1、第二節(jié)基因操作的主要技術原理、凝膠電泳擴增原理分子雜交DNA測序生物芯片、1、凝膠電泳是分析重組DNA分子和蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是分子生物學研究方法的技術基礎。瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳脈沖電場凝膠電泳，1，基本原理，帶負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依賴穩(wěn)定介質(瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠)和緩沖液，在電場中以恒定遷移率從陰極移動到陽極。核酸分子的大小、結構或形狀的差異，根據電荷，可以通過電泳分離混合物的其他成分。DNA的遷移率決定因素，1 DNA分子的大小，雙鏈DNA分子的遷移速度與堿基對數(shù)的共同對數(shù)成反比。2每陣地的濃度越低，相同的核酸分子移動得越快。3 DNA的

2、設想一般是同一個分子：超螺旋圓形直線切口環(huán)。4凝膠和電泳緩沖液中溴化B (EB)插入雙鏈DNA，導致負電荷減少、剛性、長度增加。5如果使用的電壓低，則DNA分段移動率與使用的電壓成正比。六陣地黨有兩種類型：標準陣地黨和低熔點陣地黨；凝膠電泳的分辨率：凝膠的類型和密度相關的瓊脂糖凝膠的分辨率在0.250Kb之間。聚丙烯的分辨率為11000bp，分離范圍與% agarose，低聚糖4-6 0.02-0.4，不同類型的瓊脂糖特性，agarose gel電子，D-半乳糖，3，6-脫水-L-半乳糖，瓊脂糖凝膠的特征，(1)優(yōu)點1 3。凝膠結構均勻，孔徑大，可用于分離酶的復合物、核酸、病毒等分子物質。4.

3、透明度比較好，可以直接或干燥制成薄膜后染色。5.不吸收紫外線，可使用直接紫外線吸收法定量測定。6.具有熱可逆性，(2)缺點1。機械強度不好，容易破碎，濃度太低，渡邊杏。2.容易被細菌污染，不易保存，任用前準備。3.瓊脂糖支持層的條帶容易擴散，電泳后要立即固定染色。4.與PAGE相比，分鐘自我作用少，頻帶少。分為上熔點的瓊脂糖和低熔點(LMP)瓊脂糖。(1)每個LMP陣地的熔點：6265融化后可保持液體狀態(tài)37小時。在25中，液體狀態(tài)的約10min回收DNA可以維持運作。將凝膠加熱65到幾分鐘，然后在液體瓊脂糖中加入過多的酚液提取DNA，通過離心機獲取含有DNA分子的上清液，將DNA片段切成酶，

4、然后電泳。(2)瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：緩沖液：1 TAE(TBE TPE)凝膠含量：根據檢測到的DNA大小，DNA樣品：1g，指示劑溴酚藍電泳條件：大部分低壓長期，小塊高壓短時間瓊脂糖融化時，位置太高，渡邊杏。2.在粘合劑和加成過程中，必須防止氣泡的發(fā)生。Eb具有強大的致突變性，可能致癌。必須戴手套操作，嚴格注意保護。4.添加樣品時，如果樣品孔太深或穿透塑料孔壁，將渡邊杏Tip頭。否則，樣品泄漏或DNA帶不均勻。5.打開電源時，要確保凝膠的方向正確。6.電泳儀有電壓顯示，不一定通電，必須觀察電極氣泡的發(fā)生。陰極的氣泡比正極多兩倍，表明電泳開始了。7.溴化乙可以插入DNA分子的雙鏈中，由紫外線插

5、入溴化乙的DNA是橙色熒光，因此溴化乙可以作為熒光指示劑，表示DNA含量和位置。3，聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺PAGE- electrophoresis，PAGE-，原理，聚丙烯酰胺凝膠是單體丙烯酰胺(Acrylamide，ACR)和交聯(lián)劑N，N-;n；N四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethyl ethylenedia mine，TEMED)和催化過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，)，丙烯酰胺，N，N-叉二丙烯酰胺，原理，聚丙烯酰胺凝膠三維結構，聚丙烯酰胺凝膠電泳類型，1改性聚丙烯酰胺凝膠，用于分離或純化單鏈DNA片段。變性DNA在這種凝膠

6、中的遷移率與堿基的組成和序列幾乎無關。用途：放射性DNA探針的分離，DNA堿基序列反應等。2非改性聚丙烯凝膠用于雙鏈DNA片段的分離純化。注：遷移率受堿基趙寅成及序列的影響。用途：制備高純度DNA片段。(3)聚丙烯酰胺凝膠中DNA的有效分離范圍，注：N，N-甲基酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30。主頁，圖片。1夾層豎板電泳槽圖1。導線連接器2。下坦克3。凹型橡膠盒4。示例窗模板5 .緊固螺釘6。上坦克7。冷凝系統(tǒng)，圖解。2凝膠模具圖1。示例窗模板2。長玻璃板3。在短玻璃板丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子洗滌劑12烷基磺酸鈉(SDS)，蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于分子量，與電荷和形狀無關，也取決于分

7、子量。因此，可以使用SDS-PAGE測定蛋白質分子量。3，聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酸酯凝膠電泳，頁面緩沖：PAGE凝膠聚丙烯酰胺電泳：聚丙烯酰胺/亞甲基雙丙烯酰胺(29:1)；TEMED(四甲基乙二胺，加速器)和硫酸銨(10，催化劑)。垂直板電動游泳裝置，加型，樣品移動方向，混合樣品，帶孔膠，按分子大小分離，電泳方向，電泳，小分子，大分子，夾在兩塊玻璃板中間的凝膠，電泳緩沖液，電泳緩沖液，添加到槽中的SDS處理樣品，分子量小，分子量大，分子量大，電源1。有分子篩效果，分辨率高。2.樣品不易擴散，用量少，靈敏度10-6g 3?；瘜W性質穩(wěn)定，分子結構中富含酰胺基的穩(wěn)定親水基團4。凝膠沒有電荷，消

8、除了電滲現(xiàn)象。5.機械強度好，有彈性，在一定濃度范圍內無色透明6。分離超分子量的DNA分子。在脈沖電泳中，電場方向周期性變化。第一脈沖電場方向與核酸的移動方向成45度角，下一脈沖的電場方向與核酸移動方向相反，變?yōu)?5度角。，脈沖電場電泳圖，整個電泳移動方向為兩個電場和45o，在電泳過程中保持電壓穩(wěn)定。如果用傳統(tǒng)方法準備DNA，電壓會隨著時間的推移而增加樣品。準備DNA樣本與現(xiàn)有方法不同。4、脈沖電場凝膠電泳(PFGE)、瓊脂糖凝膠電泳添加的電場方向、電流大小和作用時間交替變化，因此DNA分子必須隨時調整游動方向。與分子量較小的DNA分子相比，分子量較大的DNA分子需要更多的次數(shù)來改變構成和方向

9、，以便能游向新的方向，因此移動速度減慢，達到分離大分子量DNA分子的目的。pfge can resolve large DNA fragments，類型，垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(vertical pulsed field)現(xiàn)場翻轉系統(tǒng)(field inversion)旋轉粘合劑系統(tǒng)(rotating gel)2電壓：固定脈沖時間可以增加電場強度，從而擴大可分離的最大段的范圍，但是電場強度太大，會導致小塊游泳混亂。3電場角：電場方向的角度總是1100-1200，研究表明900度非常有效。4溫度：每個標準陣地的電泳基本上在室溫下進行，PFGE通常在4下進行。高溫DNA游泳速度更快。但是溫度越高，小片的

10、游泳阻斷和明顯的條帶就越寬。種類1)根據凝膠材料，分為：聚丙烯凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖瓊脂糖)2)根據電泳裝置，分為：水平/瓊脂糖凝膠?？v向/聚丙烯凝膠3)分離效果和分離范圍兩種方法比較。操作容易，2。用途瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的日常分析。聚丙烯凝膠常用于小分子核酸分析。3.凝膠電泳的一般程序凝膠點電泳染色是DNA電泳1。DNA分子種類1)觀察線性DNA單鏈和雙鏈，注意在ss-DNA電泳中，局部區(qū)域形成ds-DNA，移動距離不確定。2)循環(huán)DNA單鏈(例如M13mp)和雙鏈(例如M13mp)，這種DNA分子在電泳過程中的移動距離受以下因素的影響：I .分子量的大小3

11、360移動距離與分子量的共同代數(shù)成反比。二.凝膠濃度：濃度越高，移動距離越短，低分子DNA濃度越低，移動距離越長，高分子量DNA，iii。適合于分離電壓，電壓越高，DNA片段移動率就越大，這是不同的。四。堿基配置和溫度：不受影響，溫度高會導致DNA帶變形或鏈松脫。4)環(huán)狀ds-DNA電泳：用于質粒DNA的初步鑒定5)線性ss-DNA電泳鏈分離凝膠：化學排序時用于單鏈分離。DNA雙鏈是互補的，但組成不同，但仍然可分離(機制未知)，由電泳形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。核酸測序凝膠(染料指示劑):為了避免局部區(qū)域的次結構，沸騰樣品，電泳溫度增加，凝膠中添加變性劑(尿素、甲醛、甲胺等)，RNA凝膠電

12、泳方法：其他RNA電泳方法基于使RNA分子變性的方法。這些方法需要RNA分子在點樣本中不僅是一級結構，而且在整個電泳過程中保持一級結構。1.乙二醛/二甲基亞砜法原理：乙醛能與核酸、核苷酸和堿基發(fā)生反應，尤其是鳥苷形成穩(wěn)定的附加環(huán)，防止GC堿基的互補作用。RNA 10mM羥甲基醛和50% DMSO混合50，1 h改性點電泳染色觀察2。羥甲基汞法原理步驟：RNA 10mM毫米羥甲基醛點樣品在含4毫米羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳染色觀察，3甲醛法步驟：RNA 2.2M米甲醛50%甲胺點樣品2.2米甲醛瓊脂糖蛋白質電泳方法：變性和非變性聚丙烯凝膠電泳。電子通常被稱為SDS-page。差異：變性用途：變性凝膠可用于蛋白質的分離純化，酶反應(顏色變化)SDS-PAGE可直接用于蛋白質分子量、嬰兒成分的測定。MRNA翻譯產物，基因表達產物測定等。核酸片段的分離和回收1。方法用于DNA、RNA和蛋白質的回收。1)電洗脫法：利用電泳法，將凝膠中的特定核酸分子放入其他介質中。2)濾紙法核酸凝膠染色長波紫外線在分離臺前切一口，濾紙(背面復蓋透析細胞膜)電泳