1、高通量測序結(jié)果分析流程,畢欣 2017.03.15,申請單與計算性別,臨床提示是否有性別發(fā)育異常字眼,一致,不一致,一、確認(rèn)性別,有,無,分析原因,報告單提示是否存在SRY,核對采血管信息（及家屬樣本）,不一致,一致,重新采樣,重提DNA（多個樣本性別不符？）,二、篩選基因與位點-Risk值,注：a,預(yù)計致病突變指無義突變、移碼突變、剪接突變、影響翻譯起始位點的突變等公認(rèn)可能嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的突變；b,MAF=Minor Allele Frequency,即最小等位基因頻率；c,VUS=variant of unknown clinical significance，臨床意義未明。,基因名,

2、Risk值,OMIM數(shù)據(jù)庫疾病信息,項目簡寫,突變類型,標(biāo)準(zhǔn)命名,HGMD數(shù)據(jù)庫信息,Clinvar數(shù)據(jù)庫信息,cosmic數(shù)據(jù)庫信息,本批次試驗出現(xiàn)次數(shù),本地數(shù)據(jù)庫信息,ExAC數(shù)據(jù)庫信息,ESP6500數(shù)據(jù)庫信息,千人基因組數(shù)據(jù)庫信息,二、篩選基因與位點-臨床表現(xiàn),注意：知識更新！,三、位點致病性的判斷,美國遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會,極強,強,中等強度,支持性,良性 / 非致病性,Increased segregation data,病理性,對于篩選出來的變異，原則上均應(yīng)該進(jìn)行Sanger測序驗證后方可報告。,當(dāng)遇到以下情況時應(yīng)注意應(yīng)用sanger測序技術(shù)對高通量測序未覆蓋區(qū)域進(jìn)行補充檢測：

3、1）常染色體隱性遺傳疾病，已發(fā)現(xiàn)一個雜合致病突變，該疾病能夠很好地解釋患者臨床表現(xiàn)； 2）患者臨床提示指向某一、兩個特定基因時，如果尚未發(fā)現(xiàn)明確致病突變，則需要對該基因未覆蓋之區(qū)域用sanger測序技術(shù)補足。,Load from file,load .bam文件,搜索染色體坐標(biāo),IGV（Integrative Genomics Viewer）軟件中可以顯示該位點總測序深度（total count）、測到的堿基及對應(yīng)比例、測到每種堿基的reads中正反鏈各自的數(shù)目,意外發(fā)現(xiàn)： 對測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析，亦會提示基因大片段缺失/重復(fù)突變（存于exonCNV文件夾）和染色體拷貝數(shù)（ploidy.m

4、tx文件），此時如果發(fā)現(xiàn)可以解釋患者臨床表現(xiàn)的突變時，也應(yīng)該在報告單中予以提示（描述模板為“高通量測序結(jié)果提示X染色體上存在至少包含DIAPH2和PCDH19基因的大片段缺失突變，長度約3.6Mb，建議應(yīng)用染色體微陣列分析的方法進(jìn)行確認(rèn)。”）。,四、質(zhì)量控制,性別判斷,整體數(shù)據(jù)質(zhì)量,特定位點質(zhì)量,未同時滿足以下情況均可視為可疑變異，有可能為假陽性位點，必需要sanger測序驗證： 1）測序深度20； 2）考慮為雜合突變時，65%突變頻率35%；考慮為純合突變時，突變頻率90%； 3）同批次其它樣本（兩個及以上）譜圖中未見相同突變（不論突變頻率大?。?； 4）非復(fù)雜基因組結(jié)構(gòu)區(qū)。醫(yī)學(xué)外顯子組主要覆蓋區(qū)域為單基因遺傳病相關(guān)基因的外顯子編碼區(qū)和內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)的十幾個b