1、副溶血性弧菌是一種廣泛分布于海水、海底沉積物、浮游生物、魚類和貝類中的海洋細(xì)菌，是由海產(chǎn)品引起的急性胃腸炎的重要致病菌之一，尤其是在夏季和秋季的沿海地區(qū)，常因食用含有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)品而導(dǎo)致爆炸性食物中毒。在非沿海地區(qū)，因食用被這種細(xì)菌污染的食物而中毒的人也時有發(fā)生。為確保食品衛(wèi)生和食品安全，根據(jù)副溶血性弧菌的特點，進(jìn)行了以下鑒別診斷試驗。第1節(jié)副溶血弧菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗方法一、檢驗方法(一)操作步驟1.分離培養(yǎng)：首先稱取25克樣品，加入225毫升3.5%滅菌鹽水，用勻漿器打碎或研碎，分別接種一個氯化鈉瓊脂平板和一個嗜鹽瓊脂平板，同時向100毫升增菌液中加入10毫升，在37放置8 16小時，然

2、后放在上述平板上分離，取出在37觀察18 24小時，挑出可疑菌落2.涂片鏡檢：對三糖鐵培養(yǎng)基上的可疑反應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，即底層變黃(葡萄糖產(chǎn)生酸，但不產(chǎn)生氣體)，上斜面保持不變(乳糖和蔗糖不分解)，是動態(tài)的，不產(chǎn)生硫化氫。3.耐鹽試驗：將上述可疑培養(yǎng)物接種不同濃度的鹽蛋白胨水(0%、3%、7%、10%)，在37培養(yǎng)24小時。對于那些不在無鹽和10%無鹽蛋白胨水中生長并且在3%和7%含鹽蛋白胨水中生長良好的人，繼續(xù)進(jìn)行以下相關(guān)試驗。4.生化試驗：接種下列生化培養(yǎng)基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛藍(lán)基質(zhì)、釩磷、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫和溶血試驗，37培養(yǎng)。除了培養(yǎng)48小時并加入試

3、劑的釩磷、靛藍(lán)基質(zhì)和甲基紅，結(jié)果在24小時內(nèi)觀察到。5.動物實驗：將符合各種反應(yīng)的副溶血弧菌接種3.5%氯化鈉蛋白胨水，在37培養(yǎng)16 18小時，然后腹腔注射0.3毫升，觀察2 3天。解剖并分離死老鼠進(jìn)行培養(yǎng)。(2)檢查程序圖6-1副溶血弧菌檢驗程序二、結(jié)果分析判斷及注意事項(a)樣本處理取樣時，應(yīng)首先注意準(zhǔn)備消毒器具和容器。代表性樣品應(yīng)通過無菌程序采集。樣品應(yīng)盡快送去檢驗，不應(yīng)存放太久。副溶血性弧菌在合適的溫度下繁殖迅速，但不適合在低溫下存活。在寒冷的條件下很容易死亡，以防止被檢查的材料凍結(jié)，以免影響檢查結(jié)果。有時，由于儲存條件的影響(如低溫冷凍或干燥時間過長)，細(xì)菌會受到傷害，因此有必要對

4、這類可疑食品或可疑有毒物質(zhì)進(jìn)行富集培養(yǎng)。但是，應(yīng)該注意的是，為了便于細(xì)菌的回收，不建議選擇具有強(qiáng)抑制作用的培養(yǎng)基，否則會影響細(xì)菌的生長。富集8 16小時后，將樣品轉(zhuǎn)移到平板上進(jìn)行分離，選擇可疑菌落接種在含3.5%鹽的三糖鐵培養(yǎng)基中。此時，所選菌落的數(shù)量不應(yīng)少于5個，尤其是在夏季，當(dāng)海鮮混合時，相互污染嚴(yán)重，并且有時存在大量不同類型的細(xì)菌以防止泄漏檢測。(2)形態(tài)和染色革蘭氏陰性非芽孢桿菌，易呈多種形式，如棒狀、弧形、橢圓形、球形、絲狀等。排列不規(guī)則，多為散生，偶有成雙排列，一般大小為0.3 0.7 um 1 2 um，一端有鞭毛，動態(tài)，活躍，兩端密集染色，在固體培養(yǎng)條件下可生長外圍鞭毛。(三)

5、文化的特征它可以在普通瓊脂培養(yǎng)基和普通液體培養(yǎng)基中生長，但不能在無鹽條件下生長。它在含2% 3%氯化鈉的培養(yǎng)基中生長最旺盛，當(dāng)氯化鈉溶液濃度達(dá)到10%以上時不繁殖。在肉湯、蛋白胨水和其他液體培養(yǎng)基中混濁生長，具有很強(qiáng)的有氧能力，經(jīng)常在液體表面形成細(xì)菌膜。在液體培養(yǎng)條件下，細(xì)菌大多生長成單鞭毛，并主動運行。在固體培養(yǎng)基上，菌落通常是凸起的，圓形，稍混濁和不透明，表面光滑濕潤，無色素。在新鮮的潮濕或軟瓊脂培養(yǎng)基上，一些副溶血弧菌可以形成不規(guī)則的菌落或呈片狀擴(kuò)散，并可以在含0.7%以上瓊脂的培養(yǎng)基上生長外周鞭毛(側(cè)毛)。一般來說，2025培養(yǎng)的鞭毛相對穩(wěn)定，而37或24小時以上培養(yǎng)的鞭毛容易自然脫落

6、。有鞭毛的菌株大多在固體培養(yǎng)基上呈擴(kuò)散生長，而有單鞭毛的菌株是固體培養(yǎng)基上的典型菌落，但不呈擴(kuò)散生長。培養(yǎng)基的不同條件，如成分、類型、溫度、濕度等。會影響擴(kuò)散生長，而菌落形態(tài)也很容易受條件的影響而改變。例如，它通常在嗜鹽菌平板上生長良好，而在SS瓊脂平板上它主要是一個小的扁平菌落，很難被攪動。當(dāng)溶血環(huán)在血液修復(fù)中快速生長時會出現(xiàn)，它們是BCBS(硫代硫酸鹽、檸檬酸鹽、膽鹽、蔗糖)和氯化鈉蔗糖瓊脂平板上的淺藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落。一般來說，從腹瀉患者中分離出的大多數(shù)細(xì)菌在初始階段都是典型的菌落。當(dāng)細(xì)菌長時間儲存或條件不合適時，菌落通常變得粗糙，形狀不規(guī)則或菌落解離，其中一些沉淀并在液體培養(yǎng)物中生長。生

7、長范圍為510，最適pH為7.28.2，最適發(fā)育溫度為3037。(4)生化特性該細(xì)菌可以從葡萄糖中產(chǎn)生酸，而不產(chǎn)生氣體、乳糖和蔗糖、甘露醇、靛藍(lán)基質(zhì)和硫化氫。甲基紅為陽性，V-P為陰性，賴氨酸為陽性，精氨酸為陰性，鳥氨酸為陽性，少數(shù)為陰性，溶血為陽性，少數(shù)為非溶血性。主要生化特性見表6-1。近年來，隨著細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)研究的深入和檢驗技術(shù)的進(jìn)步，一些海水嗜鹽弧菌已逐漸被人們所認(rèn)識，其主要生化特性與副溶血弧菌的比較見表6-2。表6-1副溶血弧菌的主要生化特性項目項目耐鹽性0%-甲基紅+7%+v .p-10%-靛藍(lán)基質(zhì)+葡萄糖產(chǎn)生酸+賴氨酸+葡萄糖產(chǎn)生氣體-鳥氨酸+/-蔗糖-精氨酸-甘露醇+溶血的+/-

8、硫化氫-注：積極；-否定的；大多數(shù)是積極的，少數(shù)是消極的。表6-2副溶血弧菌與其他弧菌的鑒別細(xì)菌名稱氧合酶葡萄糖產(chǎn)氣賴氨酸酸精制氨酸鳥氨酸靛藍(lán)堿樹膠液化v！p乳糖甘蔗糖乙二醇肌肉酒精阿拉博糖甘露糖鼠李糖-半乳糖苷硝酸鹽游泳鹽蛋白胨水，%06810副溶血性弧菌+-+-+-+-d+-+d-+-溶藻弧菌v .溶藻弧菌+-+-+-+-+-+-+dO1霍亂弧菌v .霍亂弧菌o1 EO 1+-+-+d(d)+-+-+-d-非o1霍亂弧菌+-+-+d(d)+-d-+d+d-最小弧菌v .最小弧菌+-+-+-(d)-+-+-+-+d-弧菌弧菌+d-+-d+-+-+dd+-+d創(chuàng)傷弧菌v .創(chuàng)傷弧菌+-+-+-

9、+dd-+-+-d-弧菌v.metschnikouii v .-d+-d+d+d-d-d-d-霍利斯弧菌v.hollisae+-+-+-+-d-v.damsela-d+-+-+-+-d-注：90%為陽性；-90%以上為陰性；()慢陽性；D 11% 89%為陽性；(d)11 89%為延遲陽性。(5)溶血試驗我妻子的溶血反應(yīng)是在有限的條件下，在高鹽血瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)副溶血弧菌時發(fā)生的，這被稱為“神奈川現(xiàn)象”。本試驗的要求是從人或兔的新鮮紅細(xì)胞制備高鹽血平板，在37培養(yǎng)24h后，如果單個菌落周圍有透明的溶血環(huán)或菌落下有明顯的溶血，則為神奈川現(xiàn)象陽性，如果沒有透明的溶血環(huán)或明顯的溶血，則為神奈川現(xiàn)象陰

10、性。大多數(shù)致病性副溶血弧菌為神奈川陽性，但少數(shù)為陰性。(6)動物試驗用小鼠測定上述可疑菌株的毒力，將培養(yǎng)16 18小時的蛋白胨水或肉湯注入小鼠腹腔0.3 0.5毫升，有毒力的可在5 10小時內(nèi)死亡，老年人約在24小時內(nèi)死亡。在發(fā)病時，會出現(xiàn)毛發(fā)直立、活動不活躍、腹部靠近池底、呼吸困難、四肢痙攣、尾巴痙攣和震顫等癥狀。在解剖死小鼠后，取出內(nèi)臟器官如心臟血液進(jìn)行分離，并且可以檢測測試細(xì)菌的純培養(yǎng)物。對照組動物觀察2 3天，未見異常現(xiàn)象。然而，應(yīng)該注意的是，一些溶藻弧菌也能導(dǎo)致小鼠死亡，這有時很難區(qū)分。在進(jìn)行上述試驗后，有必要對毒力進(jìn)行確認(rèn)，并對結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。第三，培養(yǎng)基(1)氯化鈉結(jié)晶紫富集液

11、成分：蛋白胨20g氯化鈉40g0.01%結(jié)晶紫溶液5mL蒸餾水1000毫升pH9.0制備方法：除結(jié)晶紫外，按上述成分制備，加熱溶解，加入約4.5毫升3%氫氧化鉀溶液，調(diào)節(jié)酸堿度，加熱煮沸，過濾，然后加入結(jié)晶紫溶液，混合裝試管，121高壓滅菌15分鐘。(2)氯化鈉蔗糖瓊脂成分：蛋白胨10g濃縮牛肉汁10g氯化鈉50克蔗糖10g瓊脂18g0.2%溴百里酚藍(lán)溶液20毫升蒸餾水1000毫升pH7.8制備方法：將牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)酸堿度，加入瓊脂，加熱溶解，過濾，加入指示劑，分裝100毫升燒瓶，在121高壓滅菌15分鐘。使用前，在100毫升培養(yǎng)基中加入1克蔗糖，加熱融化，冷卻至50

12、，倒入盤中。(3)嗜鹽菌的選擇性培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鈉40g瓊脂17g0.01%結(jié)晶紫溶液5mL蒸餾水1000毫升pH8.7制備方法：除結(jié)晶紫和瓊脂外，其余成分按上述組成配制，調(diào)節(jié)酸堿度，加入瓊脂，加熱溶解，加入結(jié)晶紫溶液，燒瓶內(nèi)裝100毫升。(4) 3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂成分：蛋白胨20g濃縮牛肉汁5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖第一代氯化鈉35g硫酸亞鐵銨0.2g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12g酚紅0.025克蒸餾水1000毫升pH7.4制備方法：將除瓊脂和酚紅外的所有成分溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)酸堿度，加入瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶解，加入0.2%酚紅溶液12.5毫升，搖勻，裝試管，121高壓

13、滅菌15分鐘，置于高坡上備用。(5)氯化鈉血瓊脂(我妻子的培養(yǎng)基)成分：酵母提取物3g蛋白胨10g氯化鈉70g磷酸氫二鈉5g甘露醇10g結(jié)晶紫0.001g瓊脂15g蒸餾水1000毫升制備方法：調(diào)節(jié)酸堿度至pH8.0，加熱30分鐘(無高壓)，冷卻至45左右，加入新鮮人血或兔血(5% 10%)，混勻，倒入盤中。(6)嗜鹽菌測試培養(yǎng)基成分：蛋白胨2g氯化鈉加入不同的量蒸餾水100毫升pH7.7(7) 3.5%氯化鈉生化試驗培養(yǎng)基配料：牛肉醬5g蛋白胨10g氯化鈉35g磷酸氫二鈉2g0.2%溴百里酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000毫升pH7.7制備方法：將上述成分分配后，根據(jù)所需的糖發(fā)酵管加入各種糖，葡萄

14、糖發(fā)酵管可按0.5%的葡萄糖加入，然后用小倒置管包裝在試管中，在121高壓滅菌15分鐘。其它培養(yǎng)基可裝入100毫升瓶中，在121高壓滅菌15分鐘，分別用10%溶液配制。同時高壓滅菌后，取5mL糖液，加入100毫升培養(yǎng)基中，無菌分裝于小試管中。(8)葡萄糖和鹽蛋白胨水(用于磁共振血管造影試驗)Ingredien磷酸氫鉀5g氯化鈉30克制備方法：加入1000毫升蒸餾水，搖勻后加熱至完全溶解，冷卻后裝入小試管，在121高壓滅菌15分鐘。(9)鹽蛋白胨水(用于靛藍(lán)底物試驗)成分：蛋白胨20g氯化鈉30克蒸餾水1000毫升pH7.4制造方法：根據(jù)上述分配系統(tǒng)，包裝小試管，在121高壓滅菌15分鐘。(10)運動測試介質(zhì)配料：牛肉醬3g蛋白胨10g氯化鈉30克瓊脂4g