1、冰凍切片,冰凍切片簡介,冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度, 然后進(jìn)行切片的一種方法。因其制作過程較石蠟切片相對(duì)簡便、快捷, 都應(yīng)用于手術(shù)中快速病理診斷。我科于1975 年開展術(shù)中冰凍切片檢查, 1995 年采用快速恒冷式切片機(jī)(德國LE2ICACM1850) , 作冰凍切片1100 余例, 其中包括乳腺、肺、喉、甲狀腺、淋巴結(jié)、消化道、泌尿道、卵巢、子宮、皮膚等組織。結(jié)果顯示, 切片順利, 制作效果滿意, 為病理診斷提供了可靠的依據(jù)。既免除了患者多次手術(shù)帶來的巨大痛苦, 又節(jié)約了患者的住院費(fèi)用, 深受廣大臨床醫(yī)生及患者的歡迎及好評(píng)。,冷凍切片的種類,冰凍切片的種類較多，有低

2、溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。這些方法，隨著時(shí)代的變遷，科技的發(fā)展，許多年前被認(rèn)為是非常重要的技術(shù)，現(xiàn)在也逐步被淘汰了。當(dāng)然有些技術(shù)，如低溫恒冷箱冰凍切片法，正在受到青睞。,冰凍切片的制作,取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24242mm。 取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。 調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是

3、細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在510um間。 調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時(shí)，切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。 應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-1520左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)

4、調(diào)至-30。,冰凍切片的快速染色法,冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當(dāng)切片附貼于載玻片后，即用電吹風(fēng)吹干后再固定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比認(rèn)為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強(qiáng)熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒有任何變化的情況下被固定起來，經(jīng)一年多來1000例冰凍切片的制作實(shí)踐認(rèn)為這樣制作固定切片好，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。,方法：,切片固定30秒1分鐘。 水洗。 染蘇木素35分

5、鐘。 分化。 于堿水中返藍(lán)20秒。 伊紅染色1020秒。 脫水，透明，中性樹膠封固。,操作過程中常見問題與處理,標(biāo)本固定應(yīng)充分,標(biāo)本經(jīng)固定或不固定均可，但經(jīng)過固定的組織切片冰晶少，細(xì)胞擠壓變形小，切片完整，染色清晰，而未固定的組織冰晶多，細(xì)胞擠壓變形大，甚至?xí)绊懹^察結(jié)果。因此，除特別需要外，一般較多采用組織固定后再行切片。固定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活檢和手術(shù)標(biāo)本，以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。灌注法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。用于組織固定的固定劑種類很多，包括醛類、非醛類、丙酮及醇類等，其中以中性緩沖液配制多種聚甲醛較為常用2，- 3組織固定時(shí)，一方面固定液要有足夠的量，另一方面還要

6、保持一定時(shí)間，一般在快速灌注固定取材后，多用相同的固定劑再固定! % ，以使組織充分固定，這對(duì)保持切片的完整性尤為重要。,減少冰晶的形成,未經(jīng)固定的組織切片時(shí)冰晶較多，這是公認(rèn)的事實(shí)，即使固定后的組織切片仍然會(huì)有一定的冰晶，為防止冰晶的形成，?？刹扇∪缦路椒ǎ?1.速凍法：將組織置入低溫環(huán)境，使組織驟然降溫。2.利用高滲溶液吸收組織分子：將組織置于20% 30%的蔗糖溶液中， 置4攝氏度冰箱足夠時(shí)間，觀察組織快，待其沉底后，取出切片。這樣即可大大減少冰晶的形成。,保持切片的完整性,破碎的組織切片必然丟失實(shí)驗(yàn)信息，切片的完整性對(duì)研究結(jié)果的分析無疑十分重要。切片破碎不全、有缺損的常見原因有： 1組

7、織固定不完全； 2溫度設(shè)置不當(dāng)。組織塊過冷、過硬，則切片就容易破碎。組織塊冷凍不夠，硬度和韌度達(dá)不到，切片也同樣易粘、易碎；3組織塊帶有皮膚、包膜、過大或冰晶過多；4 切片刀鈍或較臟，切片出現(xiàn)刮痕，使切片不完整；5操作手法不當(dāng)，如速度不適宜，切片也可能不完整。遇到上述情況，應(yīng)有針對(duì)性的采取相應(yīng)的措施。如注意組織固定充分、盡量減少冰晶的形成，保持刀片的清潔與鋒利，冷凍溫度要適宜，不同的組織應(yīng)設(shè)置不同的溫度，如較大組織塊或含有較多脂肪的組織應(yīng)設(shè)置溫度相對(duì)較低 ，冷凍時(shí)間稍長些。而腦、脊髓等溫度設(shè)置相對(duì)高些有作者采用“邊凍邊切”法制作切片，同樣也取得較好的效果。若組織帶有不必要的皮膚或包膜，應(yīng)盡量去

8、除干凈；如必須保留皮膚或包膜，應(yīng)注意采取相應(yīng)的切片技術(shù)，如最好將皮膚或包膜的平面與刀面垂直。此外，在切片時(shí)，應(yīng)注意速度均勻。當(dāng)然，要做好這些，必須有一定的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。,防止切片卷縮,切片卷縮是指切片不進(jìn)入防卷板與刀臺(tái)之間或當(dāng)掀起防卷板時(shí)切片卷起。常見原因有：切片刀鈍或粘有組織碎屑、防卷板位置不正確或防卷板較臟、靜電或者氣流作用、防卷板溫度高、室溫高等?？刹扇∫韵聦?duì)策： 1保持防卷板干凈、平整、無缺損、無刮傷，與切片接觸面應(yīng)為磨面，其邊緣應(yīng)于切片刀邊緣平行。2采取相應(yīng)措施去除靜電，操作者應(yīng)盡可能戴口罩，以避免呼出的氣流直接吹到防卷板。3切片時(shí)間過長時(shí)，應(yīng)注意間隔一會(huì)兒，蓋上冷凍室蓋，降低防卷板溫度

9、。4 開放式冰凍切片機(jī)，切片時(shí)暴露空氣中，溫度不易控制，在高溫季節(jié)，切片非常容易卷縮，切片技術(shù)難度大，采用凍刀加凍臺(tái)法效果好些。,貼片中常見問題及處理,載玻片粘不上切片。此情況多見于準(zhǔn)備片染的載玻片溫度過低，只要使載玻片與切片間有一定溫度差，切片即可貼到載玻片上，一般將載玻片置于常溫即可。, ( 貼片時(shí)切片易碎。排除固定不充分等因素外，漂片處理貼片時(shí)應(yīng)注意動(dòng)作輕、穩(wěn)、準(zhǔn)。根據(jù)切片大小，選用筆尖軟硬適中、大小合適的毛筆，將筆尖伸入片下水中，往上輕輕將切片挑起，并展開。,封片過程中常見問題分析及處理,封入氣泡注意通過擠壓蓋玻片將氣泡排除。 滴蛋白甘油過多封片時(shí)滴過多的蛋白甘油，就使整個(gè)片子顯得不干

10、凈，影響觀察，因此，應(yīng)注意適量，萬一過量，可先用濾紙沾干，片子晾干后，可用綢布蘸二甲苯擦除。,冰凍切片的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 簡便，可以不需要對(duì)組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。 快速，用時(shí)短。 組織變化不大。 能很好保存脂肪，類脂等成分。 能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。,缺點(diǎn)： 不容易做連續(xù)切片。 切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。 不容易制作較薄的切片。 組織塊在凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)

11、構(gòu)也不如石蠟切片清晰。,主要應(yīng)用于：,用于有些水解酶的定位的組織化學(xué)方法以及免疫組織化學(xué)方法等。 用于證明脂肪及類脂和神經(jīng)組織髓鞘的染色時(shí)的切片。 用于臨床手術(shù)的快速病理診斷。,冰凍切片與石蠟切片的比較,近年來隨冰凍切片技術(shù)的發(fā)展, 冰凍切片質(zhì)量明顯提高, 但與石蠟切片相比仍有一定的差距。石蠟切片由于組織受福爾馬林的作用, 固定迅速而完全, 且組織經(jīng)脫水透明及浸蠟多道步驟后, 使游離在組織中一些小分子物質(zhì)被洗脫, 組織再經(jīng)過充分的脫脂后非常容易與染色劑親合。故石蠟切片中細(xì)胞界限明確。染色分明, 背景清晰。 由于冰凍切片的制作原則與石蠟切片不同, 制作一張質(zhì)量高的冰凍切片不僅要做到組織速凍完全,

12、 防止冰晶產(chǎn)生, 并需注意切片染色的各個(gè)操作環(huán)節(jié), 而且冰凍切片固定完全與否也會(huì)對(duì)切片質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響。實(shí)驗(yàn)組冰凍切片先經(jīng)HS 固定液, 使其具有與石蠟切片相類似的環(huán)境, 組織固定徹底, 經(jīng)流水沖洗, 將多余的固定液和切片中溶于固定液的小分子物質(zhì)洗去, 這就消除了切片被遮蓋以至染色模糊的缺點(diǎn)。切片再經(jīng)第二液Clarke 固定液的再固定及酒精脫脂作用,使染色劑與組織親合性增強(qiáng)染色鮮明。還消除了因細(xì)胞核固定不良, 所致染色對(duì)比不分明的缺陷。對(duì)照組切片未經(jīng)HS 固定液及流水沖洗而直接入Clarke 固定液, 固定效果不如雙重固定法, 與實(shí)驗(yàn)組切片相比較則顯染色不甚清晰, 背景模糊。通過使用兩種不同固定方法結(jié)果的比較, 我們認(rèn)為雙重固定液法在冰凍切片中應(yīng)用良好, 明顯優(yōu)于Clarke 氏單液固定法, 值得推廣應(yīng)用。,合成膠水的影響,臨床病理工作中經(jīng)常遇到一些微小組織做冰凍切片,我們體會(huì)到,異體臟器組織包埋法中的異體臟器組織存留在載玻片上,不易擦除干凈,留有背景對(duì)切片外觀有影響,時(shí)有微小組織與異體臟器