1、.,1,IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)調(diào)控,.,2,1. 課題來源：,實驗步驟： 接種 擴(kuò)大培養(yǎng) IPTG誘導(dǎo) 蛋白提取、純化 思考： IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？,.,3,2. IPTG的作用原理,IPTG (isopropylthiog- alactoside,異丙基硫代半乳糖苷): 化學(xué)合成的乳糖類似物，很強的 半乳糖苷酶誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)乳糖操縱元(lac operon)的開放，自身不被催化分解。類似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)也是一種人工化學(xué)合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal都被廣泛應(yīng)用在

2、分子生物學(xué)和基因工程的工作中。,.,4,2. IPTG的作用原理,.,5,2.1 乳糖操縱元（lac operon）,大腸桿菌利用乳糖至少需要需要兩個酶：促使乳糖進(jìn)入細(xì)菌的乳糖透過酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶( -galactosidase)。 在環(huán)境中沒有乳糖或其他-半乳糖苷時，大腸桿菌合成-半乳糖苷酶量極少，加入乳糖或其類似物2-3分鐘后，細(xì)菌大量合成 -半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作為唯一碳源時，菌體內(nèi)的-半乳糖苷酶量可占到細(xì)菌總蛋白量的3%。,.,6,2.1 乳糖操縱元（lac operon）,乳糖操縱元含有、和3個結(jié)構(gòu)基因。基因

3、表達(dá)產(chǎn)物為 -半乳糖苷酶，催化乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖(allolactose)，再分解為半乳糖和葡萄糖；基因編碼半乳糖透過酶，促使環(huán)境中的乳糖進(jìn)入細(xì)菌；基因編碼轉(zhuǎn)乙?；?，以二聚體活性形式催化半乳糖的乙?；?。,.,7,2.1 乳糖操縱元（lac operon）,.,8,2.1 乳糖操縱元（lac operon）,基因5側(cè)具有大腸桿菌核糖體識別結(jié)合位點（ribosome binding site，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而當(dāng)乳糖操縱元開放時，核糖體能結(jié)合在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA上。,.,9,由于、三個基因頭尾相接，上一個基因的翻譯終止碼靠近下一個基因的翻譯起始碼，因而同一個核糖

4、體能沿此轉(zhuǎn)錄生成的多順反子（polycistron）mRNA移動，在翻譯合成了上一個基因編碼的蛋白質(zhì)后，不從mRNA上掉下來而繼續(xù)沿mRNA移動合成下一個基因編碼的蛋白質(zhì)，一氣依次合成這基因群所編碼所有的蛋白質(zhì)。,2.1 乳糖操縱元（lac operon）,.,10,2.2 乳糖操縱元（lac operon）的負(fù)調(diào)控,操縱子（o）序列位于啟動子（p）與被調(diào)控的基因之間，部分序列與啟動子序列重疊。 在乳糖操縱元中，調(diào)控基因lac I位于Plac鄰近，有其自身的啟動子和終止子，轉(zhuǎn)錄方向和結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄方向一致，編碼產(chǎn)生由347個氨基酸組成的調(diào)控蛋白R。,.,11,2.2 乳糖操縱元（lac op

5、eron）的負(fù)調(diào)控,.,12,2.2 乳糖操縱元（lac operon）的負(fù)調(diào)控,當(dāng)大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時，lac操縱元處于阻遏狀態(tài)。此基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成性表達(dá)產(chǎn)生阻遏蛋白R，每個細(xì)胞中僅維持約10個分子的阻遏蛋白。 R以四聚體形式與操縱子結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結(jié)合，阻止了基因的轉(zhuǎn)錄起動，從而阻遏了這群基因的表達(dá)。,.,13,2.2 乳糖操縱元（lac operon）的負(fù)調(diào)控,.,14,2.2 乳糖操縱元（lac operon）的負(fù)調(diào)控,當(dāng)環(huán)境中有足夠的乳糖時，乳糖受-半乳糖苷酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，別乳糖與R結(jié)合，使R的空間構(gòu)像變化，四聚體

6、解聚成單體，失去與操縱子特異性緊密結(jié)合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以轉(zhuǎn)錄合成利用乳糖的酶類，半乳糖苷酶在細(xì)胞內(nèi)的含量可增加1000倍。這就是乳糖對lac操縱元的誘導(dǎo)作用。,.,15,2.2 乳糖操縱元（lac operon）的負(fù)調(diào)控,在這過程中乳糖（實際起作用的是別乳糖）就是誘導(dǎo)劑，與R結(jié)合起到去阻遏作用（derepression），誘導(dǎo)了利用乳糖的酶類基因轉(zhuǎn)錄開放,.,16,2.3 乳糖操縱元（lac operon）的正調(diào)控,細(xì)菌中的cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關(guān)，當(dāng)細(xì)菌利用葡萄糖分解產(chǎn)生能量時，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，當(dāng)環(huán)境中無葡萄糖可供利用時

7、，cAMP含量就升高。,.,17,2.3 乳糖操縱元（lac operon）的正調(diào)控,細(xì)菌中有一種能與cAMP特異結(jié)合的cAMP受體蛋白CRP（cAMP receptor protein），當(dāng)CRP未與cAMP結(jié)合時它是沒有活性的，當(dāng)cAMP濃度升高時，CRP與cAMP結(jié)合并發(fā)生空間構(gòu)象的變化而活化，稱為CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚體的方式與特定的DNA序列結(jié)合。,.,18,2.3 乳糖操縱元（lac operon）的正調(diào)控,.,19,2.3 乳糖操縱元（lac operon）的正調(diào)控,在lac操縱元的啟動子Plac上游端有一段序列與Plac部分重疊

8、的序列，能與CAP特異結(jié)合，稱為CAP結(jié)合位點（CAP binding site）。CAP與這段序列結(jié)合時，可增強RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，使轉(zhuǎn)錄提高50倍。相反，當(dāng)有葡萄糖可供分解利用時，cAMP濃度降低，CRP不能被活化，lac操縱元的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)下降。,.,20,2.3 乳糖操縱元（lac operon）的正調(diào)控,由于Plac是弱啟動子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱元轉(zhuǎn)錄開放，還不能使細(xì)菌很好利用乳糖，必需同時有CAP來加強轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)菌才能合成足夠的酶來利用乳糖。 lac操縱元的強誘導(dǎo)既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。通過這機制，細(xì)菌是優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無葡

9、萄糖而又有乳糖時，細(xì)菌才去充分利用乳糖。,.,21,2.3 乳糖操縱元（lac operon）的正調(diào)控,不難看出：CAP結(jié)合位點就是一種起正性調(diào)控作用的操縱子，CAP則是對轉(zhuǎn)錄起正性作用的調(diào)控蛋白激活蛋白，編碼CRP的基因也是一個調(diào)控基因，不過它并不在lac操縱元的附近，CAP可以對幾個操縱元都起作用。 從上所述，乳糖操縱元屬于可誘導(dǎo)操縱元（inducible operon），這類操縱元通常是關(guān)閉的，當(dāng)受效應(yīng)物作用后誘導(dǎo)開放轉(zhuǎn)錄。這類操縱元使細(xì)菌能適應(yīng)環(huán)境的變化，最有效地利用環(huán)境能提供的能源底物。,.,22,3 乳糖操縱元在外源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用,運用乳糖操縱元控制外源蛋白表達(dá)的目的： 在需要菌

10、體大量繁殖時，為了提供更多的物質(zhì)和能量確保菌體正?？焖俚纳L，需要將外源基因關(guān)閉。 菌體濃度達(dá)到要求時，可通過誘導(dǎo)使菌體表達(dá)大量外源蛋白。,.,23,3 乳糖操縱元在外源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用,在我們所使用的PGEX載體中，插入了乳糖操縱元的調(diào)控基因lac Iq和啟動子Plac ，其后緊接GST基因、外源基因。 這些基因頭尾相接，上一個基因的翻譯終止碼靠近下一個基因的翻譯起始碼，因而同一個核糖體能沿此轉(zhuǎn)錄生成的多順反子mRNA移動，在翻譯合成了上一個基因編碼的蛋白質(zhì)后，不從mRNA上掉下來而繼續(xù)沿mRNA移動合成下一個基因編碼的蛋白質(zhì)，一氣依次合成這基因群所編碼所有的蛋白質(zhì)。,.,24,vector information,MCS region,3 乳糖操縱元在外源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用,.,25,3 乳糖操縱元在外源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用,IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)載體必須以過表達(dá)lac阻遏物的大腸桿菌為宿主，才能阻止外源基因在誘導(dǎo)前的轉(zhuǎn)錄。由于大多數(shù)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)質(zhì)?？截悢?shù)很高（30600），因此需要過量阻遏物才能阻斷基礎(chǔ)表達(dá)（滲漏表達(dá)）。單拷貝的lac Iq等位基因可以表達(dá)過量10倍的lac阻遏物但是，如果外源蛋白對宿主的毒性非常強，或者質(zhì)粒拷貝數(shù)非常高，就需要將lac Iq等位基因克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒，確保緊密調(diào)節(jié)。,