1、、1、流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用概況、流式細(xì)胞術(shù)系列講座概況、2、流式細(xì)胞術(shù)一般介紹流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測和科研中的應(yīng)用免疫學(xué)檢測和科研應(yīng)用腫瘤學(xué)檢測和科研應(yīng)用凋亡分析血液學(xué)檢測和科研應(yīng)用的其他應(yīng)用，主要內(nèi)容、3、流式細(xì)胞術(shù)一般介紹，第一部分、4、流式細(xì)胞術(shù)是什么？ 流式細(xì)胞儀：是集光電物理、光電測量技術(shù)、液流技術(shù)、計算機技術(shù)等現(xiàn)代高新技術(shù)于一體的細(xì)胞球測量和分析儀器。 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM):是一種應(yīng)用流式細(xì)胞儀對快速流動液體中的細(xì)胞球和生物粒子進(jìn)行殘奧儀、快速測定和量化分析、篩選的技術(shù)。5、流式細(xì)胞儀的特點、多殘奧儀測定和分析(散射光和熒光)快速測定和分析，每秒1000-10

2、000個細(xì)胞球的篩選純度可達(dá)99%以上。 所獲取的數(shù)據(jù)分析結(jié)果通常具有統(tǒng)計學(xué)意義，待測細(xì)胞球如各種細(xì)胞球必須存在于單個細(xì)胞球混懸劑中。 另外，還可以測量微生物等生物粒子，將微球的非生物粒子合成為人造的，6，F(xiàn)ACSCalibur，特點：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)的固定自動化程度高，操作簡單，壽命長，12條激光細(xì)胞球的篩選速度慢，主要用于細(xì)胞球分析，臨床型(臺式掌門人)、，7， 流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞球殘奧儀細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞球大小細(xì)胞球顆粒性程度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量和細(xì)胞周期RNA含量，細(xì)胞球功能細(xì)胞表面蛋白抗原細(xì)胞漿內(nèi)蛋白性抗原細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，8，流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)中常見圖形： (2維)

3、 點圖，應(yīng)用：雙殘奧儀分析，九流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)中常見的格拉夫：圖像直方圖，應(yīng)用：單殘奧儀分析只是觀察一個熒光強度的變化，1.0，流式細(xì)胞儀分析圖，SSC (側(cè)向散射光)反應(yīng)細(xì)胞球內(nèi)粒子數(shù)，F(xiàn)SC (前向散射光)反射散射光信號、1.1特征信息熒光、FL1 (第一熒光)-FITC (異硫氰酸酯熒光) FL2 (第二熒光)-PE (紅紫素) FL3 (第三熒光)-PerCP、PeCy5等PL4 (第四熒光) -美國電力轉(zhuǎn)換公司(花青)、流式細(xì)胞儀分析圖、雙色直接染色， 設(shè)立1.2門：選擇要分析的細(xì)胞球組，設(shè)定陰性、陽性范圍，1.3、流式細(xì)胞術(shù)在臨床和科研中的應(yīng)用，第二部分，一，免疫學(xué)和科研中的應(yīng)用

4、，1.4，1，細(xì)胞表面分子標(biāo)記(以淋巴細(xì)胞亞群檢測為例)，15，原理，人淋巴細(xì)胞及其生物功能和細(xì)胞表面抗原的表達(dá)t淋巴細(xì)胞專一性標(biāo)記為CD3，含有CD4和CD8T細(xì)胞球兩組的b淋巴細(xì)胞專一性標(biāo)記為CD19； NK自然殺傷細(xì)胞表達(dá)CD56或CD16而不表達(dá)CD3可以使用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面抗原耦合，并且通過添加多色熒光染料，淋巴細(xì)胞可以分成各種子類型。 進(jìn)而得到各亞群的比例。1.6、t淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群檢測： T cells、T subsets、NK cells、B cells、1.7、淋巴細(xì)胞亞群和功能、1.8、CD4 CD25 CD127-Treg檢測，1.9、淋巴細(xì)胞亞群和功能

5、、2.0、淋巴細(xì)胞亞群和疾病淋巴細(xì)胞亞群檢測意義，疾病反應(yīng)歷程研究，疾病輔助診斷，移植術(shù)后免疫檢測，治療方案確定和療效評價，CD25超過正常值510%，拒絕CD4/CD8比率降低，提示合并危險感染。 免疫抑制劑CD2 HLA-DR停用后必須增加51.0 % CD25不增加，伴有巨細(xì)胞病毒感染、慢性疲勞、感染后綜合征、纖維肌痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏等疾病預(yù)防、2.2、淋巴細(xì)胞亞群檢測意義、活動期和非活動期SLE、2.3，2、 細(xì)胞球內(nèi)分子流式細(xì)胞術(shù)檢測(以Th1/Th2細(xì)胞因子檢測為例)、2.4、Th1/Th2細(xì)胞球2.5、Th1/Th2細(xì)胞球、Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、

6、巨噬細(xì)胞活化、局部炎癥刺激源：病毒， 基于某細(xì)菌Th2型介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的b細(xì)胞球增殖、多克隆免疫球蛋白分泌細(xì)胞、I型抗變態(tài)反應(yīng)(抗變態(tài)反應(yīng))刺激源：多細(xì)胞球寄生蟲、致敏原、2.6、Th1/Th2細(xì)胞PMA Ionomycin刺激4-6hr， 用2.7、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞因子，經(jīng)新鮮分離PBMC和PMAIo刺激后6h檢測細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞因子IL-4和IFN-g，2.8， 檢測Th1/Th2失衡相關(guān)疾病、細(xì)胞球內(nèi)寄生病原生物感染性疾病Th1細(xì)胞球及其細(xì)胞因子保護(hù)免疫Th2細(xì)胞球及其細(xì)胞因子發(fā)病如結(jié)核病、慢性感染過敏疾病Th2細(xì)胞球及其細(xì)胞因子過敏哮喘等(IgE ) 自身免疫性疾病Th1細(xì)胞

7、球及其細(xì)胞因子為炎癥性增強的指標(biāo)Th2細(xì)胞球及其細(xì)胞因子免疫耐受性/腫瘤免疫Th2細(xì)胞球及其細(xì)胞因子腫瘤發(fā)病的抑制，2.9，Th1/Th2細(xì)胞球的檢測意義，疾病治療， 發(fā)病機制研究采用Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子IFN-治療麻風(fēng)，Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子或抗其接納體的抗體IL-4抗體治療真菌和寄生蟲感染，Th2/采用調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞因子平衡的藥物：酞胺哌啶酮治療巨細(xì)胞病毒炎，疾病監(jiān)測，3.0二，在流式細(xì)胞術(shù)腫瘤學(xué)中的應(yīng)用，腫瘤發(fā)展，3.1，1，DNA多倍體和細(xì)胞周期分析，32，細(xì)胞周期和DNA多倍體分析的原理，1， 正常細(xì)胞DNA含量在2C水平穩(wěn)定，2，性細(xì)胞球DNA含量為1C，3，增殖期至分裂

8、期細(xì)胞球為2C至4C，4，凋亡細(xì)胞球DNA缺失，含量為2C，3.3細(xì)胞球被熒光染料(碘化吡啶，PI )染色，利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞球DNA含量后得到s和G2/M期)的DNA含量()，能夠反映細(xì)胞球的增殖狀態(tài)和非二倍體(同分異構(gòu)體)的DNA含量的diploid 3360.00 % dipg 1:38 % at46.90 dipg 23360.91 % at91.61 dips 3360.71 g1:95%cv:23，G0/G1，s，G2/M， 3.4 diploid :50 % dipg 1:45 % at49.24 dipg 23360.30 % at98.48 dips :26 % g2/g

9、 133602.00 % cv 3360.21安全級別13360.50 % an1g 13360.69 % at 58.53 an1g 23360.00 % at 123.89 an1s 3360.31 % g2/g 133602.12 % cv 3360 凍結(jié)或固定(酒精或甲醛)保存的組織通常用于固定/包埋組織檢查的樣品(蠟塊)。 最好的結(jié)果通常來源于新鮮或凍結(jié)的標(biāo)本。蠟塊包埋的標(biāo)本需要特殊處理，3.6、意義、70%的人癌中存在異倍體或細(xì)胞周期的變化，1.Ross js.dnaploidyandcellcycleanalysisinpathology.new York : IgA ku-sh

10、o in； 1996:47-60、DNA多倍體與s期的比率-2卵巢癌、乳腺癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、原發(fā)部位不明的癌、早期(I/II期) DNA多倍體和DNA指數(shù)-預(yù)后長期和無病生存期2卵巢癌-晚期2.therecommendmedicarenationalcoveragepolicyforflowcytometry.hcfawebsite，1999，3.7，2，腫瘤相關(guān)基因查詢密碼蛋白檢查與病理學(xué)分類有關(guān)，與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與大腸腫瘤、早期發(fā)現(xiàn)大腸癌、胃腫瘤、預(yù)后相關(guān)、肝細(xì)胞癌、組織分類、腫瘤預(yù)后、轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)，與3.9、Bcl-2、Bcl-2在正常組織中的表達(dá)、造血系統(tǒng)細(xì)

11、胞球淋巴、 單核細(xì)胞等被荷爾蒙激素和生長因子調(diào)節(jié)的腺上皮前列腺腺上皮，子宮內(nèi)膜等干細(xì)胞和高附加值細(xì)胞球皮膚的基細(xì)胞腸上皮壽命長的分裂細(xì)胞球神經(jīng)元胚胎組織，Bcl-2在腫瘤組織中的表達(dá)，腎癌、腎盂乳頭瘤、Wilms瘤、腎嗜酸細(xì)胞瘤前列腺癌b細(xì)胞淋巴瘤乳腺癌(43% )，甲狀腺癌，40，nm23， nm23涉及許多腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后，包括肝細(xì)胞癌、甲狀腺腫、大腸癌、肉瘤4.1、CD44(CD44s/CD44v )、4.2、3、Cyclin (細(xì)胞周期蛋白)的檢測、4.3、P-gp在腫瘤組織中的表達(dá)、乳腺癌、膀胱癌、胃腫瘤、食道癌、卵巢癌、前列腺癌等化學(xué)療法前腎細(xì)胞球癌、大腸癌、肝癌、腎上腺皮質(zhì)癌、胰

12、腺癌等化學(xué)療法前低表達(dá)非霍奇金淋巴瘤、神經(jīng)元細(xì)胞瘤、急性髓白血病等，化學(xué)療法不敏感，化學(xué)療法不敏感，化學(xué)療法不敏感，4，腫瘤多藥耐藥性(MDR )檢查，4.4，4，細(xì)胞凋亡檢查，詳細(xì)如下部分，45 4.6、細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系是“死”的細(xì)胞球不死，非“死”的細(xì)胞球死了，也就是說無論細(xì)胞凋亡過度還是細(xì)胞凋亡不足都會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。 細(xì)胞球凋亡不足：腫瘤、自身免疫病細(xì)胞球凋亡過剩：心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元細(xì)胞退行性疾病，細(xì)小病毒感染不足與過剩并存：動脈粥樣硬化、凋亡與疾病、4.7、細(xì)胞球凋亡過程、凋亡誘導(dǎo)因子作用下腺粒體的膜電位變化，caspase家族激活， 磷脂酰絲氨酸外翻，DNA斷裂形成凋亡

13、小體的4.8凋亡的測定方法，1 .形態(tài)學(xué)測定光學(xué)顯微鏡落射熒光顯微鏡(Hoechst 33342，Hoechst 33258 DAPI )電子顯微鏡2 .磷脂酰絲氨酸外翻分析(使用FCM ) 3 .腺粒體膜電勢的測定(使用FCM )4. DNA碎片化測定(使用FCM )5. TUNEL法(使用FCM )6. caspase-3活性的測定(使用FCM )7.與細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子的測定(使用FCM )促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子： Bax Bcl-Xs，bs Bid等的凋亡抑制分子： Bcl-2，Bcl-XL和bcr/abl kinase等8 .相關(guān)信號通路分子的檢測(FCM利用)，1 .磷脂酰絲氨酸的外轉(zhuǎn)

14、分析(ANNEXIN V標(biāo)識牌法)，【原理】凋亡的早期，磷脂酰絲氨酸(PS )的外轉(zhuǎn)； Annexin-V與PS能以高親和力特異性結(jié)合的碘化丙啶(proPIdine iodide，pi )能區(qū)分生細(xì)胞球和死細(xì)胞。 5.0、結(jié)果分析、5.1、結(jié)果分析-優(yōu)、5.2、結(jié)果分析-差、5.3，如何取得好的結(jié)果，細(xì)胞球狀態(tài)是良好的細(xì)胞球處理火候問題：藥物濃度，需要摸索時間染色后，不能固定細(xì)胞球，要盡快檢查。 (1)、5.4、2 .腺粒體膜電勢的測定【原理】腺粒體膜電勢的降低是凋亡級聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)過程中最初發(fā)生的事件，一旦線粒體膜電位散攤子，凋亡就不能逆轉(zhuǎn)。 線粒體膜電位的存在使一些親油性陽絡(luò)離子熒光染料與腺粒

15、體基質(zhì)結(jié)合，其熒光的增強或減少說明了線粒體內(nèi)膜陰性度的上升或降低。常用染料為Rhodamine 123、3-dihexyloxacarbocyanineiodedioc6(3)、tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodejc-1， tetramethylrhoddaminemethylester (tmrm )等結(jié)果分析、5.6、3.DNA碎片化檢測、PI染色亞倍體峰(凋亡被代言)分析、方法與“DNA倍體分析和細(xì)胞周期分析”相同，5.7、4.TUNEl法、流程也是TM 利用TdT將螢光素標(biāo)識牌dUTP標(biāo)識牌切斷的DNA末端，使凋亡的細(xì)胞

16、球帶有熒光。 流動檢查后，可以正確計算細(xì)胞凋亡率。 在這一點上，不能進(jìn)行克拉別致的TUNEl。經(jīng)典TUNEL方法的原理、5.8、結(jié)果分析、5.9、結(jié)果分析、細(xì)胞球DNA含量分析效果更好，6.0、Caspase-3活性測定、caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞球凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3是重要的執(zhí)行分子。 caspase 3正常以酶催化劑原(32KD )的形式存在于細(xì)胞球拉力賽中，在凋亡的早期階段就被激活，激活的caspase 3由兩個大亞單位(17KD )和兩個小亞基(12KD )組成，對應(yīng)的細(xì)胞核基質(zhì)分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞球凋亡。 用熒光標(biāo)識牌抗活化的Caspase-3抗體進(jìn)行細(xì)胞球內(nèi)染色，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞球凋亡的晚期和死亡細(xì)胞球，Caspase-3活性明顯降低，6.1，4，流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)上的應(yīng)用，62，1，流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型，63， 急性白血病的全面、準(zhǔn)確的分型是正確、及時治療的前提，因為白血病細(xì)胞球的起源、分化和生物科學(xué)行為構(gòu)成了白血病的異質(zhì)性。 急性白血病的分型基本分為三個階段： FAB分型(1976) (morphology，m )、MIC分型(1986)(immunology，I ) (cytogenetics，c )、WHO分型(2001)(morphology M ) (immunology，m