1、.,1,臨床免疫學(xué)檢查,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 季育華 教授,.,2,范疇(category)：,1、感染性疾病(infection disease) 2、自身免疫性疾病(autoimmune ) 3、超敏反應(yīng)性疾病(hypersensitivity ) 4、免疫缺陷/增殖性疾病 (immunoabnormal deficiency/proliferation) 5、腫瘤(tumour) 6、移植(transplantation),.,3,手段(measure)與目的(objective)：,應(yīng)用免疫學(xué)的理論(theory)與技術(shù) (technique)，研究疾病的病因(致病) (pathogen

2、esis)、發(fā)生(occur)、發(fā)展 (develop)和轉(zhuǎn)歸(turn)，并對疾病進(jìn)行 診斷(diagnosis)、療效監(jiān)測(curative effect monitor)和預(yù)防(prevent)。,.,4,內(nèi)容(content)：,1、體液免疫檢測(humoral) 2、細(xì)胞免疫檢測(cellular ) 3、相關(guān)臨床疾病的免疫檢測 感染性疾病 自身免疫性疾病 超敏反應(yīng)性疾病 免疫缺陷/增殖、腫瘤與移植,.,5,一、體液免疫檢測(test),（一）血清免疫球蛋白檢測 (human serum immunoglobulin ) （二）血清補(bǔ)體檢測 (human serum compleme

3、nt ) （三）體液免疫相關(guān)其他檢測 (others ),.,6,（一）血清免疫球蛋白檢測,免疫球蛋白（Immunoglobulins, Ig） 是具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似 的球蛋白。 可分為分泌型和膜型兩種，前者主要 存在于血清等體液中，如Ab；后者稱膜 型免疫球蛋白（membrane Ig，mIg）， 是B細(xì)胞膜上的抗原受體(receptor)。,.,7,抗體（antibodies, Ab）是B細(xì)胞識別 抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的，能 與相應(yīng)抗原特異性(specific)結(jié)合 (recognize antigen and binding)并 發(fā)揮免疫功能(antigen and

4、 antibody reaction)的球蛋白。,所有抗體都是免疫球蛋白， 但免疫球蛋白不都是抗體。,.,8,臨床檢測的血清免疫球蛋白,.,9,健康人血清主要Ig含量(content)（g/L）,年 齡 IgG IgM IgA 新生兒 6.617.5 0.010.06 0.060.21 6個月 2.66.9 0.080.57 0.261.00 1 歲 3.09.5 0.140.91 0.371.50 2 歲 4.712.3 0.211.45 0.411.75 8 歲 6.315.0 0.462.51 0.472.20 12歲 7.015.5 0.582.91 0.492.40 18歲 7.31

5、5.5 0.703.21 0.512.61 成人 7.016.0 0.703.00 0.402.80,.,10,檢測手段(method)：,(Precipitation Reaction),(In fluid phase),(In agar),（ring、immune-turbidity、et al）,（diffusion）,（electrophoresis）,.,11,(In fluid phase )絮狀沉淀試驗：,Ag,Ab,環(huán)狀沉淀試驗,.,12,.,13,透射免疫比濁：,（turbidimetry）,在直射角度上測定光的透射強(qiáng)度，以吸收光單位（A）表示， A值與復(fù)合物量呈正比。,.,

6、14,散射免疫比濁（終點(diǎn)散射/速率散射）：,（nephelometry） 在光路的5-95角的方向上測量散射光強(qiáng)度和被測溶液中微粒濃度關(guān)系的一種方法。 散射光：一定波長的光線沿水平軸通過復(fù)合物的混合液時導(dǎo)致光散射，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物量呈正比。 測定抗原抗體反應(yīng)達(dá)平衡時 ，終點(diǎn)（end） 測定單位時間內(nèi)抗原抗體形成最大量時，速 率（rate）,.,15,臨床意義（significance）：,1.血清多克隆Ig水平增高 患者血清中各型Ig均升高，常見于各種 感染特別是慢性(chronic)細(xì)菌感染，如肺結(jié) 核、慢性支氣管炎、慢性肝病自身免疫性 (autoimmune)疾病。SLE患者以IgG、

7、IgA升高 較多見，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎IgM增高為主。,.,16,多克隆抗體(polyclonal antibody): 由不同的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體. 單克隆抗體(monoclonal antibody): 由一個細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的只識別單一 抗原決定簇的純的抗體.,.,17,2.血清單克隆Ig水平增高 患者血清中出現(xiàn)異常增多的單克隆蛋白 （monoclonal protein，MP（即M蛋白）達(dá) 30g/L以上，而正常Ig包括與MP同類Ig的含量 則顯著降低。此類異常增多Ig多無免疫活性, 主要見于免疫增殖性(immunoproliferative) 疾病，如多發(fā)性骨髓瘤(multiple my

8、eloma, MM),原發(fā)性巨球蛋白血癥(primary macro- globulinemia)、重鏈(heavy chain)病、輕 鏈(light chain)病等。,.,18,新生兒、嬰幼兒由于體液免疫功能尚不成 熟，免疫球蛋白的含量較成人低，需按年 齡組進(jìn)行分析與判斷。 關(guān)于血清IgE和IgD的測定： 血清總IgE為0.130.92mg/L; 血清總IgD為0.62.0mg/L; IgE值升高多見于超敏反應(yīng)性疾病,骨髓瘤 IgD值升高多見于骨髓瘤等。,.,19,異常免疫球蛋白檢測：,M蛋白/（Monoclonal immunoglobulins ） 由一種單克隆B淋巴細(xì)胞異常增殖時產(chǎn)

9、生的 具有相同結(jié)構(gòu)和電場移動率的Ig分子或分子片段，一般不具有抗體活性,又稱副蛋白（paraprotein）。 冷球蛋白（cryoglobulin） 指血清中一種蛋白，4不溶解，30易于 凝聚，37便溶解。存在于多種疾病，參 與炎癥或免疫復(fù)合物引起的疾病。,.,20,M蛋白的檢測（免疫固定電泳） (immunofixation lectrophoresis),操作：待檢血清 + 抗血清IgG IgA IgM 鏈 鏈 I 抗原抗體對應(yīng)沉淀 并被固定，染色等,結(jié)果(result)：,.,21,與M蛋白檢測相關(guān)(related)疾病：,1、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma） 2、巨球蛋

10、白血癥（macroglobulinemia） 3、重鏈?。╤eavy chain disease） 4、輕鏈?。╨ight chain disease） 5、半分子病（half-molecule immunoglobulin disease） 6、惡性淋巴瘤(malignant ) 7、良性M蛋白血癥(benign ),.,22,例:,多發(fā)性骨髓瘤 （multiple myeloma,MM） 是漿細(xì)胞異常增殖的惡性腫瘤，也稱漿細(xì)胞瘤（plasmocytoma）。是IPD中最常見的一種類型。1873年由Butzky首先并命名。,.,23,MM的主要臨床特征：,進(jìn)行性的骨質(zhì)破壞，如骨質(zhì)疏松和溶骨性

11、病變， 常有骨痛、易骨折，為MM最典型特征； 大量的M蛋白導(dǎo)致血液粘度增高,呈高粘血癥或沉積 于腎小管中，腎小管上皮細(xì)胞淀粉樣變性，發(fā)生腎病 綜合征。損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙； 骨髓損傷可引起貧血、粒細(xì)胞和血小板減少； 漿細(xì)胞浸潤其他組織，如脊髓和神經(jīng)根受壓時引起 運(yùn)動功能障礙等； 男性多發(fā)，平均發(fā)病年齡46歲左右； 惡性程度高，預(yù)后不良； 易感染。,.,24,MM的主要免疫學(xué)特征：,血清中出現(xiàn)大量的M蛋白：IgG35g/L, IgA20g/L, IgM15g/L, IgD2.0g/L，IgE 2.0g/L；或尿中有本周蛋白（1.0g/24h 尿）； 血清中正常Ig 水平明顯降低；

12、 骨髓中有無限擴(kuò)增的異常漿細(xì)胞 （15%）為主要病理特征，組織證實有漿 細(xì)胞瘤； 有溶骨性損害。,.,25,不同類型的多發(fā)性骨髓瘤:,類 型 發(fā)生率（%） 本周蛋白尿陽性（%） 臨 床 特 點(diǎn) IgG 5060 5070 典型癥狀 IgA 2025 5070 高粘綜合征較多見 IgD 12 90 骨髓外病變、溶骨病 變多見，44%淀粉樣變 IgE 0.01 少見 IgM 1 90 高粘綜合征最常見 非分泌型 15 無 溶骨病變較少，神 經(jīng)系統(tǒng)損害較多見,.,26,MM的發(fā)病機(jī)制,發(fā)病機(jī)制不明，與下列因素有關(guān)。 （1）是遺傳與環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。主要發(fā)生 在1號、11號、14號染色體，使?jié){細(xì)

13、胞可發(fā)生永生化 （2）造血干細(xì)胞的異常 。形成漿細(xì)胞瘤。 （3）細(xì)胞因子的異常 。MM患者可有IL-6異常增高， 體外內(nèi)實驗證明IL-6可促使MM細(xì)胞增殖、生長和存 活，使MM細(xì)胞增多。IL-6增高直接效應(yīng)是抑制IL-4的 產(chǎn)生，從而抑制了正常的體液免疫功能。 （4）與粘附分子、IL-6等信號傳遞受體和B細(xì)胞12 等抑制凋亡的受體高表達(dá)有關(guān)。,.,27,本周蛋白（bence-jones protein）: 1847年由Bence-Jones在病人的尿液中檢出而命名。已知M蛋白不具有免疫活性，無正常免疫球蛋白的功能，其輕鏈分子小可通過腎小球濾過從尿排除。 （本周蛋白是從尿中檢出的M蛋白輕鏈）,.

14、,28,冷球蛋白的檢測(定性)：,.,29,冷球蛋白的定量分析 鑒定沉淀中蛋白質(zhì)類型，可將沉淀用冷緩沖 液洗滌后，再溶于巴比妥緩沖液中，固定電 泳或免疫電泳鑒定。 冷球蛋白檢測的注意事項 采血過程要保溫，用品用預(yù)溫，4下放置時 間要一周，正常人血清也可含有冷球蛋白， 多數(shù)在80g/L 以下。,.,30,（二）血清補(bǔ)體檢測,補(bǔ)體（complement）是指血清中具有酶活性的一組不耐熱球蛋白。 A. C1C9(C1q、r、s)； B. B因子、D因子、P因子、H因子； C. C1抑制物、C4結(jié)合蛋白、促衰變因子 等。,.,31,溶血程度與補(bǔ)體含量的關(guān)系:,.,32,補(bǔ)體相關(guān)的實驗室檢測：,1、總補(bǔ)

15、體溶血活性測定（CH50） 反映主要補(bǔ)體C1C9成分的綜合水平。 試管法：正常參考值范圍 50 100U/ml 脂質(zhì)體免疫法：其范圍23 46U/ml 測得值高：急性炎癥、損傷、惡性腫瘤 測得值低：補(bǔ)體消耗相關(guān)疾病 補(bǔ)體合成降低（肝?。?先天性缺陷,.,33,2、補(bǔ)體單個成分檢測（C3、C4、C1q） 方法:免疫比濁法、單向免疫擴(kuò)散法,.,34,補(bǔ)體單個成分檢測的意義:,若血清C3含量增高，由于C3是急性時相反應(yīng)蛋 白，在急性炎癥、傳染病早期、急性組織損傷、惡 性腫瘤、移植物排斥反應(yīng)時增高。但是補(bǔ)體含量增 高的臨床意義不大。 若血清C3含量降低，見于合成能力低下，如慢性 肝?。缓铣稍喜蛔?，如

16、營養(yǎng)不良；補(bǔ)體消耗或丟 失增多，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期、白血病化療 后、大量失血、大面積燒傷。 血清C4含量降低，見于多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性血 管性水腫、遺傳性C4缺乏癥等。,.,35,二、細(xì)胞免疫(cellular)檢測,參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞 T淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞 NK細(xì)胞（自然殺傷） 中性粒細(xì)胞 針對細(xì)胞的數(shù)量(amount)、活性（功 能 function）、表面標(biāo)志物(membrane molecules )表達(dá)(express)程度。,.,36,T細(xì)胞表面標(biāo)志物(主要):,1、羊RBC受體(E花環(huán)) 2、T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor,TCR) 3、CD3,CD

17、4/CD8；CD28,152,154和CD2等 （Cluster of differentiation；CD） 4、絲裂原受體（PHA/ConA） 5、MHC分子（MHV-類分子） 6、細(xì)胞因子受體,.,37,臨床常見的細(xì)胞免疫檢測項目,T細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 (membrane molecules of T lymphocytes) 通過檢測T淋巴細(xì)胞表面特有的標(biāo)志物 識別，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)；分析細(xì)胞亞群。 方法：E玫瑰花環(huán)形成試驗 (Erythrocyte rosette forming cell test) T細(xì)胞分化抗原（CD）測定 (Cluster Differentiation of T

18、 cells ),.,38,E玫瑰花環(huán)形成試驗:,T細(xì)胞表面有特異性綿羊紅細(xì)胞 (SRBC) 受體，即E受體。將T細(xì)胞與SRBC按一定比例混勻，置4至少2h或過夜，T細(xì)胞表面的E受體能與SRBC結(jié)合形成以T細(xì)胞為中心，四周環(huán)繞SRBC的花環(huán)樣結(jié)構(gòu)（見圖)鏡檢計數(shù)可得總花環(huán)(Et)形成率，亦即T細(xì)胞的百分率。,.,39,正常參考值范圍 Et 64.46.7% Ea 20%40%,.,40,流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM) ：CD3+T細(xì)胞 6185%；CD4+T細(xì)胞 2858%；CD8+T細(xì)胞 1948%；CD4+/CD8+T細(xì)胞比值 1.660.33(1)。,.,41,T淋巴細(xì)

19、胞功能檢測(function),T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng),在有絲分裂原作用下 細(xì)胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)合成增加,細(xì)胞發(fā)生母細(xì) 胞化(transformation ),或經(jīng)混合(mixed) 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)等來幫助細(xì)胞免疫功能評估。 方法：形態(tài)學(xué)(morphologic counting ) 3H-胸腺嘧啶核苷摻入法 (3H-thymidine incorporation) MTT法(MTT colorimetry) Mixed lymphocyte culture (one-way/two-way),.,42,Lymphocyte transformation (%) =(transferred lymph

20、ocyte)200100% Reference value: 70%,.,43,(3H-thymidine incorporation): T細(xì)胞經(jīng)有絲分裂原刺激，向母細(xì)胞轉(zhuǎn) 化時胞內(nèi)DNA合成活躍， 3H-胸腺嘧啶核 苷作為原料攝入， 3H-胸腺嘧啶核苷的 摻入量與細(xì)胞增殖相關(guān)（SI2，正常）,Stimulating index (SI) = mean CPM of the stimulated cells/ mean CPM of the corresponding control Cells (unstimulated=control ),.,44,MTT法(colorimetry):

21、細(xì)胞增殖代謝活躍，細(xì)胞內(nèi)線粒體脫 氫酶活性增高，通過線粒體能量代謝 使得MTT代謝形成紫色甲潛，經(jīng)細(xì)胞溶 解分析吸光度，估計細(xì)胞增殖程度(SI2)。 methyl thiazolyte trazolium;MTT 四甲基偶氮唑鹽,為一種染料.,.,45,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed culture)： 將兩個無關(guān)的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)， 由于不同個體MHC的差異，彼此都以對方 為抗原發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 T細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力可通過3H-胸腺嘧啶 核苷摻入法、MTT法，檢測分析。,.,46,B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測,B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物： 1、膜表面免疫球蛋白（SmIg） 2、分化抗原（CD1922

22、和CD29） 3、Fc受體(Fc receptor) 4、補(bǔ)體受體(complement receptor) 5、EB病毒受體等(EB virus receptor),.,47,檢測方法(method)： 1、免疫熒光(fluorescence immunoassay) 法測SmIg（用5種抗Ig抗體+B細(xì)胞熒光顯 微鏡下計數(shù)）. 參考值: SmIg+細(xì)胞總數(shù)1628%，其中G+ 4 13%；M+713%；A+14%；D+58%; E+0 1.5%。 2、流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測B 細(xì)胞分化抗原（CD19）. 參考值: CD19+細(xì)胞 11.74%3.73%,.,4

23、8,B淋巴細(xì)胞功能檢測(function):,1、B淋巴細(xì)胞增殖(proliferation)試驗 2、溶血空斑(hemolytic plaque)試驗 3、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT） 4、體內(nèi)試驗（皮試）(/),.,49,ELISPOT:,用抗原包被固相，加入待檢的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，再誘導(dǎo)其抗體的分泌。 分泌的抗體與包被于固相的抗原結(jié)合，在抗體形成細(xì)胞周圍形成抗原抗體復(fù)合物。 再加入酶標(biāo)記二抗，通過底物的顯色反應(yīng)鏡下計數(shù)著色斑點(diǎn)，并記錄顯色的深淺、范圍，可評估B細(xì)胞功能,.,50,.,51,A and B：檢測標(biāo)本（刺激后的待測細(xì)胞） E and F：檢測抗體對照（相同數(shù)量刺激后的待測細(xì)胞

24、，使用PBS替代了檢測抗體） C and D：陰性對照（相同數(shù)量的未刺激細(xì)胞） G and H：背景對照（只加入培養(yǎng)基，無細(xì)胞） H1 and H12：陽性對照（重組的細(xì)胞因子）,檢測模式和結(jié)果示意圖,.,52,體內(nèi)試驗（皮試）,正常機(jī)體對某種抗原建立了細(xì)胞免疫后，如用相同的抗原做皮膚試驗時，常出現(xiàn)陽性的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。本試驗不僅可以檢查受試者是否對某種抗原具有特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，而且可以檢查受試者總體細(xì)胞免疫狀態(tài)。,.,53,體內(nèi)試驗（皮試）:,B細(xì)胞功能減低或缺陷，可表現(xiàn)為體內(nèi)Ig 和血型抗體量下降或缺如，患者對外源性抗原的應(yīng)答能力減弱或缺如，僅產(chǎn)生極低或不能產(chǎn)生特異性抗體。故臨床定量

25、測定受檢者血清中各種Ig量和相應(yīng)血型抗體可判斷B細(xì)胞功能，也是診斷體液免疫缺陷的重要指標(biāo)。反之，如血清中一種或多種Ig或輕、重鏈片段異常增高，表明B細(xì)胞產(chǎn)生Ig的功能異常增高。,.,54,4、自然殺傷細(xì)胞（NK）免疫檢測： NK為一類大顆粒淋巴細(xì)胞，其表面無專 門的識別標(biāo)志，具有細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 作用能直接殺傷靶細(xì)胞。 NK具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等功 效，還參與移植排斥、超敏反應(yīng)等 NK功能測定：包括乳酸脫氫酶釋放率、 51Cr釋放等等 。,.,55,5、吞噬細(xì)胞（phagocytes）功能檢測： 吞噬細(xì)胞 中性粒細(xì)胞（neutrophils） 單核-吞噬細(xì)胞 （mononuclear

26、/macrophages） 吞噬細(xì)胞的吞噬活力 趨化（trend） 吞噬（phagocytosis） 胞內(nèi)消化（elimination）,.,56,.,57,細(xì)胞免疫相關(guān)的主要細(xì)胞因子檢測：,細(xì)胞因子(cytokines): 由活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)的小分子多肽。細(xì)胞因子少入血，檢測局部含量有意義；細(xì)胞因子具網(wǎng)絡(luò)特性，聯(lián)合檢測多信息分析有意義。,.,58,細(xì)胞因子的種類：,1、白細(xì)胞介素（ IL-118） 2、集落刺激因子（CSF）（粒、巨噬細(xì) 胞和混合） 3、干擾素（IFN）（、） 4、腫瘤壞死因子（TNF）（ 、 ） 5、轉(zhuǎn)化生長因子家族/ （SGF）

27、 6、趨化因子家族 7、其他（表皮生長、血小板衍生）,.,59,常見細(xì)胞因子檢測方法：,1、生物學(xué)檢測法（促細(xì)胞增殖和增殖抑制、 細(xì)胞毒活性、抗病毒活性、趨化活性等）。 2、免疫學(xué)檢測法（ELISA、RIA、免疫印跡、 免疫斑點(diǎn)）。 3、分子生物學(xué)法（RNA印跡、PCR等）。 4、單個細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子測定法（反向溶血 空斑、反向ELISA斑點(diǎn)）。,.,60,IL-2/ IL-2R,IL-2主要由活化的CD4+細(xì)胞產(chǎn)生，通過自分泌和旁分泌作用于分泌IL-2的細(xì)胞本身或近鄰的CD4+和 CD8+細(xì)胞，是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中最重要的調(diào)節(jié)因子。 為評價機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)之一。 體液中含量低難以直接檢測。 通常檢測由刺激原（PHA/ConA）誘導(dǎo)單個核細(xì)胞在體外產(chǎn)生其的能力來反映。,.,61,IL-4,主要由Th細(xì)胞經(jīng)抗原或絲裂