1、2005版中國藥典無菌檢查修訂內(nèi)容,遼寧省藥品檢驗所赫愛平、張雅杰2005年5月,一、起草指導思想二、無菌檢查法概念三、增修訂內(nèi)容四、供試品的無菌檢查,一、起草指導思想1、完善檢查方法；2、增加實驗的可操作性；3、縮小與先進國家藥典的無菌檢查法的差別；4、使方法更具科學性，以提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的可靠性。,二、無菌檢查法概念系指用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。同時指出：若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。,三、增、修訂內(nèi)容無菌檢查法的設(shè)施、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基無菌性及靈敏度檢查、實驗用菌株、最小檢驗量、培

2、養(yǎng)基用量、方法驗證、培養(yǎng)時間、結(jié)果判斷等等。,1、無菌檢查的設(shè)施試驗環(huán)境應(yīng)在潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單項流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行、其全過程必須嚴格遵守無菌操作。另規(guī)定：應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈級的檢測。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。,隔離系統(tǒng)的應(yīng)用應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的兩方面：一是保護產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實驗結(jié)果的可靠性，實現(xiàn)一次檢出的要求；二是保護操作人員免受實驗過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。,2、培養(yǎng)基的命名硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

3、（用于培養(yǎng)好氧菌和厭氧菌）改良馬丁培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)真菌）選擇性培養(yǎng)基增加1種，中和劑和表面活性劑要經(jīng)驗證,3、培養(yǎng)基的制備方法培養(yǎng)基可按處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的提供符合靈敏度試驗的脫水培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。,4、培養(yǎng)基的貯存制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在2-25、避光保存；保存在非密容器中，應(yīng)在3周內(nèi)使用（一般指配制好的）；保存

4、在密閉容器中，可在1年內(nèi)使用（一般指商品化）。,5、培養(yǎng)基的適用性檢查無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。試驗可與無菌試驗同時進行。,靈敏度檢查菌種：傳代次數(shù)不得超過5代2005：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC（B）26003銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）CMCC（B）10104生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CMCC（B）64941枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)CMCC(B)63501白色念珠球菌（Candidasporogenes）CMCC（B）98001

5、黑曲霉（Asperjillusniger）CMCC（F）980032000：藤黃微球菌（Micrococcusluteus）CMCC（B）28001生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CMCC（B）64941白色念珠球菌（Candidasporogenes）CMCC（B）98001,菌液制備,培養(yǎng)基接種,試驗菌培養(yǎng)基每管裝量接種管數(shù)接種量培養(yǎng)時間(ml)(支)（ml）（天）金黃色葡萄球菌硫乙醇酸鹽12213銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基9215黑曲霉1支不接種作為空白對照接種量1ml含菌100cfu,結(jié)果判斷空白對照應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生

6、長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。試驗同時應(yīng)做空白對照,6、稀釋液、沖洗液0.1%蛋白胨水溶液pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液如需要可加入表面活性劑或中和劑應(yīng)經(jīng)方法驗證證明其有效性，并對細菌存活無影響。修改原因：增加檢出率，使受損的微生物復蘇,7、方法驗證當建立藥品的無菌檢查方法時，應(yīng)進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應(yīng)重新驗證，并對每一試驗菌應(yīng)逐一進行驗證。,菌種及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度試驗方法方法驗證方法培養(yǎng)基接種菌加菌量接種管數(shù)培養(yǎng)（cfu）（支）（天）直接接種法硫乙醇酸鹽金黃色葡萄球菌10023-5銅綠假單胞菌生孢

7、梭菌枯草芽孢桿菌改良馬丁白色念珠球菌10023-5黑曲霉薄膜過濾法同直接接種法,直接接種法取規(guī)定量培養(yǎng)基分別接入小于100cfu的試驗菌（6種菌），其中1管接入規(guī)定量供試液，另一作為對照。,薄膜過濾法將規(guī)定量供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入同量試驗菌，作為對照,結(jié)果判斷如含供試品各管中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用。按此法進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明

8、供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用。應(yīng)采取措施，消除供試品的抑菌作用。并再重新進行驗證試驗,四、供試品的無菌檢查法無菌檢查方法包括直接接種法和薄膜過濾法。如供試品允許應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法.,1.陽性對照試驗應(yīng)根據(jù)供試品的特性選擇陽性對照菌。無抑菌及抗革蘭氏陽性-金黃色葡萄球菌抗革蘭氏陰性-大腸埃希菌抗厭氧菌-生孢梭菌抗真菌-白色念珠菌陽性對照培養(yǎng)48-72h應(yīng)生長良好。2.陰性對照應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作。陰性對照不得有菌生長。若使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等，應(yīng)證明其有效性，且對微生物生長及存活無影響。,3.檢驗數(shù)量指一次檢驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，參照表1、

9、2、3。最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗用量，也不包括驗證試驗用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾，應(yīng)增加1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。,4.檢驗量指一次試驗所用供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外參照表2、3。若每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量不應(yīng)少于直接接種法的總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾.,5.檢驗方法薄膜過濾法過濾器應(yīng)優(yōu)先選擇封閉式薄膜過濾也可使用一般薄膜過濾器。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)考慮供試品及其溶劑的特性

10、。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。沖洗液的量不宜過大，避免濾膜上的微生物受損。,水溶性供試品可溶于水的固體制劑供試品-內(nèi)酰胺類抗生素供試品非水溶性制劑供試品可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品檢查方法無菌氣（噴）霧劑供試品裝有藥物的注射器供試品具有導管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品,（2）直接接種法供試品按規(guī)定量分別接入含培養(yǎng)細菌和真菌培養(yǎng)基的容器中，除另有規(guī)定外，每個容器中的培養(yǎng)基量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。同時硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基不得少于15ml、改良馬丁培養(yǎng)基不得少于10ml，培養(yǎng)基用量和高度同方法學驗證試驗。,混懸液等非澄清水溶液供試品固體制

11、劑供試品-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品非水溶性制劑供試品敷料供試品腸線、縫合線供試品滅菌醫(yī)療器具供試品放射性藥品,6、培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)14天，如果培養(yǎng)基渾濁或培養(yǎng)14天后從外觀不能判斷是否長菌，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種培養(yǎng)基或斜面上，培養(yǎng)細菌2天、真菌3天，觀察有無菌生長或鏡檢進行判斷。陰性對照不得有菌生長。,7、結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但證明無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品中任何1管顯混濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。除非能充分證明，生物非供試品所含。當符合下列少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效。,對無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求?；仡櫉o菌實

12、驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；陰性對照管有菌生長。供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當引起的。,試驗若經(jīng)確認無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品不符合規(guī)定。,出廠產(chǎn)品批最小檢驗數(shù)量,上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗量,上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量,每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。桶裝固體原料的最小檢驗數(shù)量為4個包裝。,菌種驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗菌株的生物學特性。應(yīng)采用適宜的保存技術(shù)，防

13、止試驗菌株發(fā)生變異。,菌種的收集、貯藏、保存、確認試驗的記錄。1、溯源性(菌種的來源)：藥品微生物實驗室的標準菌種應(yīng)來自中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學菌種保藏中心（ChinaMedicalCultureCollectionCMCC）系列。或美國藥典收載的美國菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollectionATCC）系列等國際法定菌種保藏中心。,2、菌種的質(zhì)量控制：對選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)的典型菌落進行鑒定。形態(tài)、染色鏡檢、純度、必要時應(yīng)做生化鑒定試驗，一旦出現(xiàn)偏差，應(yīng)做進一步的調(diào)查，所有被確認受到污染或變異的菌種應(yīng)及時銷毀，不得用于常規(guī)實驗用。,3.菌種管的標簽要求：名稱、編號

14、、代數(shù)、有效期、制備日期菌種記錄：名稱、編號、來源、菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化與血清學鑒定、傳代數(shù)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、保藏方法、貯存條件及保藏庫址。,4、菌種的保存對微生物實驗來說菌種是特殊的標準品應(yīng)給予相同于化學標準品的管理（溯源性、質(zhì)量的原始性）外，還有安全性方面的管理。菌種保藏方法有多種，但對不同的微生物應(yīng)通過保藏試驗來選擇最適宜保藏方法。一般多用瓊脂斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、冷凍真空保藏法、甘油冷凍管保藏法等。,瓊脂斜面低溫保藏方法實驗室多采用此法一般在4保存。銅綠假單孢菌在室溫保存。,液體石蠟保藏法本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、升化水平，延長菌種保藏時間。方法：液體石蠟121高壓滅菌30min或110-170烘箱1-2h干燥去掉水分。取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入石蠟，高出培養(yǎng)基面1cm為宜，放入4保藏。,冷凍真空保藏法保護劑多種多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復3次用脫脂棉過濾，113高壓滅菌30min，接入菌種，培養(yǎng)后低溫、冷凍、真空干燥置-35保存。,（4）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后（細菌2448小時的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時的培養(yǎng)物。）