1、.,1,腫瘤血管生成 及檢測(cè)重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室葉秀峰,.,2,人體腫瘤大部分為實(shí)體瘤(solid tumors)。實(shí)體瘤瘤組織由瘤細(xì)胞和間質(zhì)構(gòu)成，后者主要包括血管、淋巴管、結(jié)締組織、炎細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等成分。其中，血管和結(jié)締組織起營(yíng)養(yǎng)、支持瘤細(xì)胞的作用。,.,3,腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實(shí)現(xiàn)的，并在腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散(侵襲和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。已有研究證明，腫瘤血管生成活躍程度對(duì)組織病理分級(jí)、放射治療以及在預(yù)后判斷上都有重要的評(píng)估價(jià)值。,.,4,第一節(jié) 腫瘤血管生成的基本過程 一、血管生成現(xiàn)象 (一

2、)血管生成的概念 1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumor angiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對(duì)血管生成重要性的認(rèn)識(shí)，特別是提出“腫瘤生長(zhǎng)依賴于血管生成”觀點(diǎn)，始于1 971年Folkman對(duì)腫瘤血管生成的研究報(bào)道。,.,5,血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過程。 有別于胚胎時(shí)期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的過程即血管形成(vasculogenesis) (二)血管生成的研究方法 雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn) 角膜移植實(shí)驗(yàn),.,6,開窗實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物移植瘤等在體模型 三維膠分析

3、法 細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)等離體模型 識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物 :第8因子相關(guān)抗原(factorrelated antigenFAg)、CD3l、CD34、CDl05 血管生成因子:VEGF及其受體家族 FGF家族及其受體 Ang和Tie受體家族 Angiotropin 血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF),.,7,二腫瘤血管生成的基本過程 (一)血管生成的基本過程 血管生成的基本步驟是 血管生成因子的產(chǎn)生過多使之與抑制因子失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活，產(chǎn)生血管生成表型； 血管部位細(xì)胞外基質(zhì)改變、基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞芽生、增殖和遷移；,.,8,新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔； 新生血管管腔的貫

4、通。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、脫離基底膜和血管壁細(xì)胞改變可能是血管消退的主要病理學(xué)事件。 (二)腫瘤血管生成的過程 1腫瘤生長(zhǎng)的階段性 無血管期(avascular phase)或稱血管前期(prevascular phase) 腫瘤直徑不超過12mm,.,9,血管期(vascular phase) 腫瘤迅速生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移 2.腫瘤血管的起源 腫瘤中的血管可能有3種來源： 血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細(xì)胞團(tuán)先處于無血管期生長(zhǎng)，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導(dǎo)血管生成；另一種是瘤細(xì)胞先依賴宿主組織已存在的血管生長(zhǎng)，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導(dǎo)血管生成因子作用而發(fā)生血管生成 血管套疊性

5、生長(zhǎng),.,10,內(nèi)皮祖細(xì)胞 3腫瘤血管生成的過程 瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 血管生成因子 (VEGF等) 小血管毛細(xì)血管伸展 內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成毛細(xì)血管芽 新生毛細(xì)血管形成并連通,.,11,第二節(jié) 腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性 腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學(xué)功能上也有其特殊性。 一腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn) 腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個(gè)腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱為所謂“血管熱點(diǎn)區(qū)”(hot spots)，這也是進(jìn)行腫瘤微血管密度測(cè)定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長(zhǎng)活躍的邊緣。,.,12,腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，

6、管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞；或管壁很厚，但結(jié)構(gòu)上仍然不完善。內(nèi)皮細(xì)胞般比較幼稚，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時(shí)血管外的腫瘤細(xì)胞可直接與血管管腔相連。 腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是這些血管具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。,.,13,不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。 生長(zhǎng)活躍的惡性腫瘤常富于血管如內(nèi)分泌腫瘤腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。 不同腫瘤血管的形態(tài)又有一定的差異，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細(xì)胞呈不同程度

7、的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細(xì)胞癌等血管呈壁薄、明顯擴(kuò)張的血竇。,.,14,以惡性膠質(zhì)瘤為例，腫瘤組織內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式有: 梭形內(nèi)皮細(xì)胞呈索狀排列，枝狀分布，有或無明顯的血管腔，呈原始、幼稚的微血管 內(nèi)皮細(xì)胞增生、肥大，管腔狹小，呈現(xiàn)厚壁血管 內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成球形血管壁內(nèi)血管呈現(xiàn)“腎小球樣結(jié)構(gòu)”； 管腔大、管壁較薄的相對(duì)較大的微血管，并形成血管心假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)； 大量管壁退變和鈣化的新生血管；,.,15,增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障； 血管內(nèi)皮區(qū)域性極度增生，呈片狀的梭形細(xì)胞，構(gòu)成“假肉瘤化”。 二、腫瘤微血管的生物學(xué)特性 低反應(yīng)性 高通透性 低供氧能力,.,

8、16,最近，Vogelstein B和Kinzler KW采用基因表達(dá)的系列分析(serial analysis of gene expression SAGE)方法，比較研究了結(jié)直腸癌和正常腸黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者基因表達(dá)存在差異。他們得到了79種差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子，其中TEM8僅表達(dá)于腫瘤內(nèi)皮而不表達(dá)于黃體形成中的內(nèi)皮細(xì)胞，提示腫瘤血管生成和生理狀態(tài)下的血管生成有明顯不同。這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。,.,17,第三節(jié) 腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制 腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenic factor

9、s)和血管生成抑制物(angiogenesis inhibitors)的調(diào)控。腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變化的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進(jìn)血管生成。組織中同時(shí)也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對(duì)血管生成起抑制作用。,.,18,一、血管生成因子 血管生成的始動(dòng)需要血管生成因子。一系列血管生成因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機(jī)械性因子均參與了血管生成過程。 已知的血管生成因子有數(shù)十種，其中VEGF和Ang家族是已知的、特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，在血管生成中作用可能也是最為重要的。,.,19,(一)VEGF及其受體家族

10、 1VEGF家族及其愛體 VEGF又稱血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，為分子量3445kD的同源二聚體糖蛋白，屬于堿性蛋白。VEGF基因通過轉(zhuǎn)錄水平的剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個(gè)氨基酸組成。,.,20,其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴(kuò)散力強(qiáng)，易于到達(dá)靶細(xì)胞。 近年又發(fā)現(xiàn)其他一些與VEGF功能相似、結(jié)構(gòu)上有一定同源性的多肽因子，包括胎盤生長(zhǎng)因子(placentor growth

11、 factor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相關(guān)因子，VEGF-related factor， VRF)，VEGF-C(VEGF相關(guān)蛋白，VEGF-related protein，VRP)，以及VEGF-DFIGF和VEGF-E等成員，它們共同構(gòu)成VEGF家族,.,21,VEGF受體包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1KDR)和 VEGFR-3(Flt-4) 2VEGF及其受體的作用 : 早期血管的形成需要VEGF的調(diào)節(jié)，它們與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細(xì)胞分裂和分化，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。 在胚胎發(fā)育過程中，VEGF(主要是VEGF-A)通過其受體

12、VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1KDR)促進(jìn)內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成.,.,22,由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR-1的表達(dá)和激活，而VEGFR-3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。 VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。 VEGF在幾乎所有的人體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中皆有過表達(dá)。VEGF及其受體在腫瘤中的表達(dá)常與腫瘤分化程度密切相關(guān)。,.,23,大多數(shù)實(shí)體瘤VEGF基因均有過表達(dá)，VEGF165 VEGF121兩種VEGF最常見。 在VE

13、GF家族中，VEGF-C和VEG-D既可誘導(dǎo)血管生成，又可誘導(dǎo)淋巴管生成。已有研究報(bào)道，人體多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF-C。 體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)，腫瘤細(xì)胞VEGF-C的高表達(dá)能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管生成。 腫瘤組織中的VEGF-C和VEGF-D還來源于浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。,.,24,缺氧是包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個(gè)強(qiáng)烈的誘導(dǎo)因子 離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達(dá)的誘因。 VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。 腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。 多種癌基因的激活通過上調(diào)VEGF表達(dá)而誘導(dǎo)血管生成，失

14、活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導(dǎo)的血管生成過程。,.,25,(二)FGF家族及其受體 1FGF家族 目前研究最為深入的是堿性戒纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)。bFGF和aFGF在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，二者之間有53的序列同源。 2FGF的分布和生物學(xué)作用 bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長(zhǎng)因子之一，可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可以合成它。,.,26,其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導(dǎo)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增

15、殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。 bFGF和aFGF均與肝素有很強(qiáng)的親和力，研究表明這種高親和力對(duì)于FGF與細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合是非常重要的。,.,27,3FGF受體 bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)識(shí)別4種FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。 FGFR-1在bFGFFGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中FGFR-1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即組織中有些細(xì)胞呈現(xiàn)FGFR-1陽性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細(xì)胞亦是如此

16、。,.,28,(三) Angiotropin AngiOtropin是一個(gè)含銅離子的45kD核酸與多肽的聚合物。將angiotropin加入到已匯合的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，它以劑量依賴方式刺激內(nèi)皮遷移并快速排列成管樣結(jié)構(gòu)，這種效應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是特異的。由于它是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，所以它可能啟動(dòng)炎癥和傷口愈合中的血管生成過程。,.,29,（四）血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF) PD-ECGF是一個(gè)酸性45kD單鏈多肽。 它是內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂素，能刺激人和豬的內(nèi)皮細(xì)胞增生。用PD-ECGF轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，其裸鼠移植瘤血管密度明顯增加。 (五) 其他血管生成因子 Ang和Tie

17、受體家族 EGF TGF 粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(G-CSFGMCSF),.,30,(七)降解基底膜的相關(guān)物質(zhì) 血管基底膜的降解是血管生成過程中的重要事件，只有基底膜降解之后，內(nèi)皮細(xì)胞才能遷移入周圍組織并形成血管芽。 基底膜的降解是一復(fù)雜過程，涉及一系列酶的作用，這些酶包括基質(zhì)金屬蛋白溶酶、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen,u-PA)；絲氨酸蛋白酶(serine proteases)、細(xì)胞外蛋白體(proteasome)、糖苷酶(endoglycosidases)、組織蛋白酶(cathepsins)和多形核白細(xì)胞絲氨酸蛋

18、白酶(serine proteinase)。,.,31,u-PA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。U-PA使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)為纖維蛋白溶酶,后者能降解基質(zhì)蛋白并激和幾種基質(zhì)金屬蛋白酶。 (八)細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)黏附受體 在血管生成型中不但需要細(xì)胞因子與相應(yīng)受體的結(jié)合，細(xì)胞外基質(zhì)(extraceIlular matrix, ECM)也起著重要作用。 內(nèi)皮細(xì)胞獨(dú)自在接受生長(zhǎng)因子的刺激時(shí)只表現(xiàn)增生，而在有細(xì)胞外基質(zhì)的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞才能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。,.,32,二、缺氧對(duì)血管生成的誘導(dǎo)作用 缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子包括缺氧誘導(dǎo)因子-1、-2(hypox

19、ia inducing factor-l，-2，HIF-1HIF-2)和NF-B,其中以HIF-l在血管生成中的作用最為重要。 在腫瘤組織中，缺氧一方面可導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡，另一方面也刺激殘留瘤細(xì)胞上調(diào)血管生成因子的表達(dá)。,.,33,第四節(jié) 血管生成的有關(guān)檢測(cè)方法 一.腫瘤血管生成的體內(nèi)研究動(dòng)物模型 腫瘤血管生成體內(nèi)研究的生物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕袆?dòng)物(大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)等四種動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)這四種模型均有研究。有研究認(rèn)為CAM是研究血管生成較好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其方法?jiǎn)便二成本低，儀器設(shè)備條件要求不高，易于操作，便于推廣；并可用于進(jìn)行大樣本研究

20、，或用于影響血管生成的因素或藥物的篩選和評(píng)價(jià)。因此，特將CAM試驗(yàn)方法作簡(jiǎn)單介紹：,.,34,雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn): (1)雞胚準(zhǔn)備和接種組織：選擇北京白雞種蛋，洗凈，用l：1000苯扎溴銨(新潔爾滅)液浸泡3分鐘，置378土05培養(yǎng)箱中孵育。雞胚發(fā)育第7天，蛋殼消毒后，標(biāo)記制作2cmX3cm左右觀察窗。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當(dāng)日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成12mm組織小塊。 (2)組織接種：在制備雞胚觀察窗的次日，即雞胚發(fā)育第 8天進(jìn)行組織接種。每個(gè)雞胚可接種57個(gè)組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。,.,35,(3)接種組織的收獲與觀察：

21、 組織接種后每12小時(shí)觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察，并用10甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。 (4)CAM的血管生成表現(xiàn)：組織接種24小時(shí)后，CAM血管開始向接種組織生長(zhǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，血管數(shù)目及直徑均明顯增加；第2天，新細(xì)小血管直接趨向組織；,.,36,第3天，新生血管形成以接種組織為中心，1020條放射狀血管網(wǎng)；爾后，CAM血管繼續(xù)明顯增加。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數(shù)目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；而接種部位的CAM血管在接種組織周圍彌散樣增加，

22、以組織為中心向周圍呈放射狀分布，在首 先與組織發(fā)生聯(lián)系的區(qū)域CAM血管更多。第4天，可見 新生細(xì)小CAM血管生長(zhǎng)形成中、粗血管，并在中、粗血管繼續(xù)分支出細(xì)小血管，形成新的血管網(wǎng)。CAM血管管腔結(jié)構(gòu)清晰，可區(qū)別動(dòng)、靜脈。,.,37,(5)CAM血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠猛荆篊AM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得兩方面結(jié)果：檢測(cè)評(píng)價(jià)接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促進(jìn)因子、抑制因子的活性和作用的檢測(cè)，如腫瘤血管生成的研究等；對(duì)接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進(jìn)行研究，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用.,.,38,對(duì)照,抗血管生成

23、藥物作用以后,.,39,盡管血管生成的體內(nèi)動(dòng)物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結(jié)果更為可靠，但Kathryn等認(rèn)為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時(shí)過長(zhǎng)；另外，在該類模型中，血管生成物必須植入眼角膜囊、頰囊、或絨毛尿膜囊使之誘導(dǎo)血管生成，難免產(chǎn)生人為因素誘導(dǎo)的血管生成；血管生成促進(jìn)因子、抑制因子等需要從多聚載體中釋放出來；操作方法和測(cè)定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型: 二.人胎盤血管培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(體外)Kathryn等認(rèn)為不但既往的體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)研究模型有上述不足之處，而體外的血管生成實(shí)驗(yàn)研究也主要是內(nèi)皮細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)，將內(nèi)皮細(xì)胞

24、置于細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，或者暴露于各種血管生成刺激因子，使之誘導(dǎo)其血管形成。,.,40,該類體外實(shí)驗(yàn)研究，有很多人為因素影響，不能代表體內(nèi)生理反應(yīng)，因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)因子存在的條件下培養(yǎng)了很長(zhǎng)一段時(shí)間，已被激活。因此，有必要建立一類與體內(nèi)生理反應(yīng)有關(guān)的血管生成實(shí)驗(yàn)方法，尤其是與人類血管生成有關(guān)的血管生成實(shí)驗(yàn)。 于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。從自愿選擇剖腹產(chǎn)手術(shù)24小時(shí)之內(nèi)的人胎盤頂端表面截取約長(zhǎng)25cm，直徑為l2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。,.,41,培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培養(yǎng)基，將血管片段在凝固前迅速

25、加入培養(yǎng)孔中央，理想的是使血管片段懸浮于培養(yǎng)膠中。然后將培養(yǎng)板置37保濕孵育培養(yǎng)1421天，每周換培養(yǎng)基2次。用減數(shù)成相系統(tǒng)計(jì)；算原來血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計(jì)數(shù)新生長(zhǎng)形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長(zhǎng)曲線。,.,42,用免疫組化、流式細(xì)胞儀、電鏡等分別檢測(cè)了CD34，Weibel-Palade小體標(biāo)志物等， 證實(shí)新生血管中含有內(nèi)皮細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒?需要加外源性生長(zhǎng)因子，并用該模型檢測(cè)研 究了aFGF、bFGF，三種VEGF異構(gòu)體及其受 體在原代血管生長(zhǎng)及子代新生血管形成中的作用。結(jié)果表明該模型是篩選人類血管生成潛在 激活增強(qiáng)因子和抑制因子行之有效的體外實(shí)驗(yàn) 模型。,.,43,三.

26、腫瘤微血管密度計(jì)數(shù)(MVD) 用F因子單克隆抗體在組織切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色 ,血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色 。 MVD計(jì)數(shù)按Weidner等的方法并加以改動(dòng)，先在低倍視野內(nèi)找到MVD最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計(jì)數(shù)微血管的數(shù)目。分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計(jì)入結(jié)果，單個(gè)的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇作一個(gè)血管計(jì)數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。計(jì)5個(gè)視野的IMVD，取其平均值作為IMVD。,.,44,四.腫瘤血管生成調(diào)控因子的檢測(cè) 以VEGF為例,根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和需要可以從蛋白質(zhì)水平或核酸水平進(jìn)行檢測(cè): (一)免疫組織化學(xué)檢測(cè) 用VEGF單克隆抗體在組織切片或細(xì)胞爬片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)

27、染色 , 腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕黃色 。,.,45,培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 VEGF陽性表達(dá),.,46,培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá),.,47,培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá),.,48,(二)Western blot 基本原理: 免疫印跡又稱Western印跡(Western blot)，與DNA的Southern印跡技術(shù)相對(duì)應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測(cè)特異性組分。不同的是，Western blot所檢測(cè)的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力

28、高和固相免疫測(cè)定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)，以及從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無需對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。,.,49,Western blot的過程分四階段 a.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測(cè)定 b. SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSPAGE） c.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜) d.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)(雜交) 1.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測(cè)定 A.樣品的制備 組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0研磨，加入5STOP buffer，180W，6mins，0超聲波破碎，5000rp

29、m，5mins 離心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。,.,50,細(xì)胞的處理方法： 離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入5STOP buffer，收集，180W，6mins，0超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。 分泌蛋白的提?。?直接收集分泌液，加入-ME、溴酚藍(lán)制樣。 B.蛋白的定量方法: a.雙縮脲法： b. Lowry法： c

30、.紫外吸收法 : e. Bradford比色法：,.,51,2.SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSPAGE） A：實(shí)際操作 做膠前的準(zhǔn)備 1)檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。 2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。 3)按將要檢測(cè)的抗體對(duì)應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算 出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。 制膠，電泳 1）裝好架子。 2)按照配方配制分離膠。 在膠上面加入一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。 3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。,.,52,倒好濃縮膠后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。 4)待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠

31、時(shí)，用100-120V電壓。一般電泳時(shí)間在1.5小時(shí)左右。 注意事項(xiàng)及常遇到的問題 1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空 間，否則起不到濃縮效果。 2）上樣蛋白量不應(yīng)超過樣品槽。 3）gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過快表TEMED、APS用量過多，此時(shí)膠太硬易龜裂，而且電泳時(shí)容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí)際不純或失效。,.,53,4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。 5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象： 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者

32、兩邊聚合不完全。 拖尾：樣品溶解不好。 紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。 條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。 條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過多。,.,54,3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜): 在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。 膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。,.,55,轉(zhuǎn)膜有2種方法: A .半干法 即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，

33、但是其轉(zhuǎn)移時(shí)間短，效率高。 1) 實(shí)驗(yàn)條件的選擇 電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，具體可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。,.,56,目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉(zhuǎn)移時(shí)間(h) 80-140 8% 1.5-2.0 25-80 10 1.5 1540 12 0.75 20 15 0.5 2 )實(shí)驗(yàn)操作 （1）濾紙和膜的準(zhǔn)備 (在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作)。 a.檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即配制 b.檢查是否有合適大小的濾紙和膜。,.,57,c.將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transfer buff

34、er中。 d.將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。 （2）轉(zhuǎn)移 a.在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。 b.將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤(rùn)。 c.將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。 d.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。 e.將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。 f.裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時(shí)間。 g.轉(zhuǎn)移過程中要隨時(shí)觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時(shí)調(diào)整。,.,58,.,59,3 注意事項(xiàng)及常遇到的問題 1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙=膜=