1、第十一章聚合酶鏈反應(yīng)PCR及其衍生技術(shù),1,PCR的用途,體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，能快速、特異地?cái)U(kuò)增目的DNA片段。能通過試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍。迅速獲取大量的單一核酸片段，為分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)大的工具。,2,1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模型。1958年，Meselson和Stahl用實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA半保留復(fù)制模型。70年代以來，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體系，一是基因克隆技術(shù)，二是體外擴(kuò)增技術(shù)。,發(fā)展歷程,3,1971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主）：“經(jīng)過DNA變性，與合

2、適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。”核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想被遺忘原因:（1）很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制性內(nèi)切酶，體外克隆基因已成為可能。,4,1976年，臺(tái)灣省籍科學(xué)家錢嘉韻（AliceChien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermusaquaticus中分離出熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶。1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），Saiki等首次應(yīng)用PCR法成功地?cái)U(kuò)增了人-珠蛋白的DNA，并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前

3、診斷。,5,1988年Saiki開始將耐熱性TaqDNA聚合酶應(yīng)用于PCR，整個(gè)反應(yīng)只加一次酶即可，擴(kuò)增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡(jiǎn)化。1989年被譽(yù)為“分子年”，列PCR為十余項(xiàng)發(fā)明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,6,PCR的基本原理,試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。,7,8,9,高溫變性,10,低溫退火,11,中溫延伸,12,13,14,15,16,17,18,19

4、,20,21,PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。,22,理論擴(kuò)增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），2530循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實(shí)際擴(kuò)增率：()n，X為PCR的實(shí)際擴(kuò)增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。,23,PCR擴(kuò)增曲線,24,PCR反應(yīng)體系

5、與流程,反應(yīng)體系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10PCR緩沖液1.54mMMg2+0.2mMdNTP,反應(yīng)流程預(yù)變性變性退火延伸延伸完全終止,2535循環(huán),25,一、PCR的反應(yīng)體系,引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP模板（template）Mg2+（magnesium）,26,1、引物,引物：決定PCR反應(yīng)的特異性PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,27,基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性

6、擴(kuò)增。,引物設(shè)計(jì)的原則,28,引物長度：15-30bp，常用20bp左右引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段,29,引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣會(huì)使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤延伸避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)特別避免3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶,30

7、,31,引物3端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)（不能做任何修飾）特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗引物5端可修飾引物5端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大；引物5端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5端最多可加10個(gè)堿基而對(duì)PCR反應(yīng)無影響,32,3,5,3,5,限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記,33,引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性引物量：每條引物的濃度0.10.5M，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),34,實(shí)例：設(shè)計(jì)人類GAPDH基因mRN

8、A的引物,用PrimerPremier軟件設(shè)計(jì)引物；在UCSCGenomeBrowser上驗(yàn)證（如果失敗則重新設(shè)計(jì)）,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，是根據(jù)GAPDH的mRNA序列設(shè)計(jì)的，理論擴(kuò)增長度是318bp，但它卻在人類基因組上擴(kuò)增出了兩個(gè)片段；第一個(gè)片段來自12號(hào)染色體的擴(kuò)增，長度為2409bp；第二個(gè)片段來自X染色體的擴(kuò)增，片段長度是318bp。那么，那個(gè)擴(kuò)增片段才是正確的呢？我們?cè)O(shè)計(jì)的這一對(duì)引物可否用于擴(kuò)增人類GAPDH基因片段呢？,45,46,47,12號(hào)染色體擴(kuò)增出的序列是真正的GAPDH基因。在下面的序列比對(duì)中，我們可以發(fā)現(xiàn)，X染色

9、體上被擴(kuò)增出的序列實(shí)際上是GAPDH的加工的假基因（processedpseudogene）。因此，如果我們能保證作為模板的cDNA不混雜有染色體DNA，就可以用這一對(duì)引物擴(kuò)增GAPDH。,48,2、酶及其濃度,目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,49,50,Taq酶的保真性不高53聚合酶活性和53外切酶活性，無35外切活性;在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶是沒有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶等。,51,3、dNTP的質(zhì)量

10、與濃度,在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200M，濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制）,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配高濃度的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性,52,4、模板DNA,模板DNA的來源：微生物中提取DNA從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：0.12ug/100ul體系PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加,53,5、Mg2+濃度,Mg2+對(duì)PCR

11、擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,54,二、PCR的反應(yīng)流程,溫度與時(shí)間的設(shè)置循環(huán)次數(shù)常見問題,55,1、溫度與時(shí)間的設(shè)置,設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060退火，然后快速升溫至7075延伸，對(duì)于較短靶基因（長度100300bp）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸。,56,變性溫

12、度與時(shí)間：,一般9394，1min足以使模板變性若低于93則需延長時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。,57,退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：,退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55作為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想,58,引物的復(fù)性溫度通過以下公式幫助選擇合適的溫度：,Tm（解鏈溫度）4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值（510）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為3060s，足以使引物與

13、模板之間完全結(jié)合,59,延伸溫度與時(shí)間：,TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080150核苷酸/S/酶分子7060核苷酸/S/酶分子5524核苷酸/S/酶分子高于90時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行,60,延伸溫度與時(shí)間：,延伸溫度：一般選擇在7075之間常用溫度為72過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）34kb的靶序列需34min擴(kuò)增10kb需延伸至15min延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些,61,2、循環(huán)次數(shù),循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)

14、：選在3040次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多,62,如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？在PCR反應(yīng)體系中，除使用TaqDNA聚合酶，摻入少量的具有35外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，錯(cuò)配率可降為原來的1/10；Mg2+濃度盡可能低，但不影響DNA合成；減少高溫反應(yīng)時(shí)間，這樣DNA熱損傷將減少；減少循環(huán)數(shù)。,63,如何提高PCR擴(kuò)增的特異性？升高退火溫度可增加引物與模板結(jié)合的特異性；縮短退火和延伸時(shí)間，可減少錯(cuò)誤引發(fā)及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機(jī)會(huì)；降低引物和酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是能減少引物二聚體的引發(fā)；改變Mg2+的濃度可

15、進(jìn)一步提高擴(kuò)增的特異性。,64,引物設(shè)計(jì)的特異性；減少循環(huán)次數(shù)；熱啟動(dòng)（HotStart）。即首先將模板變性，然后在較高溫度時(shí)加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，這樣使得引物在較高溫度下與模板退火，提高了反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，使擴(kuò)增更特異；采用二對(duì)引物即外引物和內(nèi)引物進(jìn)行擴(kuò)增來提高擴(kuò)增的特異性。,65,PCR技術(shù)的主要類型,（1）反向PCR技術(shù)(InversePCR,IPCR)：（2）錨定PCR技術(shù)(AnchoredPCR,APCR)：（3）不對(duì)稱PCR技術(shù)(asymmetricPCR)：（4）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)：（5）

16、巢式PCR技術(shù)(NEST-PCR)：（6）多重PCR技術(shù)(multiplexPCR)：（7）重組PCR技術(shù)：（8）原位PCR技術(shù)：（9）熒光定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù),66,（1）反向PCR技術(shù)(InversePCR,IPCR)：,反向PCR是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法。一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA。酶切片段自身環(huán)化。以環(huán)化的DNA作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向P

17、CR獲得未知片段。,67,cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends，RACE）,通過RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5和3端，包括單邊PCR和錨定PCR。,1.基于蛋白質(zhì)保守性的兼并引物的設(shè)計(jì)及ORF保守區(qū)RT-PCR克??；2.3-RACE3.5-RACE,68,1.基于蛋白質(zhì)保守性的兼并引物的設(shè)計(jì)及ORF保守區(qū)RT-PCR克??；,利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列對(duì)。確定合適

18、的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50400個(gè)aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在1501200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)aa殘基，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。利用軟件設(shè)計(jì)引物RAG，YCT，MAC，KGT，SCG，WAT，HACT，BCGT，ACG，DA/G/T,N=ACG/T,密碼子的兼并性氨基酸密碼子數(shù)、,69,70,RT-PCR及定量RT-PCR（1）RT-PCR（reversetranscription-PCR）原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下、以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA為模板進(jìn)行PC

19、R反應(yīng)。是一種快速、簡(jiǎn)便、敏感性極高的檢測(cè)mRNA表達(dá)的方法。,PCR技術(shù)的主要類型,71,72,常用的兩種逆轉(zhuǎn)錄酶AMV（avianmyeloblastosisvirus）：酶活性最適溫度42MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：酶活性最適溫度37,73,（2）定量RT-PCR（qRT-PCR）：利用RT-PCR對(duì)mRNA水平進(jìn)行半定量或絕對(duì)定量分析。,74,半定量RT-PCR選用在組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的管家基因mRNA作為內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)。管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在各自的引物引導(dǎo)下擴(kuò)增。計(jì)算出擴(kuò)增后目的基因擴(kuò)增子/管家基因擴(kuò)增子的比值，從而達(dá)到半定量的目的。,75,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,常規(guī)定量PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量重復(fù)性差半定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量,76,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。,77,（1）Ct值,是熒光定量PCR的一個(gè)重要的