1、離子化方法,思考題： 樣品分子為什么首先要離子化才能進(jìn)行質(zhì)譜分析？ 樣品分子電離是質(zhì)譜測(cè)定的必要條件。 只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。 離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。,第一節(jié)、電子轟擊離子化,是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即 M + e M+。+2e 式中M為待測(cè)分子，M+。為分子離子或母體離子。,Atom or molecule is hit by high-energy electron,Principles of Electron-Impact Mass Spectrometry,e,Atom or molecule is

2、hit by high-energy electron,electron is deflected but transfers much of its energy to the molecule,e,Principles of Electron-Impact Mass Spectrometry,Atom or molecule is hit by high-energy electron,electron is deflected but transfers much of its energy to the molecule,e,Principles of Electron-Impact

3、Mass Spectrometry,This energy-rich species ejects an electron.,Principles of Electron-Impact Mass Spectrometry,This energy-rich species ejects an electron.,Principles of Electron-Impact Mass Spectrometry,forming a positively charged, odd-electron species called the molecular ion,e,+,The molecular io

4、n dissociates to a cationand a radical.,Principles of Electron-Impact Mass Spectrometry,+,20406080100 120,m/z,m/z = 78,Relative intensity,Some molecules undergo very little fragmentation,Benzene is an example. The major peak corresponds to the molecular ion.,思考題： 1.EI的應(yīng)用范圍 2.EI的特點(diǎn) 使用最廣泛，譜庫(kù)最完整； 電離效率高

5、； 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便； 分子離子峰強(qiáng)度較弱或不出現(xiàn)(因電離能量最高)。 3.EI中通常的能量為多少？轟擊電子能量改變對(duì)質(zhì)譜的影響有哪些？ 4.為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會(huì)出現(xiàn)MH+，而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。 5.EI適用于何種質(zhì)量分析器？,第二節(jié)、化學(xué)電離離子化,一、化學(xué)電離離子 二、自身化學(xué)電離離子化,一、化學(xué)電離離子化（Chemical Ionization, CI）,化學(xué)電離源一般在1.31021.3103Pa 。 通過 離子 - 分子反應(yīng) 來進(jìn)行。試劑氣通常為甲烷CH4。首先用高能電子，使CH4電離產(chǎn)生CH5+和C2H5+，即： CH4+e CH4+2e CH4+ CH3+

6、 H CH4+和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng)，即： CH4+ CH4 CH5+ CH3 CH3+ CH4 C2H5+H2 小量樣品（試樣與甲烷之比為11000）導(dǎo)入離子源，試樣分子（SH）發(fā)生下列反應(yīng)： CH5+ SH SH2+ +CH4 C2H5+SH S+ C2H6 SH2+ 和S+然后可能碎裂，產(chǎn)生質(zhì)譜。,PCI 甲烷反應(yīng)機(jī)理,e-,HCH3,CH5+,230eV,PCI,NCI,Spectra,思考題： 1.什么情況下需要采用CI？ 2.CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6 torr，為什么？ 3.CI的用途 4.比較CI和EI的靈敏度 5.CI實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確質(zhì)

7、量測(cè)定是否容易？ 6.CI的局限性,二、自身化學(xué)電離離子化（Self-chemical ionization,SCI),FTMS和離子阱的內(nèi)離子源中出現(xiàn)的特殊方法。 樣品分子本身在電子轟擊時(shí)產(chǎn)生CH5+、 C2H5+ 、 C3H7+ 等可提供質(zhì)子的碎片離子，通過增加離子在阱中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高它們和分子的碰撞幾率，提高M(jìn)H+的強(qiáng)度，以實(shí)現(xiàn)CI。,紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖,乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫(kù)檢索結(jié)果,烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖,思考題： 1.FTMS中SCI的特點(diǎn)？和CI相比有哪些優(yōu)勢(shì)？ 2.離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？ 3.MH+的強(qiáng)度和哪些因素有關(guān)？ 4.應(yīng)

8、用范圍,間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖,二甲苯三個(gè)異構(gòu)體 M+H+和 M+CH3CO+的相對(duì)強(qiáng)度,第三節(jié)、快原子轟擊離子化（Fast atom bombardment, FAB）,屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particle induced ionization),采用高能中型粒子（Ar）轟擊樣品 常用底物： G 甘油 NBA 間硝基芐醇,思考題： 1.FAB和CI相比有何特點(diǎn)？ 2.添加金屬離子（如：NaCl、KCl、AgNO3)的目的？ 3.與活潑氫可以可以發(fā)生反應(yīng)的樣品是否可以進(jìn)行FAB測(cè)定？ 4.為什么在送FAB測(cè)試樣品時(shí)需要溶解性的信息？ 5.FAB適用于什么

9、類型樣品？,第四節(jié)、激光解吸離子化（Laser Desorption ionization, LD）,一、激光解吸離子化 （Laser Desorption ionization, LD） 二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化 （Matrix assisted laser desorption ionization, MALDI） 三、大氣壓激光解吸離子化 （Atmospheric pressure MALDI, AP-MALDI）,一、激光解吸離子化（Laser Desorption ionization, LD）,屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particle induced ionization),采用光子

10、轟擊樣品 常用激光： I R(CO2激光器)： 適用于高分子聚合物、DNA等 UV(N2激光器、Nd-YAG）：適用于多肽等,qV = 1/2(m1v12) = 1/2(m2v22) 若m1 m2, 則 v1 v2,無基質(zhì)為 LD 不能分析大分子(碎裂),延遲(脈沖)引出技術(shù) Delay (Pulsed) Extraction,20kV,0V,調(diào)諧延遲時(shí)間和引出電壓, 達(dá)到最佳分辨率 線性分辨率優(yōu)于 4000 (insulin B chain) DE + Reflectron, 分辨率優(yōu)于20000,New SCOUT 100 MALDI source (from REFLEX),MALDI

11、Source,SCOUT 100 MALDI Accessory,Features: Switch-able source to / from ESI X-Y positioning stage + camera Up to 100 samples / plate Fast load lock for easy target changeover Elevated Pressure Advantages,思考題： 1.LD適用于哪些質(zhì)量分析器？ 2.為什么有時(shí)加入金屬離子？ 3.應(yīng)用范圍,二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrix assisted laser desorption ioniza

12、tion, MALDI）,常用基質(zhì)： 2,5-二羥基苯甲酸（DHB) 丁二酸（SA) 基質(zhì)的作用： 1.稀釋樣品，使簇合的大分子解離； 2.保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解； 3.通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移等使樣品分子離子化。,寡聚葡萄糖酸,MALDI-TOF, DHB,M+Na+,High MOWSE Score of 159 !,Mass errors below 4 mDa !,MALDI spectrum of only 1 fmole BSA tryptic digest using AnchorChipTM targets. With an assu

13、med max. deviation of 5 ppm, MASCOT gave a score of 159 for BSA.,BSA,MALDI analysis of tryptic digests,MALDI Accessory - benchmark data,MALDI of Insulin B Chain,RP = 1.1 Million !,思考題： 1. 基質(zhì)的作用 2. 溶解溶劑的選擇,3以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析,用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDI MS分析受到很大制約 低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾,基質(zhì): DHB,基質(zhì): 碳納米管,DHB+Na+,DHB+

14、2Na-H+,DHB dimer,亮氨酸,亮氨酸,Leu+2Na-H+,含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。,苯丙氨酸,可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用，所以脂肪鏈越長(zhǎng)，信號(hào)越好，比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。,頡氨酸,七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS 譜,碳納米管作為基質(zhì)的一些特性,高的比表面積 表面原子數(shù)量多，表面活性高，碳納米管可以很好的分散樣品分子，來防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。 強(qiáng)的紫外吸收 電子只要很小的能量就能被激發(fā)，而且可以快速釋放能量弛豫到費(fèi)

15、米能級(jí)，所以碳納米管很容易吸收和傳遞能量使樣品分子從表面解析。,三、大氣壓激光解吸離子化（Atmospheric pressure MALDI, AP-MALDI）,第五節(jié)、大氣壓離子化 （Atmospheric Pressure Ionization,API),一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI） 二、大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ionization，APCI） 三、大氣壓光化學(xué)電離,一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）,離子化過程： 1.荷電液滴的產(chǎn)生 當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管的瞬間，在加熱溫度、霧化氣和強(qiáng)電場(chǎng)（3

16、-5Kv)的作用下，溶液迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。 2.荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生 帶電液滴隨著溶劑蒸發(fā)不斷縮小，液滴表面電荷密度不斷增大，發(fā)生崩散，形成更小的液滴，小的繼續(xù)蒸發(fā)，以類似的方式崩散，產(chǎn)生單電荷和多電荷離子。,ESI (electrospray ionization) Solvent sprayed across potential field and ionized Droplets evaporates Solvent charge transferred to analytes Polar compounds,ESI,牛膝多糖ESI質(zhì)譜圖和（加入適量Cs+）ESI質(zhì)譜圖,ES

17、I Ion Source: Resolution,Conditions:,Ubiquitin, 1 pmol/uL injected at 1 uL/minute 49% water, 49% methanol, 2% acetic acid Broadband detection from m/z 400 to 2500, acquire 1 scan,Specification:,Resolution 100,000 FWHM at m/z 779,Resolution = 198,000,+11 Isotope Cluster 6 fmol Consumed,細(xì)胞色素b5和突變體,思考題

18、： 1.為什么ESI需要溶解性信息？ 2.離子源類型，和哪些質(zhì)量分析器匹配？ 3.應(yīng)用范圍 4.為什么ESI比較適合和LC、CE聯(lián)用？ 5.為什么ESI可以測(cè)定非共價(jià)復(fù)合物？ 6.形成多電荷離子對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響？,Schematic of the nanoelectrospray source apparatus 1#-skimmer 1, 2#-heater, 3#-nozzle, 4#-shutter, 5#-interface, 6#-nanoelectrospray tip, 7#-steeless tube, 8#-screw, 9#-high voltage connector, 10#-X,Z modulator 余翀?zhí)?、郭寅? 化學(xué)學(xué)報(bào) 2002;60(11):2029,（一）nanospray,細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜（單張圖譜） 從上至下的濃度分別為（A）0.2mg/mL，(B)0.01mg/mL，(C)0.0005mg/mL,（二）脈沖噴霧和間歇噴霧,1.Yu Lu, Feng Zhou, Wenqing Shui, Liping Bian, Yinlong Guo and Pengyuan Yang* Anal Chem 2001;73(19):4748-4753 2.劉晗青、郭寅龍*、余翀?zhí)?、楊芃