1、第 一 章,蛋白質的結構與功能 Structure and Function of Protein,蛋白質存在于所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質和功能物質。 蛋白質是生命活動的物質基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程。 總而言之，一切重要的生理活動都離不開蛋白質，蛋白質是生命現(xiàn)象的最基本的物質基礎。 幾年前，在歐洲乃至全世界引起恐慌的瘋牛病，其致病元兇就是蛋白粒子（prion），這種只有蛋白質而沒有核酸的病原體，可引起人或動物的瘋牛病，這一發(fā)現(xiàn)又一次說明了蛋白質是生命的物質基礎。,一、什么是蛋白質?,蛋白質(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(pep

2、tide bond)相連形成的高分子含氮化合物,二、蛋白質的生物學重要性,1. 蛋白質是生物 體重要組成成分 分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。 含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80。,二、蛋白質的生物學重要性,1）作為生物催化劑（酶） 2）代謝調節(jié)作用(胰島素) 3）免疫保護作用（免疫球蛋白或抗體） 4）物質的轉運和存儲（血紅蛋白+鐵蛋白） 5）運動與支持作用（肌球蛋白+角蛋白） 6）參與細胞間信息傳遞,2. 蛋白質具有重要的生物學功能,3. 氧化供能,第 一 節(jié),蛋 白 質 的 分 子 組 成

3、The Molecular Component of Protein,組成蛋白質的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白質含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘 。,各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16,1g 氮相當于 6.25g 蛋白質。,由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質的大致含量：,100克樣品中蛋白質的含量 ( g % ) = 每克樣品含氮克數(shù) 6.25100,1/16%,蛋白質元素組成的特點,一、氨基酸 組成蛋白質的基本單位,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，

4、且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,-氨基酸有兩種構型:D構型和L構型 它們是與甘油醛或乳酸相比較而決定的。凡是與L甘油醛（或L乳酸）構型相同的，就定義為L氨基酸，反之為D氨基酸。,非極性疏水性氨基酸 極性中性氨基酸 酸性氨基酸 堿性氨基酸,（一）氨基酸的分類,* 20種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下:,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,纈氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,異亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5

5、.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非極性疏水性氨基酸,目 錄,色氨酸 tryptophan Trp W 5.89,絲氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Tyr Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,蘇氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 極性中性氨基酸,目 錄,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic

6、acid Glu E 3.22,賴氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,組氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 堿性氨基酸,目 錄,人體所需的八種必需氨基酸 賴氨酸(Lys) 纈氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 異亮氨酸(Ile) 酪氨酸(Tyr) 苯丙氨酸(Phe) 嬰兒時期所需: 精氨酸(Arg)、組氨酸(His) 早產(chǎn)兒所需：色氨酸(Trp )、半胱氨酸(Cys,幾種特殊氨基酸,脯氨酸 （亞氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,（二）氨基酸的理化性質,1. 兩性解離及等電點

7、,氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,等電點(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多數(shù)蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。,芳香族氨基酸在pH8時紫外吸收光譜,3. 茚三酮反應,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰

8、在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,二、肽,一分子氨基酸的-羧基與另一分子氨基酸-氨基脫水縮合的化合物叫做肽，氨基酸之間通過酰胺鍵（蛋白質化學中將這類酰胺鍵專稱為肽鍵）連接而成。,（一）肽(peptide),* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,* 由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽鏈中

9、有自由氨基的一端 C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,* 多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 幾種生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),生物的生長、發(fā)育、細胞分化、大腦活動、腫瘤病變、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物鐘規(guī)律及分子進化等均涉及到活性肽。生物活性肽是機體內傳遞信息、調節(jié)代謝和協(xié)調器官活動的重要化學信使。,GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,谷胱甘肽重要的生物功能,維護蛋白質活性中心的巰基 參與二硫化合物相互轉化 某些酶的輔酶，

10、在體內氧化還原過程中起重要的作用,體內許多激素屬寡肽或多肽,神經(jīng)肽(neuropeptide)如腦啡肽 (enkephalin ） 功能：鎮(zhèn)痛,2. 多肽類激素及神經(jīng)肽,例如促甲狀腺素釋放激素的N端殘基是谷氨酸，此殘基易于自身環(huán)化成焦谷氨酰基（氨基與谷氨酸的羧基脫水縮和而成）。它可促進腺垂體分泌促甲狀腺素。,蛋 白 質 的 分 子 結 構The Molecular Structure of Protein,第 二 節(jié),蛋白質是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列。在蛋白質中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構象）（conformation）。在結構中，這種構象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。 蛋白質的

11、分子結構包括 一級結構(primary structure) 二級結構(secondary structure) 三級結構(tertiary structure) 四級結構(quaternary structure),定義 蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。,一、蛋白質的一級結構,主要的化學鍵 肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。,一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。但不是決定蛋白質空間構象唯一因素。,目 錄,二、蛋白質的二級結構,主要的化學鍵： 氫鍵,（一）肽單元,參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，

12、此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,蛋白質二級結構的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折疊 ( -pleated sheet ) -轉角 ( -turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ),-螺旋,目 錄,左手螺旋與右手螺旋,多肽鏈以肽鍵平面為單位，-碳原子為轉折點，有規(guī)律的盤繞成右手螺旋結構。(外觀) R基團伸向螺旋外側，其大小、形狀及電荷性質均影響-螺旋的形成。（側鏈） 每3.6個氨基酸殘基盤繞一圈，螺距為0.54nm。（基本單位） 相鄰螺旋的肽鍵之間形成氫鍵，方向與長軸基本平行，維持螺旋的穩(wěn)定。（維系結構的作用力）,（三）-折疊:

13、是一種肽鏈相當伸展的結構。肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈上的羰基和氨基形成的氫鍵維持結構的穩(wěn)定性。肽鍵的平面性使多肽折疊成片，氨基酸側鏈伸展在折疊片的上面和下面。,b-折疊的結構特點：,呈折紙狀，即以每個肽單元的Ca為旋轉點，依次折疊成鋸齒狀 兩條以上的肽鏈或一條肽鏈內的若干肽段的鋸齒狀結構可平行排列，走向可以相同，也可相反 穩(wěn)定力：氫鍵 氨基酸殘基的側鏈基團交替地位于鋸齒狀結構的上下方，并影響到折疊的穩(wěn)定性,（四）-轉角和無規(guī)卷曲,為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉方向，成發(fā)夾形狀。一個氨基酸的羰基氧以氫鍵結合到相距的第四個氨基酸的氨基氫上。,無規(guī)卷曲與生物 活性有關，對外 界理化因子極

14、為 敏感。,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。,無規(guī)卷曲,（五）模體,在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體(motif)。,鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體,鋅指結構,（六）氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響,蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成-螺旋或-折疊，它就會出現(xiàn)相應的二級結構。,三、蛋白質的三級結構,整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,（一） 定義,目 錄,肌紅蛋白 (Mb),纖連蛋白分子的結構域,（二）結構域,大分子蛋白

15、質的三級結構常可分割成一個或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain) 。,（三）分子伴侶,分子伴侶(chaperon)通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。,* 分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。,* 分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。,* 分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。,亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。,四、蛋白質的四級結構,蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作

16、用，稱為蛋白質的四級結構。,有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基 (subunit)。,血紅蛋白的四級結構,五、蛋白質的分類,* 根據(jù)蛋白質組成成分,* 根據(jù)蛋白質形狀,蛋白質結構與功能的關系 The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 節(jié),（一）一級結構是空間構象的基礎,一、蛋白質一級結構與功能的關系,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,（二）一級結構與功能的關系,1.一級結構相似的多肽和蛋白質，其空間構象和功能也相似 例如：不同哺

17、乳類動物的胰島素分子 垂體前葉分泌的促腎上腺皮質激素和促黑激素 細胞色素C,例：鐮刀形紅細胞貧血,這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,2.一級結構關鍵部位改變引起蛋白質功能改變,結果：荷負電的Glu變?yōu)槭杷缘腣al，使HbS分子表面的負電荷減少，親水基團變?yōu)槭杷鶊F，使HbS分子聚合，溶解度降低，紅細胞變形，呈鐮刀狀，并易于破裂溶血。 治療：體外，KCNO共價修飾鏈N端Val殘基，使親水性增加，可防止HbS分子間的締合,鐮刀型紅細胞貧血的分子基礎,（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構,二、蛋白質空間結構與功能的關系,目 錄,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合， Hb與O2結合后稱

18、為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,* 協(xié)同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity) 如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應 (negative cooperativity),血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,變構效應(allosteric effect

19、),蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。,（三）蛋白質構象改變與疾病,蛋白質構象疾?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病中的蛋白質構象改變 瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。 正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。 Pr

20、Pc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為-折疊的PrPsc，從而致病。,第四節(jié),蛋白質的理化性質與分離純化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,第四節(jié),蛋白質的理化性質與分離純化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白質的兩性電離,一、理化性質,蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶

21、負電荷或正電荷的基團。,* 蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) 當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。,（二）蛋白質的膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內。,* 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素 顆粒表面電荷 水化膜,水化膜,溶液中蛋白質的聚沉,（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固,* 蛋白質的變性(denaturation) 在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其

22、理化性質改變和生物活性的喪失。,造成變性的因素 如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應用舉例 臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。 此外, 防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。,若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation) 。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,* 蛋白質沉淀 在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。 變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。

23、,* 蛋白質的凝固作用(protein coagulation) 蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,（四）蛋白質的紫外吸收,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。,變性 沉淀 和凝固關系,變性蛋白質不一定沉淀（只有PH=PI沉淀） 沉淀的蛋白質不一定變性（鹽析法沉淀蛋白質，蛋白不變性） 凝固的蛋白質變性且不可逆轉,（五）蛋白質的呈色反應,茚三酮反應(ninhydrin reaction) 肽段，蛋白質，氨基酸都可發(fā)生茚三酮反應。,雙縮脲反應(b

24、iuret reaction) 蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,二、蛋白質的分離和純化,（一）透析及超濾法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。,* 超濾法 應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*鹽析(salt precipitation)是

25、將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,* 免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,（三）電泳,蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,幾種重要的蛋白質電泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。 *等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。 *雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。,（四）層析,層析(chromatography)分離蛋白質的原理 待分離蛋白質溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質的目的 。,蛋白質分離常用的層