1、情境導(dǎo)引 PCR診斷技術(shù)又叫多聚酶,鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，它采用分子技術(shù),模擬核酸在體內(nèi)的復(fù)制，從而判,定疾病病原體的種類，所以從本,質(zhì)上來說，這是一種分子診斷方法。,核心要點(diǎn)突破,知能過關(guān)演練,課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段,基礎(chǔ)自主梳理,基礎(chǔ)自主梳理,一、PCR擴(kuò)增的原理及條件 1概念：PCR即_，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。 2原理 (1)DNA的熱變性：在80100 的溫度范圍內(nèi)，DNA_結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為_。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),DNA,雙螺旋,變性

2、,(2)子鏈的合成：需要_；合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。 3條件 (1)_模板。 (2)分別與模板DNA兩條鏈相結(jié)合的兩種引物。 (3)A、T、G、C四種_。 (4)耐熱的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。 (5)需要穩(wěn)定的_和能嚴(yán)格控制_的溫控設(shè)備.,引物,DNA,脫氧核苷酸,pH,溫度,思考感悟 1什么是引物？若要克隆DNA，應(yīng)加入幾種特定的引物？ 【提示】所謂引物是指兩段與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的一小段DNA或RNA片段。DNA是由兩條反向平行排列的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈構(gòu)成的。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時(shí)應(yīng)加

3、入兩種引物。,二、PCR反應(yīng)過程 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為_、復(fù)性和延伸三步。 1變性：當(dāng)溫度上升到_以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。 2復(fù)性：溫度下降到_左右，兩種引物通過_與兩條單鏈DNA結(jié)合。 3延伸：溫度上升到_左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在_的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。,變性,90 ,50 ,堿基互補(bǔ)配對(duì),72 ,DNA聚合酶,思考感悟 2PCR循環(huán)過程中，變性溫度設(shè)置95 ，時(shí)間設(shè)置30 s的原因是什么？ 【提示】變性溫度過低，解鏈不完全導(dǎo)致DNA不能擴(kuò)增。變性溫度過高影響酶的活性；在此溫度條件下如果處理時(shí)間過長(zhǎng)，將會(huì)導(dǎo)致酶的鈍化。,三、實(shí)驗(yàn)

4、操作 1實(shí)驗(yàn)用具 (1)PCR儀：該儀器能自動(dòng)調(diào)控_，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒有PCR儀，可用3個(gè)_代替，操作時(shí)按程序在3個(gè)水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。 (2)微量離心管：總?cè)莘e為0.5 mL，實(shí)際上是進(jìn)行離心的場(chǎng)所。 (3)微量移液器：用于吸取轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭每吸取一種試劑后都要更換。,溫度,恒溫水浴鍋,2操作步驟 準(zhǔn)備_混合_反應(yīng)。 四、操作提示 1為避免外源DNA等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行_。 2所用的_和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 儲(chǔ)存。 五、DNA含量的測(cè)定 1原理：利用DNA在260 nm的紫外線波段的_曲線來測(cè)定相應(yīng)含

5、量。 2計(jì)算公式：DNA含量(g)50(260 nm的讀數(shù))_。,移液,離心,高壓滅菌,緩沖液,吸收,稀釋倍數(shù),核心要點(diǎn)突破,1PCR擴(kuò)增方向：為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(OH)末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈，即DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。,2PCR原理DNA的熱變性原理 通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)控制溫度的儀器。,3生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別,(2011年聊城高二檢測(cè))下列關(guān)于DNA復(fù)制和PCR的描述中，正確的是() ADNA聚

6、合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5端延伸DNA鏈 BDNA復(fù)制不需要引物 C引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合 DPCR擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列 【嘗試解答】_C_,【解析】由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3端延伸DNA鏈，故DNA復(fù)制需要引物，而且它與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。PCR擴(kuò)增的對(duì)象是DNA，而不是氨基酸。 【探規(guī)尋律】(1)引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。包括引物和引物兩種。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為2030個(gè)核苷酸。 (2)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的原理和過程容易發(fā)生混淆，特別應(yīng)注意區(qū)分PCR反應(yīng)需要可變的溫度，

7、而體內(nèi)DNA復(fù)制需要穩(wěn)定的溫度。,跟蹤訓(xùn)練(2011年海淀區(qū)高二檢測(cè))關(guān)于DNA片段PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的描述中不正確的是() A加入的Taq DNA聚合酶耐高溫 B不同大小DNA在電場(chǎng)中遷移速率不同 C此過程需要DNA連接酶 D擴(kuò)增區(qū)域由兩種引物來決定,解析：選C。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是在較高溫度下進(jìn)行的，故需要耐高溫的Taq DNA聚合酶，但不需要DNA連接酶，A項(xiàng)正確，C項(xiàng)錯(cuò)誤。因?yàn)椴煌笮〉腄NA帶有不同數(shù)量的電荷，所以在電場(chǎng)中遷移速率不同，B項(xiàng)正確。PCR擴(kuò)增需要兩種引物，分別與DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)，則D項(xiàng)正確。,1反應(yīng)體系的配方,2.實(shí)驗(yàn)用具 (1)PCR儀：PCR自動(dòng)化程度較高，參照下表設(shè)

8、計(jì)程序即可。,若無PCR儀，可用恒溫水浴鍋代替，三個(gè)恒溫水浴鍋的溫度分別為94 、55 和72 ，然后按照上表要求，在三個(gè)水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。 (2)微量離心管：一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5 mL。 (3)微量移液器：用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。,3實(shí)驗(yàn)操作步驟 按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上 用微量移液器按照配方在微量試管中依次加入各組分 蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁 將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10 min 將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序,(2011年長(zhǎng)春高二檢測(cè))多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

9、(PCR技術(shù))是在實(shí)驗(yàn)室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術(shù)，反應(yīng)系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核苷酸等。反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過程如圖所示。,(1)某個(gè)DNA樣品有1000個(gè)脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基AGTC1234，則經(jīng)過PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生_個(gè)DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少是_個(gè)。 (2)分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個(gè)新DNA之間存在差異，這些差異是 _。,(3)由于DNA分子上的“遺傳因子”基本都是符合孟德爾的遺傳規(guī)律的，因此人類可以利用PCR技

10、術(shù)合成的DNA進(jìn)行親子鑒定，其原理是：首先獲取被測(cè)試者的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取其中一樣本DNA用限制性核酸內(nèi)切酶切成特定的小片段，放進(jìn)凝膠內(nèi)，用電泳推動(dòng)DNA小片段分離，再使用特別的“探針”去尋找基因。相同的基因會(huì)凝聚在一起，然后利用特別的染料在X光下，便會(huì)顯示由DNA探針凝聚于一起的黑色條碼。每個(gè)人的條碼一半與其母親的條碼吻合，另一半與其父親的條碼吻合。,限制性核酸內(nèi)切酶能將DNA樣品切成特定的小片段，這主要體現(xiàn)了酶的_。 A專一性B高效性 C多樣性 D作用條件溫和 2002年6月，我國(guó)第一張18位點(diǎn)的“基因身份證明”在湖北武漢誕生。人的“基因身份證明”是否終身有效？_，理由是_ _。

11、,(4)請(qǐng)指出PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄過程的三個(gè)不同之處： _； _； _。,【嘗試解答】(1)326200 (2)堿基(脫氧核苷酸)的數(shù)目、比例和排列順序不同 (3)A 是因?yàn)橥粋€(gè)體的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織的DNA是相同的，所以它有高度的個(gè)體特異性和穩(wěn)定性 (4)PCR技術(shù)以DNA的兩條單鏈為模板合成子代DNA，轉(zhuǎn)錄以DNA的一條單鏈為模板合成RNA PCR技術(shù)的原料為脫氧核苷酸，轉(zhuǎn)錄的原料是核糖核苷酸 二者反應(yīng)時(shí)的催化酶不同(或其他合理答案),【解析】本題考查了PCR技術(shù)的應(yīng)用及相關(guān)計(jì)算與識(shí)圖能力。(1)該DNA樣品復(fù)制5次，產(chǎn)生DNA分子數(shù)為2532個(gè)，DNA樣品中TA200個(gè)，則樣品復(fù)制5次，需要胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少為200(251)6200個(gè)。(2)不同生物的DNA樣品中，脫氧核苷酸(堿基)數(shù)目、比例和排列順序不同,故各個(gè)新DNA之間也存在差異。(3)限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定部位進(jìn)行切割，這就說明酶具有專一性；人的“基因身份證明”是根據(jù)DNA上的