1、1,熒 光 光 度 計(jì),環(huán)境科學(xué)與工程研究中心,2,掌握分子熒光產(chǎn)生的過(guò)程及其影響因素 熟悉熒光光度計(jì)的基本構(gòu)件及操作程序 了解熒光分析法的特點(diǎn)與應(yīng)用,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?3,【實(shí)驗(yàn)原理】,一、分子熒光產(chǎn)生過(guò)程 二、激發(fā)光譜與熒光光譜 三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系 四、影響熒光強(qiáng)度的因素,4,1. 分子能級(jí)與躍遷 分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜； 在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)； 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定 頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ；

2、第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；,一、分子熒光的產(chǎn)生過(guò)程,5,2.電子激發(fā)態(tài)的多重度,電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)； 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；,S0T1 禁阻躍遷； 通過(guò)其他途徑進(jìn)入 (見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率小；,6,（S0：?jiǎn)尉€基態(tài)；S1：最低激發(fā)單線態(tài)；T1：最低激發(fā)三線態(tài)；A： 吸收；F： 熒光；P：磷光；v：振動(dòng)馳豫；ISC：系間竄躍）,熒光、磷光光物理過(guò)程示意圖,7,3.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑,電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光

3、)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量。,激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。 熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)； 磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；,8,二、激發(fā)光譜與熒光光譜,熒光：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？ 1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線 固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 （圖中曲線I ） 。,激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；,9,2.熒光光譜(或磷光光譜),固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(

4、圖中曲線II或III)。,10,3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系,a.Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。 b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。 c. 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。,11,鏡像規(guī)則的解釋,基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；,基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。,12,200,

5、250,300,350,400,450,500,熒光激發(fā)光譜,熒光發(fā)射光譜,nm,蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜,13,三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件 （1）具有合適的結(jié)構(gòu)。 （2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（）：,熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。,14,2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,（1）躍遷類型：* 的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生； （2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移 （3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相

6、似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。,（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。,15,16,四、影響熒光強(qiáng)度的因素,影響熒光強(qiáng)度的外部因素 1.溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化； 2.溫度的影響 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。 3. 溶液pH 對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；,17,4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象,內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。 自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。,18,5.溶

7、液熒光的猝滅,碰撞猝滅； 氧的熄滅作用等。,19,二、儀器結(jié)構(gòu)流程,熒光儀主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。 特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。,基本流程如圖： 單色器：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光波長(zhǎng)的第二單色器； 光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū)) 檢測(cè)器：光電倍增管。,20,儀器光路圖,21,同步掃描技術(shù),根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種。,同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率； 如圖。 合適的可減少光譜重疊： 酪氨酸和色氨酸的熒光

8、激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。,22,可獲得三維光譜圖的儀器,可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖,23,日立F-4500熒光儀,熒光儀主機(jī),電源開關(guān),光源開關(guān),主機(jī)開關(guān),24,開機(jī)順序： 開機(jī)前首先確認(rèn)主機(jī)兩個(gè)開關(guān)：POWER/MAIN均處于關(guān)閉狀態(tài)（搬向O處）。 先接通電源開關(guān)（POWER）， 5秒鐘后再按下氙燈點(diǎn)燈按鈕，當(dāng)氙燈點(diǎn)燃后，再接通主開關(guān)（MAIN）。此時(shí)主開關(guān)上方綠色指示燈連續(xù)閃動(dòng)三下。 接通電腦及打印機(jī)電源，Win98開始建立，隨后F-4500操作界面自動(dòng)進(jìn)入。 按界面提示選擇操作方式。 關(guān)機(jī)順序： 逆開機(jī)

9、順序?qū)嵤┎僮鳌?當(dāng)電源開關(guān)關(guān)閉后5秒鐘，再次接通10分鐘。（目的是僅讓風(fēng)扇工作，使燈室散熱）最后關(guān)閉電源開關(guān)。,日立F-4500熒光分光光度計(jì)簡(jiǎn)易操作方法,25,三、熒光分析方法與應(yīng)用,1. 特點(diǎn) （1）靈敏度高 比紫外-可見分光光度法高24個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？ 檢測(cè)下限：0.10.1g/cm-3 相對(duì)靈敏度：0.05mol/L 奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。 （2）選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜； （3）試樣量少 缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。,26,2.定量依據(jù)與方法,(1)定量依據(jù) 熒光強(qiáng)度 If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(

10、1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后： If = 2.3 I0 l c = Kc,27,（2）定量方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度； 比較法： 在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；,28,3.熒光分析法的應(yīng)用,(1)無(wú)機(jī)化合物的分析 與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；