1、選修生物技術(shù)實踐知識清單2.1微生物的實驗室培養(yǎng)1、培養(yǎng)基 （1）培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)主要分為 （主要用于工業(yè)生產(chǎn)）和 （主要用于菌種的分離、計數(shù)、鑒別）。只有 培養(yǎng)基表面可以形成“菌落”。菌落的概念是 ，不同菌落的 不同，因此，菌落是 的重要依據(jù)。 （2）按照培養(yǎng)基的功能，可將培養(yǎng)基分為 培養(yǎng)基和 培養(yǎng)基。 （3）培養(yǎng)基的化學(xué)成分一般包括 等，除此之外，還需要滿足微生物對 、 和 的需求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要添加的特殊營養(yǎng)物質(zhì)是 。牛肉膏能為微生物提供的主要營養(yǎng)是 ，蛋白胨能為微生物提供的主要營養(yǎng)是 。2、無菌技術(shù)（1） 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是 ，要注意以下幾個方面： 對實驗操作的空間、操

2、作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和 （消毒/滅菌）。 將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行 （消毒/滅菌）。 為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在 進(jìn)行。 實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品 。（2）消毒與滅菌的區(qū)別 消毒指使用 方法殺死 （全部/部分）微生物。消毒方法常用 、 、 、 。對于牛奶的消毒，應(yīng)使用 法，該方法的優(yōu)點是 ；對于接種室或工作臺，可以用 消毒，在此之前，可適量噴灑 來加強(qiáng)消毒效果。 滅菌指使用 因素殺死 （全部/部分）微生物，包括 和 。滅菌方法有 、 、 。（3）常用器具的滅菌消毒方法： 接種環(huán)、接種針和其他金屬用具使用 滅菌法； 玻璃器皿、金

3、屬用具等可使用 滅菌法，所用器械是 ； 培養(yǎng)基使用 法，所用器械是 。 殺死物體表面和空氣中的微生物可使用 消毒法。3制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 （1）方法步驟： 。 （2）思考討論： “溶化”步驟中，加熱熔化瓊脂時需要不斷用玻璃棒攪拌，攪拌目的是什么？ 答： 。 平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 答： 。 拓展：培養(yǎng)細(xì)菌時，需要將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為什么？ 答： 。4、純化大腸桿菌（純化的目的：獲得單菌落） （1）能獲得單菌落的接種方法是 。 （2）“稀釋涂布平板法”包括 操作和 板操作兩步。 （3）平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的共性： 。 （4）平板劃線操作灼燒的目的: 首次劃

4、線前灼燒接種環(huán)的目的是： 。 第二次及以后劃線前灼燒接種環(huán)的目的是： 。 劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)的目的是： 。 第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線的原因是： 。 （5）平板劃線法獲得的菌落分布 ， （能/不能）計數(shù)；稀釋涂布平板法獲得的菌落分布 ， （能/不能）計數(shù)。5、菌種的保存 （1）臨時保存：將菌種接種到 上，待 后放在 冰箱中保藏。這種保存方法的缺點是 。該方法用于 的菌種的保存。 （2）長期保存：可采用 法，在 冷凍箱中保存。2.2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)一、菌種的分離 1、尋找目的菌株方法：尋找目的菌株時，要根據(jù)目的菌株對 的要求，到 去尋找。實例：若要尋找“尿素

5、分解菌”，應(yīng)在 的土壤中去尋找；若要尋找“纖維素分解菌”，應(yīng)在 的環(huán)境中去尋找；若要尋找“石油分解菌”，應(yīng)在 的環(huán)境中去尋找。2、篩選出“尿素分解菌”選擇性培養(yǎng)基：是指 培養(yǎng)基。篩選“尿素分解菌”的選擇培養(yǎng)基的特點是 。二、細(xì)菌的計數(shù)（一）統(tǒng)計菌落的數(shù)目（間接計數(shù)法）1、方法： 。2、原理：當(dāng)樣品的稀釋度 時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的1個活菌，通過統(tǒng)計平板上的 數(shù)，就能推測出樣品中大約有多少活菌。（為保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 的平板進(jìn)行計數(shù)。）3、【問題探討】請根據(jù)所學(xué)知識回答以下問題有2位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基

6、中，得到以下2種統(tǒng)計結(jié)果：甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230；乙同學(xué)在該濃度下涂布了3個平板統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，并且取平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果；請評價這兩位同學(xué)的實驗結(jié)果的有效性 甲同學(xué)操作 （合理/不合理），原因是 ； 乙同學(xué)的結(jié)果 （合理/不合理），原因是 ； 正確做法是：在設(shè)計實驗時，一定要涂布 個平板作為重復(fù)組，才能減小實驗誤差并增強(qiáng)實驗的說服力與準(zhǔn)確性在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否相當(dāng)，結(jié)果差距太大，意味著 ，需要 。4、稀釋涂布平板法的計數(shù)公式： 每克樣品中的菌株數(shù) =（CV） M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的 ，

7、V代表 ，M代表 ?！纠}】（14全國卷節(jié)選）某研究小組為測定某河流水樣中的細(xì)菌含量，將1ml水樣稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接種0.1ml稀釋液，培養(yǎng)后在3個平板上的菌落數(shù)分別是39、38和37，據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為 個。5、方法評價：稀釋涂布平板法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目 ，這是因為： 。（二）統(tǒng)計細(xì)菌的數(shù)目（直接計數(shù)法）1、方法： 。2、計數(shù)工具： 。3、計算公式：1ml培養(yǎng)液中酵母菌數(shù) = 大方格總菌數(shù) 大方格總體積 稀釋倍數(shù)4、方法評價：顯微鏡計數(shù)法統(tǒng)計的細(xì)菌數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目 ，這是因為： 。三、設(shè)置對照1、設(shè)置對照的目的：主要是排除 對實驗結(jié)果的影

8、響，提高實驗結(jié)果的可信度。2、微生物培養(yǎng)的常用對照設(shè)置方法：判斷培養(yǎng)基是否被污染的對照設(shè)置方法：將接種后的培養(yǎng)基與1個 放在相同且適宜條件下培養(yǎng)，觀察對照組的培養(yǎng)基上是否有菌落生長。判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用的對照設(shè)置方法：將同一土壤樣品分別接種在 培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基上，然后在相同且適宜條件下培養(yǎng)，觀察比較二者的菌落數(shù)目。四、實驗流程1、土壤取樣 富含有機(jī)質(zhì)的土壤 2、 樣品的稀釋 常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在 之間、 計數(shù)的平板3、接種 采用 法接種 細(xì)菌： 培養(yǎng) 天；4、培養(yǎng) 放線菌： 培養(yǎng) 天； 霉菌： 培養(yǎng) 天；5、觀察 根據(jù)菌落特征區(qū)分微生物，這些特征包

9、括菌落的 。 6、 統(tǒng)計 每隔 小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)，選取 的記錄作為結(jié)果， 這樣可以防止 而導(dǎo)致 。7、計算 稀釋涂布平板法的計數(shù)公式： 每克樣品中的菌株數(shù) = 。五、菌種鑒定1、尿素分解菌的鑒定：為鑒定分離的細(xì)菌是否具有分解尿素的能力，可以在培養(yǎng)基中加入 ，若該細(xì)菌具有分解尿素的能力，則將導(dǎo)致培養(yǎng)基PH值 ，菌落周圍出現(xiàn) ，這是因為細(xì)菌合成的 將尿素分解成 ，使培養(yǎng)液 性增強(qiáng)；菌落周圍的環(huán)帶越大，說明 。2、大腸桿菌的鑒定：鑒定大腸桿菌可在培養(yǎng)基中加入 ，如果培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn) 色，則說明該菌落為大腸桿菌的菌落。 2.3分解纖維素的微生物的分離一、纖維素與纖維素酶 1、纖維素：一種由 首尾相連

10、而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。 2、纖維素酶： 是一種復(fù)合酶，包括 。 作用：“C1酶和CX酶”能將 分解成 ，“葡萄糖苷酶”將 分解成 。二、纖維素分解菌的篩選 1、篩選方法： 。能夠通過 反應(yīng)直接對微生物進(jìn)行篩選。 2、篩選原理： 染料可以與纖維素、淀粉等多糖形成 ，但該染料并不和 發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，培養(yǎng)基中會出現(xiàn) 的現(xiàn)象。三、分離“分解纖維素的微生物”的實驗流程 1、步驟：土壤取樣選擇培養(yǎng) 將樣品涂布到 的培養(yǎng)基上 挑選 的菌落。 2、土壤取樣：選擇 的環(huán)境采取土樣。 3、選擇培養(yǎng)的目的是 ，此步是否需要

11、，應(yīng)根據(jù) 來確定。 4、剛果紅染色法種類：方法一：先 ，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。缺點是操作 ，加入剛果紅溶液會 ；其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是 的作用。NaCl溶液的作用：培養(yǎng)基不含CR，用NaCl溶液可以 ，這樣就會留下大大小小的透明圈。方法二：在 。優(yōu)點是操作 ，不存在 現(xiàn)象。缺點：淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生 酶的微生物出現(xiàn) 反應(yīng)；有些微生物具有 能力，長時間培養(yǎng)會 而形成透明圈，與纖維素分解菌不容易區(qū)分。四、課題延伸為確定初步篩選得到的是“纖維素分解菌”，還需要進(jìn)行 的實驗。纖維素酶發(fā)酵的方法有 發(fā)酵和 發(fā)酵兩種；纖維素酶的測定方法一般是采用對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的

12、 進(jìn)行定量測定。2.1微生物的實驗室培養(yǎng)1、 （1）液體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基 形狀、大小、顏色和隆起程度 菌種鑒定（2） 選擇 鑒別（3） 水、無機(jī)鹽、碳源、氮源 PH 特殊營養(yǎng)物質(zhì) O2 維生素 碳源、氮源、磷酸鹽和維生素 碳源、氮源、維生素2、 （1）防止外來雜菌入侵 消毒 滅菌 酒精燈火沿附近 相接觸（2） 較為溫和的物理或化學(xué) 部分 煮沸消毒法 、巴氏消毒法、化學(xué)藥劑消毒、紫外線消毒 巴氏消毒法 既可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶中的營養(yǎng)成分不被破壞 紫外線 石碳酸或煤酚皂溶液 強(qiáng)烈的物理因素 全部 芽孢 孢子 灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌 （3）灼燒 干熱 干熱滅菌箱

13、 高壓蒸汽滅菌 高壓蒸汽滅菌鍋 紫外線3、 （1）計算、稱量、溶化、調(diào)PH、分裝、滅菌、倒平板（2） 防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂 防止皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基造成污染、也可避免培養(yǎng)基中水分過快揮發(fā) 防止水分過快揮發(fā)、防止皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基影響微生物生長而難以形成單菌落、防止雜菌污染4、 （1）平板劃線法和稀釋涂布平板法（2）系列稀釋 涂布平板（3）使聚集在一起的細(xì)菌分布成單個細(xì)胞，以便于純化菌種 （4） 殺死菌種環(huán)上可能存在的雜菌 殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上存在的菌種，使下一次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，以便獲得單個細(xì)胞 避免

14、細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者 線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從末端開始劃線，能逐步稀釋細(xì)菌，最終能得到由單個細(xì)胞形成的單菌落（5） 不均勻 不能 均勻 能5、 （1）試管的固體斜面培養(yǎng)基 菌落形成 4 保存時間不長，菌種容易污染或產(chǎn)生變異 頻繁使用 （2）甘油管藏 -202.2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)一、菌種的分離1、生存環(huán)境 相對應(yīng)環(huán)境中 富含尿素 富含纖維素 被石油污染 2、允許特定種類微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的 以尿素為唯一碳源2、 細(xì)菌的計數(shù)(一)統(tǒng)計菌落的數(shù)目（間接計數(shù)法法）1、稀釋涂布平板法 2、足夠高 菌落數(shù) 30-3003、 不合理 沒有設(shè)置重

15、復(fù)實驗，結(jié)果不具有 不合理 一個計數(shù)結(jié)果與另外兩個相差較大至少3 操作有誤 重新實驗4、平均菌落數(shù) 涂布平板時所用的稀釋液的體積 稀釋倍數(shù) 3.8107 5、低 當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落（二）統(tǒng)計細(xì)菌的數(shù)目（直接計數(shù)法）1、顯微鏡計數(shù)法 2、 血細(xì)胞計數(shù)板 3、 多 顯微鏡下無法區(qū)分細(xì)菌的死活 。三、設(shè)置對照1、實驗組中非測試因素 2、未接種的培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體四、試驗流程1、表層 2、30-300 3、稀釋涂布平板法 4、30-37 1-2 25-28 5-7 25-28 3-45、性狀、大小、顏色、隆起程度6、24 菌落數(shù)目穩(wěn)定時 因培養(yǎng)時間不足 遺漏菌落數(shù)目 7、C/VM 五、菌種鑒定1、酚紅指示劑 升高 紅色環(huán)帶 脲酶 氨 堿 細(xì)菌分解尿素的能力越強(qiáng)2、伊紅美藍(lán) 黑2.3分解纖維素的微生物的分離一、纖維素與纖維素酶1、葡萄糖 2、C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶 纖維素 纖維二糖 纖維二糖 葡萄糖二、纖維素