1、EGFP基因在pET-28a載體內(nèi)的克隆和表達(dá),綠色熒光蛋白(green-fluorescent protein, GFP) 是從太平洋水母中分離出來(lái)的一種熒光蛋白質(zhì), 為238 氨基酸組成的單體, 分子量約為27kD。 其野生型(wild-type GFP)的吸收/激發(fā)峰在395 nm , 在475 nm 有一個(gè)次要峰，發(fā)射峰為508 nm。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的檢測(cè)。,綠色熒光蛋白(GFP),GFP 的應(yīng)用特點(diǎn)：,1、檢測(cè)方便：不需要外加底物和輔助因子，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對(duì)于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別。 2、熒光穩(wěn)定：GFP 對(duì)光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長(zhǎng)

2、時(shí)間的光照；在pH范圍在7-12 之間都能正常發(fā)光；對(duì)高溫、堿、離子除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶都有較強(qiáng)抗性。 3、無(wú)毒害：GFP 對(duì)生活的細(xì)胞基本無(wú)毒害,對(duì)目的基因的功能也沒(méi)有影響,轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。 4、具有共用性和通用性：首先表現(xiàn)在GFP 的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動(dòng)物中都獲得了成功的表達(dá)；其次是GFP 沒(méi)有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個(gè)部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光。 5、易于構(gòu)建載體：由于GFP 分子量較小，僅為27-30kD，編碼GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒。 6、可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察。于得到突變體。,關(guān)于EGFP蛋白,pEGFP-N3質(zhì)粒編碼EGFP蛋白，它是野生型綠色熒光蛋白（wtGFP）經(jīng)克隆技術(shù)改造而成的遺傳突變體。它有兩個(gè)氨基酸的替換，即 Phe264Leu 和 Ser265Thr。用485 nm光激發(fā)時(shí)，EGFP可以產(chǎn)生比wtGFP 強(qiáng) 35 倍的熒光。另外，EGFP具有紅外轉(zhuǎn)換激發(fā)光譜（red-shifted excitation spectra），而且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)得到高水平表達(dá)。,質(zhì)粒pEGFP-N3圖譜,表達(dá)載體pET-28a,pET表達(dá)體系是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)融合蛋白常用的體系之一。 使用T7Lac啟動(dòng)子； BamHI下游存在轉(zhuǎn)錄終止信