（如甲醇）450μL加入到處理管中，充分混勻；b)吸附：利用磁棒移取活化后的C18磁性固相萃取微球5mg，加入處理管中，40℃加熱混勻2min，利用磁棒吸附磁珠，棄掉液體；c)淋洗：移取淋洗液（如純水）300~900μL，加入處理管中，充分混勻20s，利用磁棒吸附磁珠，棄掉淋洗液；d)洗脫：移取洗脫液（如甲醇）150~900μL，加入處理管中，40℃加熱混勻2min，利用磁棒吸附磁珠，收集洗脫液即可。A.4樣品檢測A.4.1色譜條件色譜柱：C18-H（4.6*100mm,5um柱溫：40℃;進樣量：400ul(全自動二維液相色譜系統(tǒng))；運行時間：8min流動相：流動相A：流動相B=7：3（可根據實驗室儀器和色譜柱調整流動相比例）A.4.2系統(tǒng)適用性測試取系統(tǒng)適用性溶液，進樣結果中25-OHD2、25-OHD3、VA、VE與相鄰峰的分離度＞1.5，保留時間不超過±20%，信噪比S/N＞5。如系統(tǒng)適用性溶液測試結果不滿足上述要求，可重復進樣。A.4.3樣品檢測取處理好的校準品、質控品和血液樣本注入液相色譜儀進行檢測，記錄色譜圖與待測樣品中各化合物的峰面積。A.5結果計算A.5.1工作曲線的建立分別取標準物質由低至高進行測定。以標準曲線樣品的標示濃度為橫坐標（x以標準曲線樣品的實際檢測峰面積為縱坐標（y權重根據情況選擇，推薦1/x或1/x2，繪制標準曲線，進行加權線性回歸（r≥0.990）。在每次開機時進