1、a,1,11 高效液相色譜法 (HPLC),High Performance Liquid Chromatography High Perssure Liquid Chromatography High Speed Liquid Chromatography,a,2,自學(xué)“薄層色譜法”討論題,1. 熒光薄層板的組分是什么？它是否用于熒光化合物的檢測？ 2. 熒光薄層的展開動力？展開速度是否發(fā)生變化？ 3. 推導(dǎo)容量因子與比移值的關(guān)系？ 4. 什么是過壓薄層色譜法？ 5. 薄層色譜掃描儀的工作原理。 。,a,3,HPLC是在經(jīng)典液體柱色譜的基礎(chǔ)上, 在色譜理論指引下，加以改進而發(fā)展起來的。特別是

2、GC迅速成為一種儀器分析方法和社會需要分離分析難揮發(fā)復(fù)雜樣品促進了HPLC的發(fā)展。近年來它以6-8%的增長率發(fā)展，目前年發(fā)表論文數(shù)已超過GC。2000年儀器銷售全球第一。,a,4,表11.1 三種不同形式液相色譜的這樣特征,a,5,HPLC和經(jīng)典LC比較,HPLC和經(jīng)典LC主要差別在于高效固定相、輸液設(shè)備和連續(xù)檢測。從速率理論得到塔板方程：,渦流擴散、流型效應(yīng)和停滯流動相慢傳質(zhì)均與dp有關(guān)，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是顆粒細小。 固定相的慢傳質(zhì)與df有關(guān)，減少df有利于提高柱效。鍵合相色譜有效降低df，柱效進一步提高。,a,6, 經(jīng)典LC填料的缺陷 填料通常是粒度大、范圍寬、

3、不規(guī)則, 不易填充均勻, 擴散和傳質(zhì)阻力大, 譜帶展寬加大。它存在致命弱點：速度慢、效率低和靈敏度低。 HPLC填料（高效固定相） 顆粒細、直徑范圍窄、能承受高壓。達到傳質(zhì)阻力小, 分離效率高。早期HPLC的固定相用涂漬的方法制備，df大，這和GC一樣，會大大降低色譜柱的柱效。現(xiàn)代HPLC填料多用鍵合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。 (高效固定相帶來什么新問題？),a,7,使用高效填料帶來兩個新問題： 柱流動阻力大大增大，需要采用高壓泵輸液 表面能很大，采用專業(yè)的裝柱技術(shù) 目前經(jīng)典LC主要用于制備，若用于分析則采用脫機或非連續(xù)檢測。 HPLC的特征 采用高效色譜柱、高壓輸液設(shè)備和高

4、靈敏度檢測器, 從而實現(xiàn)了高效、高速和高靈敏度、定量準(zhǔn)確, 達到可與GC相媲美的分離分析性能。特別是結(jié)合計算機技術(shù)， HPLC已成為高度自動化和智能化的現(xiàn)代分析儀器。,a,8,a,9,歷史上出現(xiàn)不同的HPLC名稱： 高壓液相色譜 (High Pressure Liquid Chromatography) 高速液相色譜 (High Speed Liquid Chromatography) 高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography) 總之，HPLC與經(jīng)典LC相比, 使用時更方便, 對操作者的依賴性更小。HPLC的高重現(xiàn)性和連續(xù)的定量檢測導(dǎo)致了定性和

5、定量分析結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和精密度。 經(jīng)典LC的特點：簡便，填料一次使用。,a,10,高效液相色譜儀基本裝置,流動相,進樣閥,注入樣品液,色譜柱,檢測器,色譜處理機,高壓泵,流出液,a,11,a,12,高效液相色譜儀方框圖,流動相高壓泵進樣器色譜柱 檢測器積分儀 流速控制 閥進樣 溫度效應(yīng),a,13,a,14,a,15,旋轉(zhuǎn)式六通閥 a)取樣位（load）b)進樣位（injection）,a,16,a,17,a,18,一般來說，色譜和電泳儀的儀器流程基本相同。從構(gòu)成儀器的功能塊可分為六大系統(tǒng)：流動相供給和輸送系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和輔助控制系統(tǒng)。由于流動相的性

6、質(zhì)不同，流路系統(tǒng)的儀器結(jié)構(gòu)有所不同。但記錄和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)相同。 色譜檢測器 色譜數(shù)據(jù)處理,a,19, 流路系統(tǒng)（分析單元）：高、低壓流路 電路系統(tǒng)（控制單元）：信號傳輸與處理,a,20,色譜檢測器（對流出物進行連續(xù)檢測）,檢測器實際上是一種換能裝置, 它將流動相中組分含量的變化, 轉(zhuǎn)變成可測量的電信號(通常是電壓), 然后輸入記錄器。從原理分析，任何一種分析鑒定方法都可能色譜檢測器。理想的檢測器應(yīng)該是靈敏度高、線性范圍大、對所有待測組分相同響應(yīng)。一般檢測器分為； 熱學(xué)、光學(xué)、電學(xué)、電化學(xué)。檢測器 總體性質(zhì)檢測器：熱導(dǎo)、示差折射、電導(dǎo) 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器：氫焰、紫外、熒光 通用檢測器與選擇型檢測器

7、濃度型檢測器和質(zhì)量型檢測器,a,21,檢測器的線性、靈敏度和柱外效應(yīng)三個基本特性直接影響色譜定量分析的準(zhǔn)確度、精密度和再現(xiàn)性。 檢測器的線性范圍 大部分廠商都聲稱它們的檢測器在一定的濃度范圍內(nèi)是線性響應(yīng)。實際上檢測器的線性方程可表示為：y = a c , 只有在三個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)滿足0.98 1.02的線性響應(yīng)的檢測器才是線性的。 靈敏度 色譜分析中有三種不同的靈敏度表示法, 檢測器本身的靈敏度, 整個色譜體系的濃度靈敏度和質(zhì)量靈敏度。 對于定量分析來說, 重要的是色譜體系的靈敏度, 因為它還包括柱子和儀器的其它部分的影響。,a,22,檢測器的靈敏度(CD), 實際上指檢測限, 即通常指相

8、當(dāng)于兩倍噪音信號的溶質(zhì)濃度。而色譜體系的最小檢測限應(yīng)是柱外效應(yīng)10%的最大進樣體積所對應(yīng)的二倍于噪音峰高所對應(yīng)的樣品濃度。而色譜分析最重要的是色譜體系的質(zhì)量靈敏度, 最小可測量： m = 2CCD , C是柱內(nèi)效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 或 m = 6.25e(1k) , e是柱外效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 檢測器的色區(qū)展寬 對于毛細管氣相色譜和高效液相色譜，檢測器的色區(qū)展寬是柱外效應(yīng)的一個主要來源。一般儀器廠商在設(shè)計時已把檢測器的色區(qū)展寬減少到最低程度。,a,23,色譜數(shù)據(jù)處理,色譜數(shù)據(jù)處理通過ADC轉(zhuǎn)換器, 把模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號, 然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。,數(shù)據(jù)處理原理： 峰的檢測 數(shù)據(jù)采集

9、 基線校正和重疊峰的分離,自動處理 人工修正,a,24, 峰的檢測 峰的檢測和判別是依據(jù)在基線的訊號水平上，預(yù)設(shè)一個“閾值”，超過該值時，判別為峰可開始檢測。一般采用下面兩種方式判別峰訊號的變化：,依照信號斜率的變化檢測信號 依照積分面積檢測峰信號,a,25,保留時間和峰面積的計算, 基線校正和重疊峰的分離 在色譜分析中，經(jīng)常會遇到基線漂移和色譜峰不能完全分離的情況。通常采用谷谷規(guī)則或預(yù)設(shè)基線漂移值參數(shù)來解決,a,26,色譜儀自動定性和定量分析 定量計算是把各種計算公式編制成應(yīng)用軟件存入計算機，通過鍵盤來選擇所需方法。微處理機在定量計算時, 一般通過保留值來識別峰。但由于各種因素的影響, 在重

10、復(fù)多次分析中, 保留值會有一定的變化, 可采用下述兩種方法確定保留值的變化范圍。, “時間窗”法 (Time Window)：tRt 對整個色譜圖上各個峰的保留值都設(shè)定相同區(qū)間“時間窗” ，規(guī)定圖中各個峰保留時間的變化范圍。該法設(shè)置簡單，但用于識別保留時間相差很近的相鄰峰不大方便。, “時間帶”法 (Time Band): tR(1a%) 對每個需識別的定量峰，都設(shè)定一個保留時間的相對變動范圍。該設(shè)置較麻煩，但對不同峰可給出不同的變動范圍，對識別相鄰峰的分辨率較好，同時用于編組定量分析也很方便。,a,27,色譜數(shù)據(jù)處理機和色譜工作站的差別,色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)/機，積分儀 功能：色譜數(shù)據(jù)處理 AD

11、C模數(shù)轉(zhuǎn)換接口,色譜工作站 功能：色譜數(shù)據(jù)處理 控制儀器參數(shù) ADC和DAC模數(shù)轉(zhuǎn)換接口,a,28,色譜智能化和專家系統(tǒng)簡介,色譜智能化是新一代色譜儀的發(fā)展方向, 其特點是代替人的部分智能, 選擇分析方法和確定最佳色譜條件, 并有條件地進行部分組分定性工作。這項工作不僅要求計算機技術(shù), 更重要的是, 要加強色譜的基礎(chǔ)理論研究, 提高色譜操作技術(shù), 特別是制備出性能穩(wěn)定的色譜柱, 這樣才能使操作規(guī)范化, 以實現(xiàn)人工智能色譜。 色譜專家系統(tǒng)是色譜智能化的一個重要組成部分, 它從人工智能和數(shù)值計算方法出發(fā)開展研究, 應(yīng)包括以下幾大部分： 分離模式和柱系統(tǒng)的選擇； 預(yù)處理方法和檢測器的選擇； 分離條件

12、最優(yōu)化； 在線色譜峰的定性和定量； 色譜硬件的診斷。,a,29,色譜柱（固定相、填料）,色譜柱是色譜儀的心臟（起分離作用），其核心是優(yōu)質(zhì)固定相（填料） 。進行色譜分離的首要工作是選擇性能良好的色譜柱，即在確定的分離條件下分離效率高和分析時間短的色譜柱。 色譜柱的選擇應(yīng)考慮： 固定相類型的選擇, 主要取決于樣品分離模式； 柱填料的結(jié)構(gòu), 主要指顆粒的形狀大小、均勻性、比表面、平均孔徑和孔容等； 柱規(guī)格指柱內(nèi)徑、柱長度和填料粒度 色譜柱的牌號/廠商。,a,30,色譜柱的結(jié)構(gòu),色譜柱由柱管、填料、密封圈、過濾板、柱頭等組成。應(yīng)特別注意柱頭規(guī)格及無死體積連接的特性。 柱規(guī)格 制備柱 分析柱 微徑柱液相

13、色譜 (Microbore HPLC) 毛細管液相色譜 (Capillary HPLC) 快速柱：高效短柱，如4.630mm, 3mODS柱,整體柱（Monolithic column),a,31,整體柱(monolithic column) 是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內(nèi)進行原位聚合的連續(xù)床固定相,具有制備簡單、重現(xiàn)性好、多孔性優(yōu)越、能實現(xiàn)快速、高效分離等優(yōu)點。 制備技術(shù): 硅膠整體柱，如Merck 公司的Chromolith Performance RP - C18、Silica ROD 和Prep ROD； 有機聚合物整體柱，如BIA Separations 的CIM(Convec

14、tive Interaction Medai)等聚合物整體柱 應(yīng)用： 高效液相色譜(HPLC) 、毛細管電色譜(CEC) 、微柱液相色譜(- HPLC) 、固相萃取等系統(tǒng)上, 成功地應(yīng)用于生命科學(xué)、藥物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的分離分析。,a,32,何為無死體積柱頭連接？,無限直徑效應(yīng)（無限直徑柱）？,a,33,柱填料,1填料的特性 1）基質(zhì)材料 無機基體：硅膠、氧化鋁、氧化鋯和二氧化鈦等 交聯(lián)聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等 復(fù)合材料：無機基體復(fù)合一層聚合物 2）形狀：球形和不規(guī)則,硅膠和硅基仍是目前最廣泛應(yīng)用的液相色譜柱填料。此外還有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、無機金屬氧化物等。,a,

15、34,a,35,這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在70以下，pH28范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用廣泛.,硅烷化（SiOSiC）鍵合固定相 制備反應(yīng)如下： （最常見類型！）,a,36,3）粒度及分布范圍 4）孔徑和耐壓性 一般硅膠的孔徑在60-125A, 但大孔硅膠的孔徑為300-1000A。硅膠填料的產(chǎn)品差異主要取決于： 微粒基質(zhì)的制備過程差異； 基質(zhì)和鍵合物反應(yīng)的差異； 柱裝填技術(shù)專利的差異。,一些鍵合鍵新技術(shù)： （1）RX技術(shù) (Tx technology) “堿性脫活” （2）SB技術(shù) (Stabilized Bonding) “高覆蓋量” （3）封端技術(shù) (End-C

16、apping),a,37,1）為什么要封端？ 2）聚合物柱的特點？,封端 常規(guī) 聚合物,a,38,固定相類型 (Stationary phase),1）按色譜保留原理把填料分為：吸附劑、離子交換劑、涂敷固定液、分級孔徑或交聯(lián)度填料等。 2）按特性分類 硅膠：極性吸附劑 鍵合固定相 （為什么要鍵合？）,采用硅膠表面鍵合技術(shù), 對硅膠微粒表面進行修飾-硅烷化, 使得硅膠表面帶有不同的功能團, 以適應(yīng)不同的分離需要。目前在色譜填料中, 鍵合相約占78%(其中C18占反相色譜的72%), 硅膠約占10%)。 A.基質(zhì)：200-300m2/g的硅膠；聚合物, 如聚苯乙烯和聚乙烯醇膠等。,a,39,鍵合相

17、類型,烷基：C1、C2、C3、C4、C6、C8、C12、C16、C18、C22等反相柱； 苯基：C6H5-, 含有-相互作用； 氰基：-(CH2)3-CN, 帶有給電子作用、羥基的氫鍵作用；正相、反相均可。 氨基：-(CH2)3-NH2, 弱陰離子型鍵合相, 可用于糖分析。 其它極性鍵合相還有：二醇基Lichrosorb DIOL；硝基Nucleosil-NO2；二甲胺基Nucleosil-NMe2等。 C. 鍵合層（單層和聚合物）,a,40,柱性能測試 : 應(yīng)指定色譜條件和檢測物質(zhì),1理論塔板高度 2峰不對稱因子：應(yīng)小于或等于1.2 3相對保留值和分配比的重現(xiàn)性：精密度應(yīng)優(yōu)于5%和10% 4

18、柱阻力因子： = 0.1Pt0dp2(109L2)，多孔填料500-1000 5. 折合塔板高度,a,41,流動相 (Mobile phase),流動相（淋洗劑、洗脫劑）是影響液相色譜分離的一個非常重要的實驗因素。改變流動相的性質(zhì)和組成將改變?nèi)苜|(zhì)組分的保留值、分離選擇性和柱效。 在實際工作中，流動相的可選擇范圍較大是液相色譜的一個顯著特點。 流動相的選擇和優(yōu)化是大多數(shù)液相色譜分析的主要研究工作，在合理的時間內(nèi), 所用的流動相要能使樣品各組分達到足夠的分離。,a,42,高效液相色譜流動相溶劑的物化性質(zhì)（部分）,a,43,合適選擇性溶劑,液相色譜溶劑選擇范圍,液相色譜流動相溶劑的選擇步驟： 選擇具

19、有合適物理性質(zhì)的溶劑，如沸點、粘度、紫外截止波長等 選擇合適洗脫強度的溶劑：簡單樣品，2 k 5；復(fù)雜樣品，0.5 k 20 改變?nèi)軇┑倪x擇性，使被分離組分具有較高的值,所有溶劑,合適物理性質(zhì)溶劑,合適保留值溶劑,a,44,流動相溶劑的選擇,考慮溶劑的實用要求：在實際操作中所選用的流動相能保證色譜系統(tǒng)的分離過程可重復(fù)進行：溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求；溶劑應(yīng)當(dāng)不干擾檢測器的工作；在制備分離中, 溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去, 不干擾對分離組分的回收。 1與色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性：溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性, 不與固定相和樣品組分起反應(yīng)。 2溶劑的純度（包括毒性和價格） HPLC級：色

20、譜淋洗劑，波長透光率 A.R.級：主成分及雜質(zhì)含量,a,45,3溶劑的粘度要?。?一般 約為(0.4-0.5) mPas , 最大也不超過 2mPas。粘度大, 流動相傳質(zhì)慢, 柱效下降；同時柱壓增大。 4與檢測器匹配：UV檢測要求mp的背景吸收要低, 所用溶劑的截止波長 (T10%對應(yīng)的波長)要與之相匹配。而RI檢測則要求溶劑的折光指數(shù)與溶質(zhì)的差別要大, 以利于檢測。 5沸點低：對制備色譜, 采用低沸點溶劑時的固體殘留物少, 有利于提高純度。 6其他要求：溶劑對樣品要有一定的溶解度。mp用前要脫氣處理。便于更換和清洗。,a,46,液相色譜中的溶劑強度,1. 溶劑強度是描述色譜性能的主要指標(biāo)，

21、表示溶劑對樣品的洗脫能力，它決定于溶劑與溶質(zhì)之間分子的作用力。目前還沒有一個統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)描述不同類型液相色譜體系中的溶劑強度，而是采用相對極性和溶解度參數(shù)等作為溶劑強度指標(biāo)。,1)溶解度參數(shù)（參見溶劑選擇性） 2)極性參數(shù)P 根據(jù)固定相和流動相的極性大小, 人們把液相色譜分成： 正相色譜：固定相極性大于流動相 (包括硅膠吸附色譜) 反相色譜：固定相極性小于流動相,a,47,正相色譜：增加溶劑極性，保留時間增大或變??？,反相色譜：增加溶劑極性，保留時間又如何變化？,a,48,洗脫強度與溶劑極性,分子之間相互作用有色散力、偶極作用、氫鍵和介電作用。某一溶質(zhì)與其它分子相互作用大小的程度可以用極性大小表示

22、。極性越大, 它與其它分子的作用力越大。 “極性”溶劑容易吸收和溶解“極性”物質(zhì)。,溶劑洗脫強度指流動相中溶劑的洗脫能力, 它不僅與流動相，而且與固定相的極性有關(guān)。在正相色譜中, “溶劑洗脫強度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大, 洗脫能力越小。,a,49,溶劑強度圖,a,50,混合溶劑的極性,在液相色譜中, 一般溶劑的極性變化二個單位, 溶質(zhì)的分配比差不多能有十倍的變化。通過溶劑強度參數(shù)的計算, 可以較好地較快地選擇合適溶劑或調(diào)整流動相的極性范圍。如： 正相色譜：k2 / k1 = exp (P1P2)/2 反相色譜：k2 / k1 = exp (P2P1)/2 在液相色譜常用

23、混合溶劑作流動相?；旌先軇┑腜具有加和性： Pab = aPabPb , 為某一溶劑的體積分?jǐn)?shù)。,a,51,溶劑選擇性分類,一般地說, 改變?nèi)軇┍壤烧{(diào)節(jié)流動相的極性, 從而使得組分的容量因子落在合適的范圍內(nèi)。但由于分子間相互作用的類型相同, 分離因子變化不大。因此專門研究了各種溶劑的選擇性, 并將常用溶劑進行分類。,a,52,質(zhì)子給予體,偶極相互作用,質(zhì)子接受體,溶劑選擇性分類三角形圖,Xe,Xd,Xn,1,2,3,4,5,6,7,8,純質(zhì)子接受體,強偶極中性化合物,純質(zhì)子給予體,a,53,1 組：脂肪醚（純質(zhì)子接受體） 2 組：脂肪醇（質(zhì)子接受-給予體） 3 組：吡啶衍生物、四氫呋喃（質(zhì)子

24、接受體，易極化） 4 組：乙二醇、芐醇、乙酸、甲酰胺（質(zhì)子給予體） 5 組：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶極距） 6 組：脂肪酮、酯、二氧六環(huán)、腈 7 組：芳烴、芳醚、硝基甲烷 8 組：氟代醇、氯仿、水（質(zhì)子給予體）,a,54,質(zhì)子給予體,偶極相互作用,質(zhì)子接受體,反相色譜中的溶劑選擇性,1,甲醇2,TFH3,4,5,乙腈6,7,水8,a,55,質(zhì)子給予體,偶極相互作用,質(zhì)子接受體,正相色譜中的溶劑選擇性,醚 1,2,3,4,二氯乙烷 5,乙腈 6,7,8,CHCl3 8,主溶劑：己烷,a,56,按溶劑分子的特殊作用類型分類, 采用三個不同的常數(shù)表示： Xe(接受質(zhì)子參數(shù))易與含羥基的分子作用(如酸

25、類、酚類)； Xd(給質(zhì)子參數(shù))易與堿性化合物作用(如胺、亞砜等)； Xn(強偶極參數(shù))易與偶極距較大的溶質(zhì)分子作用(如硝基化合物、腈、亞砜和胺類等)。 通常把常用溶劑分成八組。同一組溶劑的三個選擇性參數(shù)相近，其選擇性相似。當(dāng)某一溶劑不能提供足夠的分離選擇性時, 那么更換同組的其它溶劑亦不能提高選擇性。改變?nèi)軇r, 只有從距離較遠的溶劑組挑選, 才可能使選擇性有較大變化。因為當(dāng)溶劑和樣品分子的各種相互作用的相對重要性發(fā)生明顯變化時, 流動相的選擇性才會發(fā)生最大程度的改變。,a,57,流動相的優(yōu)化,流動相的優(yōu)化主要是考察流動相組成對保留時間、分離因子和分離度等參數(shù)的影響。 使用混合溶劑最大優(yōu)點是

26、：獲得最佳的分離選擇性；保持流動相的低粘度, 從而保證高的柱效。,在吸附色譜中混合溶劑選擇規(guī)則：混合溶劑中極性強的組分含量大或小時, 有最大的值；能與溶質(zhì)發(fā)生氫鍵作用的溶劑, 有較好的分離選擇性。,a,58,梯度洗脫技術(shù),梯度洗脫的特點 梯度洗脫的主要條件 梯度洗脫的基本原理,梯度洗脫（溶劑程序）：通過改變流動相的組成來調(diào)整組分的k值，改變分離因子值，以達到最短時間內(nèi)得到最佳分離的目的。,為什么程序升溫在液相色譜中沒有受到青睞？,在液相色譜中最低溫度和最高溫度受到流動相的黏度和沸點的限制；同時它的溫度效應(yīng)比較小。,a,59,1梯度洗脫的特點,（1）改善分離, 加快分析速度； （2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測；,