1、.,第三節(jié)免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理,抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體或利用已知的抗體檢測(cè)未知的抗原 . 將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測(cè)試技術(shù)結(jié)合 超微量的檢測(cè),.,.,免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),高度的靈敏性 高度的特異性,.,免疫分析技術(shù)的應(yīng)用,常用的診斷技術(shù) 血凝試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 膠體金免疫技術(shù) 放射免疫分析技術(shù),.,凝集試驗(yàn),概念：顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。 1.直接凝集反應(yīng) 抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性結(jié)果。 玻片直接凝集法：定性試驗(yàn) 試管直接凝集法：半定量試驗(yàn),.,試管法半定量試驗(yàn),.,2.間接凝集法,先

2、將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上(如RBC, 乳膠顆粒)，再與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)，出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性結(jié)果。 臨床常用的有間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)等。,待檢樣品,抗原吸附血球或乳膠顆粒,反應(yīng)凝集物,.,3.間接凝集抑制試驗(yàn),先將待檢抗原與已知的抗體反應(yīng)，再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性結(jié)果。,例：乳膠凝集抑制試驗(yàn)檢測(cè)HCG (妊娠診斷),步驟1：將已知抗體與待檢標(biāo)本混勻,步驟2：加入抗原吸附的乳膠顆粒混勻,抗原吸附乳膠顆粒,結(jié)果判斷：,不凝集為陽(yáng)性結(jié)果,已知抗體,待檢標(biāo)本,.,凝集反應(yīng),.,2.沉淀反應(yīng),概念：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應(yīng)。,類型： 單向免疫擴(kuò)散

3、,免疫比濁法,雙向免疫擴(kuò)散,對(duì)流免疫電泳,.,單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),.,雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),.,對(duì)流免疫電泳,.,測(cè)吸光度計(jì)算抗原或抗體的含量,抗體,抗原,免疫復(fù)合物的濃度與透射光的衰減呈正相關(guān),免疫比濁法原理,.,3.中和反應(yīng) 如抗“O”試驗(yàn),4.免疫標(biāo)記技術(shù),概念：用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原用以測(cè)定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。常用方法有免疫熒光技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫檢測(cè)技術(shù)等。 特點(diǎn)：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。,.,免疫標(biāo)記技術(shù),酶免疫標(biāo)記技術(shù) 熒光免疫分析技術(shù) 放射免疫分析技術(shù) 免疫金標(biāo)記技術(shù),.,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perl

4、mann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA),.,酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng).,.,.,2、標(biāo)記方法 戊二醛交聯(lián)法 過(guò)碘酸鹽氧化法,.,戊二醛交聯(lián)法 (一步法）,抗體-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,

5、抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗體,酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,.,戊二醛交聯(lián)法（二步法）,COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗體-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,.,過(guò)碘酸鹽氧化法,NaIO4,O,O,OH,+ NH2抗體,O,O,O,N,N,抗體,抗體,H2O,N,抗體,NaBH4,Schiff堿,酶-五炭糖環(huán),.,標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析 2

6、、鑒定 抗體活性 酶活性 標(biāo)記物純度,.,ELISA的種類和變化,（一）雙抗體夾心法 （二）間接法 （三）競(jìng)爭(zhēng)法 （四）雙位點(diǎn)一步法 （五）捕獲法測(cè)IgM抗體 （六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA,.,.,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,.,獲得待分析物的未標(biāo)定抗體,將特異性抗體與固相 載體連接形成固相抗體,洗滌除去未結(jié)合的 抗體及雜質(zhì),加入封閉蛋白溶液以封閉載體 表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn),洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,加受檢標(biāo)本（抗原）形成 固相抗體抗原復(fù)合物,洗滌除去其他 未結(jié)合的物質(zhì),加酶標(biāo)抗體生成 抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)記抗體 的復(fù)合物,徹底洗滌 未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體,加

7、底物進(jìn)行 酶催化反應(yīng),根據(jù)顏色反應(yīng)的 程度進(jìn)行該抗原 的定性或定量測(cè)定,.,間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,.,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA-間接法),.,包被固相載體: 用已知抗原包被 固相載體,加待檢標(biāo)本: 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合 洗滌，除去無(wú)關(guān)的物質(zhì),加酶標(biāo)抗抗體: 與固相載體上抗原抗體 復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去 未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體,加底物 顯色,根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行 該抗原的定性或定量測(cè)定,.,（三）競(jìng)爭(zhēng)法,此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體 。,.,用已知特異性 抗體包被 固相載體,

8、測(cè)定管加待測(cè)抗原和 一定量的酶標(biāo)抗原使二者與 固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原 與固相抗體直接結(jié)合,分別洗滌 除去未結(jié)合 的成分,加底物顯色,分別測(cè)定兩管的吸光度值， 根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比， 計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量,.,對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。,.,飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定 飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素， 簡(jiǎn)曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢 （

9、如沙門(mén)氏菌 ）,甲胺磷殘留分析 甲基對(duì)硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析,ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用,ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè),.,河豚毒素,植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素,苯并芘,主要有除草劑與殺蟲(chóng)劑兩大類 例如殺暝松（ FN ）、 甲氟磷酸異已酶（ SOMAN ）、 草不綠（ Alachor ）、 西維因（ Carbaryl ）、 多菌靈及克菌丹（ Captan ）等。,農(nóng)藥的檢測(cè)：,.,食源性病原菌檢測(cè)試劑盒,大腸桿菌檢測(cè) 沙門(mén)氏菌檢測(cè) 單增李斯特菌 金黃色葡萄球菌,.,轉(zhuǎn)基因成份的檢測(cè)：如轉(zhuǎn)基因玉米中中的cry9e蛋白轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白質(zhì) 肉制品的摻假檢測(cè)： 以

10、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記不同動(dòng)物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測(cè)14種畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在摻假率為1%時(shí)即可檢出,食品其他檢測(cè)：,.,熒光抗體技術(shù)的原理與方法,用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的IC可散發(fā)出熒光，對(duì)標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行測(cè)定和定位。 常用的熒光素 異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)等。 常用的方法 直接熒光法 間接熒光法,.,免疫熒光技術(shù),.,免疫熒光技術(shù)直接法,.,免疫熒光技術(shù)間接法,.,免疫熒光技術(shù),.,熒光顯微鏡,.,熒光顯微鏡使用原理,激發(fā)濾片（BG）,吸收濾片（OG）

11、,標(biāo)本,FITC吸收光峰值：490-495nm FITC發(fā)射光峰值：520-530nm BG：325-500 OG：410-650,.,免疫金標(biāo)記技術(shù),免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogold silver staining，IGSS）。,.,一、膠體金制備,膠體金（colloidal gold）的制

12、備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（gold solution）。,.,膠體金的制備及特性,*還原100 ml0.01%HAuCl4 所需量,.,膠 體 金（Colloidal Gold） 1560 nm,優(yōu) 質(zhì),劣 質(zhì),.,膠體金結(jié)合物（Conjugate）,.,一、免疫滲濾測(cè)定(IFA),.,斑點(diǎn)滲漏法,其原理與層析法相類同，中心圓點(diǎn)為一株單抗，邊上小點(diǎn)為抗鼠二抗。先將待測(cè)樣品滴在其中，若有抗原即被結(jié)合在中心圓點(diǎn)，洗去未結(jié)合抗原，再滴加金標(biāo)另一株單抗，若有抗原則形

13、成金-Ab-Ag薄膜的紅色斑點(diǎn)，而邊上是金-Ab-Ab2薄膜的質(zhì)控點(diǎn)，是為金標(biāo)二步法。,.,IFA雙抗體夾心法測(cè)抗原,.,IFA結(jié)果判斷,.,二、免疫層析測(cè)定（ ICA ）,.,層析法,將金標(biāo)的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標(biāo)單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應(yīng)抗原，既形成Ag-Ab-金復(fù)合物，當(dāng)上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株單抗結(jié)合并被固定下來(lái)，顯示陽(yáng)性結(jié)果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標(biāo)單抗上行此處即被固定下來(lái)，作為金標(biāo)單抗質(zhì)控的提示。此種方法稱金標(biāo)一步法。,.,兔抗鼠IgG,鼠抗HCG單抗,金標(biāo)鼠抗HCG單抗,尿液浸濕標(biāo)志線,手持端,斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)

14、（一）,.,斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（二）,尿樣,陽(yáng)性,弱陽(yáng)性,陰性,無(wú)效,質(zhì)控線,測(cè)試線,.,ICA雙抗體夾心法測(cè)抗原,.,ICA- 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,免疫層析試驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原原理圖,.,ICA 竟?fàn)幏ńY(jié)果觀察,陰性,陽(yáng)性,無(wú)效,.,ICA間接法測(cè)抗體,.,ICA 結(jié)果觀察,陽(yáng)性,陰性,無(wú)效,.,IFA與ICA的比較,.,IFA 穿流（FLOW THROUGH） ICA 橫流（LATERAL FLOW）,.,1、 羅立新, 繆瓏, 潘力, 等. 快速檢測(cè)產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究J. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006, 16(2): 154-156. 2、 賴衛(wèi)華, 熊勇華, 陳高明, 等

15、. 應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測(cè)赭曲霉毒素A的研究J. 食品科學(xué), 2005, 26(5): 204-207.,.,3、 諶志強(qiáng), 段惠莉, 王新為, 等. 大腸埃希菌O157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測(cè)J. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2005, 21(4): 705-706. 4、 謝昭聰, 宋志強(qiáng), 呂敬章, 等. 應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究J. 中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志, 2005, 28(3): 163-165.,.,5、 王中民, 李君文, 王新為, 等. 免疫金滲濾試驗(yàn)檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的研究J. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2001, 29(4): 45-47. 6、劉永德, 汪毅,

16、 陳禹雷, 免疫金探針快速檢測(cè)禽流感病毒研究J. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2005, 23(3): 321-324.,.,斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn),A,D,C,B,陰性（未懷孕）,陽(yáng)性（懷孕）,加尿樣,除去濾器,加膠體金標(biāo)記抗體,加洗滌液,結(jié)果判定,.,免疫印跡法圖解,SDS裂解病毒,聚丙酰胺凝膠電泳,-,+,95 68 45 12KD,電轉(zhuǎn)印至NC膜上,置待測(cè)血清中，漂洗；加酶標(biāo)抗抗體，漂洗；,加底物 顯色,120 41 24KD,.,第四節(jié) 放射性核素標(biāo)記技術(shù),一、常用標(biāo)記方法 二、標(biāo)記免疫物的分離與純化,.,R：放射性核素示蹤 高靈敏 不直接探測(cè)待測(cè)物，而探測(cè)待測(cè)物上的標(biāo)記信號(hào) (標(biāo)

17、記物的放大效應(yīng)) I：免疫學(xué)反應(yīng) 高特異 廢除以往沿用的無(wú)機(jī)或有機(jī)試劑，代之以抗體為結(jié)合劑,.,常用標(biāo)記方法,1、常用放射性核素 2、125I 的標(biāo)記方法 直接法（氯胺T法） 間接法（連接法）,.,直接法（氯胺T法）,Na125I 4。C,125I,氯胺T,.,間接法（連接法）,+ Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,.,間接法（連接法）,CH2,OH,H-C-C-N-蛋白質(zhì),H O H,+ NH2-蛋白質(zhì),125I,125I,.,標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析 2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）,.,結(jié)合相,游離相,放射免疫分析法的原理與方法,.,液閃儀,.,計(jì)數(shù)器,.,化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫技術(shù),直接化學(xué)發(fā)光 酶促化學(xué)發(fā)光特點(diǎn) 電化學(xué)發(fā)光特點(diǎn),.,標(biāo)記免疫分析三方式與四環(huán)節(jié),三個(gè)方式 A、直接法 B、間接法 C、夾心法 四環(huán)節(jié)為： 1、抗體生產(chǎn) 2、 標(biāo)記試劑制