1、二代測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用,魏冬凱,概要,二代測序技術(shù)簡介 常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案 石蠟包埋樣本解決方案 CTC和ctDNA,二代測序技術(shù)簡介,人類基因組 Human Genome,30億對堿基來自母親 30億對堿基來自父親 線粒體基因組來自母親 與人類共生的微生物基因組,DNA的構(gòu)成,末端終止法測序,ABI 3700 (ABI 3730),人類基因組計劃(HGP),人類基因組計劃(human genome project, HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達30億美元的人類基因組計劃。按照這個計

2、劃的設(shè)想，最終要把人體內(nèi)約4萬個基因的密碼全部解開，同時繪制出人類基因的譜圖。換句話說，就是要揭開組成人體4萬個基因的30億個堿基對的秘密。人類基因組計劃與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學(xué)計劃。被譽為生命科學(xué)的“登月計劃”。,Celera Genomics,Craig Venter成立 第一個使用全基因組鳥槍法測序 使用330臺ABI 3700，購買當(dāng)時世界排名第三的服務(wù)器進行運算，花費3個月時間對Venter的基因組進行測序，得到20GB數(shù)據(jù)。,Ventor基因組測序,基于分子克隆，必須將DNA片段克隆至大腸桿菌中，否則無法測序。 每次末端終止反應(yīng)體系10ul，其中含有1013個D

3、NA分子，但每次只能測其中1條。 預(yù)計花費2億美金，最終花費30億美金！ 怎樣才能降低試劑消耗？,降低消耗的辦法,1. 將分子克隆替換成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），先給DNA片段加上尾巴。 橋式PCR 2. 降低反應(yīng)體積 把測序反應(yīng)裝到小的空間里去。 10ul的試劑做更多的DNA測序反應(yīng)。,降低消耗的辦法,1. 將分子克隆替換成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），先給DNA片段加上尾巴。 橋式PCR 2. 降低反應(yīng)體積 把測序反應(yīng)裝到小的空間里去。 10ul的試劑做更多的DNA測序反應(yīng)。,橋式PCR,二代測序（NGS）,邊合成邊測序（SBS）,Flowcell,SBS技術(shù)特點,讀長最初的時候只有31bp，

4、現(xiàn)已能達到600bp。 運行時間長，熒光信號會逐漸減弱。 每次只能結(jié)合1個堿基，發(fā)出一種熒光信號。,Hiseq 2500,可同時運行2張8通道flowcell 有高通量模式和快速模式2種模式。 單次運行數(shù)據(jù)量高達500GB。 快速模式最短運行時間17小時。,常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案,二代測序應(yīng)用醫(yī)療的可行性,NGS的優(yōu)勢,相比于一代測序，NGS更加省時低成本，速度快，覆蓋度深，準(zhǔn)確度高； 高通量測序人類基因組有助于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的未知基因； 對于疾病引起的基因突變，高通量測序可以為患者醫(yī)師提供更為準(zhǔn)確的診斷依據(jù)； 需求樣本類型廣泛，樣本量需求少。,常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案,全基因組重測序（WGRS

5、） 尋找個體突變，InDel，CNV，SV等等，需求數(shù)據(jù)量大，單個樣本需求90G數(shù)據(jù)。 全外顯子組測序（WES） 捕獲基因組中的全外顯子進行測序，測序數(shù)據(jù)量較WGRS少很多，并能獲得高測序深度（50X-150X）,常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案,靶向區(qū)域測序（Target Sequencing） 捕獲富集感興趣的靶向區(qū)域進行測序，技術(shù)流程與全外顯子捕獲相似，測序需求量較WES少，能獲得更高測序深度（最高500X） 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq） 研究轉(zhuǎn)錄水平上的測序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。,全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析

6、的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴大到全基因組范圍。通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略進行高通量測序，實現(xiàn)在全基因組水平上檢測疾病關(guān)聯(lián)的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價值。,全基因組重測序(WGRS/DNA-Seq),SNP（個體間差異） CNV（大片段基因拷貝數(shù)變異） InDel SV（結(jié)構(gòu)變異）,全基因組重測序的應(yīng)用,SNP(SNV),示例,為何研究SNP？,SNP目前已被公認為疾病發(fā)生的基因分子標(biāo)記。 SNP被認為是導(dǎo)致藥物差異化的主要因素之一，因此可以根據(jù)SNP的變化來進行個性化

7、用藥。 SNP分布廣泛，且較為穩(wěn)定。 某些SNP會直接影響功能基因表達。,大多數(shù)的SNP都是無用的,大多數(shù)的SNP屬于沉默突變。 非編碼區(qū)的錯義突變也不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生改變。,但也有例外,診斷實例： Dr. James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx從一個病危的十幾歲的男孩的腦脊液中抽提出核酸樣本，測了8百萬條核酸序列，從中檢出了475條鉤端螺旋體的序列，從而判定這個男孩的病是因為鉤端螺旋體感染。 Dr. James Gern依據(jù)上述的判斷，給男孩青霉素治療，治好了這個男孩的病。腦脊液是較難取得的體液，只能是采集很少的量，這就限制了所能得到的核酸總量。 鉤端螺旋體，

8、在病原體的常見程度排名中是較靠后的種類。在本案例中，如果用PCR方法，挨個排查病原體，可能還沒排到鉤端螺旋體，核酸就不夠了。但高通量測序克服了核酸量不夠的問題。 在本案例中，鉤端螺旋體DNA只占總DNA的萬分之0.6，含量極微，但經(jīng)過高通量測序，得到了475條鉤端螺旋體的DNA，這讓鉤端螺旋體無處循形。,2009年H1N1病毒爆發(fā)感染時，有一名病人死于呼吸系統(tǒng)引起的多器官衰竭，然而并不知道具體的死因?？茖W(xué)家把病人的肺部穿刺組織的DNA拿來做高通量測序。最終在950萬條序列中，含有0.85%的序列來自于H1N1病毒基因組，從而幫助科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了該病人的真正死因。在這樣高人類基因組干擾的背景下，目前

9、其他技術(shù)都難以快速發(fā)現(xiàn)致病病毒序列、以及分子分型。,Kuroda, M., Katano, H., Nakajima, N., Tobiume, M., Ainai, A., Sekizuka, T., Sata, T. (2010). PloS One, 5(4), e10256. doi:10.1371/journal.pone.0010256,Nimblegen (Roche) SureSelect(Agilent) RNA Oligo Trusight (Illumina),全外顯子測序（WES）,癌癥相關(guān)（人） 遺傳性疾?。ㄈ耍?其它非傳染性疾?。ㄈ耍?主要用于尋找罕見突變，遺傳性突

10、變及癌癥相關(guān)的體細胞突變 可以做SNP，InDel分析，但由于捕獲區(qū)域較短，一般不用于CNV，SV分析。,WES應(yīng)用領(lǐng)域,成本低（一般50-150X，也僅需要8-15G數(shù)據(jù)） 降低分析背景，容易發(fā)現(xiàn)稀有突變。 大約能測到50-80bp的片段缺失，由于外顯子捕獲芯片片段較短，很難判斷是由捕獲脫靶導(dǎo)致還是由缺失導(dǎo)致。 同樣因為捕獲芯片片段較短，一般不做CNV，SV分析。,WES特點,WES方案流程,包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。 可以高通量分析轉(zhuǎn)錄本信息，發(fā)現(xiàn)未知的轉(zhuǎn)錄本和基因注釋。 尋找個體間，同一個體不同時期等感興趣基因表達豐度變化。,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Se

11、q),mRNA-Seq方案,有關(guān)lncRNA的一些知識：,長度大于200bp 無法編碼蛋白 有內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū) 非編碼RNA具有調(diào)節(jié)基因表達的作用，如對染色體結(jié)構(gòu)的影響，對RNA加工修飾及穩(wěn)定性的影響，對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，甚至對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運及穩(wěn)定性都有一定的影響。 所以近年來，許多通過RNA-seq進行測序分析的文章都包括對lncRNA的分析，并且發(fā)現(xiàn)了許多新的lncRNA。,lncRNA-Seq,sRNA-Seq,RNA-seq的優(yōu)勢,不局限于已知的基因組序列信息，適用于未知基因組序列的物種的高通量轉(zhuǎn)錄組研究 相對于芯片技術(shù)，背景信號值低，沒有檢測上限，對于基因表達譜有非常寬的檢測范圍。在

12、有內(nèi)參的情況下，在定量方面顯示出了較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。 不需要克隆的步驟，操作簡單，需要的樣本量少，可在單細胞的水平上進行表達譜分析 通量高，成本比Tilling array或者大規(guī)模的EST測序要低。,RNA-seq的挑戰(zhàn),文庫構(gòu)建過程中大片段的RNA必須經(jīng)過片段化處理，會引入一定的偏倚。 PCR會造成表達量的變化。 海量短序列數(shù)據(jù)的比對或拼接情況復(fù)雜，對重復(fù)序列和多匹配序列的精確定位存在明顯問題。 高等真核生物可變剪接和反式剪接的鑒定仍有相當(dāng)?shù)恼`差。 測序深度的確定因物種、器官、組織、時期而變，很難有統(tǒng)一公式直接計算。,石蠟包埋樣本解決方案,FFPE樣本(石蠟包埋切片組織),石蠟包埋技

13、術(shù)（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE）是現(xiàn)今臨床上最常見的保存DNA方法，全球醫(yī)院的珍貴臨床樣本中超過80%都使用該技術(shù)保存，但由于該技術(shù)DNA經(jīng)過福爾馬林浸泡，使DNA分子發(fā)生交聯(lián)和酶修飾，導(dǎo)致DNA存在不同幅度的降解。,樣本量巨大，80%以上的臨床樣本都使用石蠟包埋保存 很多珍貴的臨床樣本已經(jīng)做過組織學(xué)，病理學(xué)研究，很容易完成相關(guān)實驗驗證,為何要使用FFPE樣本,難于抽提，福爾馬林處理后的DNA容易產(chǎn)生交聯(lián)，使提取出的DNA量偏低 提取出的DNA質(zhì)量低，通常降解200bp-5kb 降解程度與石蠟包埋的時間相關(guān),FFPE-WES的巨大挑戰(zhàn),

14、是否有相同突變?,目前無法用于WGRS，樣本降解嚴(yán)重，對DNA覆蓋度有很大影響。 DNA量過少，質(zhì)量很差。 石蠟包埋時間越長，福爾馬林對DNA交聯(lián)和損傷就越大。 未使用保護緩沖液處理的福爾馬林影響更大。,FFPE樣本仍存在問題,CTCS和ctDNA,什么是CTCs？,CTCs(Circulating Tumor Cells)自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞. CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中在血液循環(huán)系統(tǒng)中存活的腫瘤細胞，它的生成被認為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提。,CTCs研究意義,CTCs研究難點,CTCs并沒有顯著的特異性同其它血細胞明確區(qū)分 且不同組織學(xué)類型和分子表型的

15、腫瘤分別表達不同的標(biāo)志物。,CTCs在外周血中數(shù)量稀少，一般在106-107個白細胞中僅含有1個。,無顯著 特異性,數(shù)量少,CTCs的富集,通過細胞形態(tài)富集,微流芯片,密度梯度離心,Plasma:血漿 Mononuclear cell：單核細胞（包括淋巴細胞、 單核細胞、 上皮細胞和腫瘤細胞） Ficoll：密度梯度液 RBCs：紅細胞,免疫磁珠富集法,微流體,CTCs鑒定,流式細胞儀分析 (flow cytometry FCM),免疫細胞化學(xué)技術(shù) ICC （immunocytochemistry）,鑒定標(biāo)本中細胞抗原性和形態(tài)學(xué)特征，能使富集的目的細胞維持細胞形態(tài)并保持細胞活力,ICC是用能與顯色劑結(jié)合的單抗與 CTCs特異性結(jié)合后，通過顯色劑顯色從而對CTCs進行鑒定的技術(shù),通過分析上皮細胞或腫瘤細胞的正常起源組織特異的候選基因的表達來檢測 CTC, 靈敏度非常高但是壞死的癌細胞、上皮細胞污染等都可以造成假陽性結(jié)果，此法無法檢