1、發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),第四章 發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),本章內(nèi)容,一、染菌的防治,二、發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),三、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌,四、空氣除菌,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),發(fā)酵過(guò)程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長(zhǎng)繁殖.,什么是染菌？,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),一、染菌的影響,4.影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量。,發(fā)酵過(guò)程污染雜菌，會(huì)嚴(yán)重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。,造成大量原材料的浪費(fèi)，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失,2.擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計(jì)劃。,3.遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會(huì)影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（一）染菌對(duì)發(fā)酵的影響,生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物

2、。,不同污染時(shí)間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果 。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),A細(xì)菌 谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。,1、發(fā)酵染菌對(duì)不同品種的影響,不同種類菌種,肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營(yíng)養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長(zhǎng)和合成代謝產(chǎn)物。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發(fā)酵一無(wú)所獲。 檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。,C. 酵母菌: 易污染細(xì)菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：無(wú)論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),不同產(chǎn)品,青霉

3、素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接或誘導(dǎo)產(chǎn)生青霉素酶，不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素迅速破壞。,鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無(wú)所得，但也會(huì)造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營(yíng)養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝、改變pH，降低產(chǎn)量。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),不同產(chǎn)品,灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對(duì)細(xì)菌幾乎沒(méi)有抑制和殺滅作用。,疫苗生產(chǎn)危害很大。,疫苗是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響,噬菌體的感染力很強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也

4、較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。,（1）污染噬菌體,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),有些雜菌會(huì)使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無(wú)法控制逃液，影響發(fā)酵過(guò)程的通氣攪拌。,（2）污染其它雜菌,有的雜菌會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會(huì)反復(fù)染菌。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),3、不同時(shí)間染菌對(duì)發(fā)酵的影響,污染時(shí)間是指用無(wú)菌檢測(cè)方法確準(zhǔn)的污染時(shí)間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時(shí)間。,雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長(zhǎng)、繁殖的時(shí)間才能顯現(xiàn)出來(lái)，顯現(xiàn)的時(shí)間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所

5、需的時(shí)間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時(shí)間就長(zhǎng)。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（1）種子培養(yǎng)期染菌,在發(fā)酵初期，生產(chǎn)菌生長(zhǎng)不占優(yōu)勢(shì)，抵抗雜菌能力低，容易污染雜菌。 如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（2）發(fā)酵前期染菌,原因 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。,發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。,染菌措施 降低溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等,要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。,若培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng)，重新接種再用。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（3）發(fā)酵中期染菌,嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。,措施 降溫培養(yǎng)，減

6、少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（4）發(fā)酵后期染菌,發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對(duì)生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率比較高，造成染菌的因素很多。,例如，滅菌的蒸汽壓不足不能滅菌； 設(shè)備有滲漏不能進(jìn)罐等等； 操作不規(guī)范等等。,（二）染菌原因,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),染菌主要原因,1、設(shè)備滲漏或“死角”,設(shè)備滲漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥

7、門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。所以說(shuō)加強(qiáng)設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查，對(duì)制服染菌是極其主要的，也是重要的。,發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料與設(shè)備摩擦造成機(jī)械磨損以及加工制作不良等原因會(huì)導(dǎo)致設(shè)備及附件滲漏。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),“死角”,發(fā)酵罐的“死角” 法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件。 口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角” 消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥 管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角”,由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)或人為因素造成的

8、屏障等原因，使蒸汽不能到達(dá)預(yù)定的滅菌部位或該部位的冷空氣不易在加熱過(guò)程中排凈，不能達(dá)到徹底滅菌的部位。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),滅菌時(shí)蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),法蘭連接不當(dāng)造成的“死角”,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2、空氣帶菌,因?yàn)榭諝獬到y(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會(huì)導(dǎo)致空氣除菌失敗。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),3、種子帶菌,加強(qiáng)種子管理，嚴(yán)格無(wú)菌操作，種子本身帶菌是可以克服的。種子培養(yǎng)過(guò)程染菌與發(fā)酵一樣有許多因素造成。,分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過(guò)程中染菌。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),4、滅菌不徹底,滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量

9、很有關(guān)系 蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時(shí)間產(chǎn)生過(guò)多泡沫 蒸汽總壓是否達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn) 環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。故染菌率因季節(jié)不同而發(fā)生明顯變化。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),原材料儲(chǔ)存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機(jī)原料雜菌的數(shù)量 發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量有無(wú)滅菌的死角 對(duì)減少或避免染菌仍然是十分必要的。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),5、技術(shù)管理不善,技術(shù)管理就是要對(duì)發(fā)酵每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制，發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),1、染菌的檢查 （1）顯微鏡檢查法（最簡(jiǎn)單、最直接、最經(jīng)常） （2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法； 平板制好后，應(yīng)先保溫2

10、4小時(shí)，確定無(wú)菌 （3）肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色pH6.8-8.4）,三、染菌的檢查與判斷,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2、以上3種檢查法的不足 以上3種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定未被染菌； 原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的染菌情況（1個(gè)/ml）,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),(四)染菌情況分析,1、單罐染菌 不是系統(tǒng)問(wèn)題，而是該罐本身的問(wèn)題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過(guò)濾器失效,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2、多罐染菌 系統(tǒng)問(wèn)題，如空氣過(guò)濾系統(tǒng)有問(wèn)題，特別是總過(guò)濾器長(zhǎng)期沒(méi)有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分配站有滲漏或滅菌不徹底。,3、前期染菌 種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù)

11、,4、中后期染菌 補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門滲漏，一般不會(huì)是種子問(wèn)題。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),五、染菌的防止,1、防止種子帶菌,制備種子時(shí)對(duì)沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。 沙土制備時(shí)要多次間歇滅菌 注意接種時(shí)的無(wú)菌操作 子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng) 無(wú)菌室和搖床間都要保持清潔。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2、防止設(shè)備滲漏,設(shè)備上一旦滲漏，就會(huì)造成染菌，如盤管、夾套穿孔滲漏，未滅菌冷卻水便會(huì)通過(guò)漏孔而進(jìn)入發(fā)酵罐中招致染菌。 閥門滲漏也會(huì)使帶菌的空氣或水進(jìn)入發(fā)酵罐而造成染菌。 設(shè)備上的漏隙如果肉眼能看見(jiàn)，容易發(fā)現(xiàn)；但有的微小泄漏，肉眼看不見(jiàn)，必須通過(guò)一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn) 。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),3、防止

12、培養(yǎng)基滅菌不徹底,培養(yǎng)基滅菌方法高壓蒸汽滅菌 分批滅菌 1210C，30分鐘 連續(xù)滅菌 罐溫1251300C，3045分鐘,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),5、發(fā)酵染菌后的措施,染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。 凡染菌的罐要找染菌的原因，對(duì)癥下藥，該罐也要徹底清洗，進(jìn)行空罐消毒，才可進(jìn)罐。 染菌厲害時(shí)，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。特別，若染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),四、染噬菌體的防治,（一）染噬菌體對(duì)發(fā)酵的影響,若受噬菌體侵染，會(huì)出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止。 且受噬菌體感染后，往往會(huì)反復(fù)連續(xù)感染，使生產(chǎn)無(wú)法進(jìn)行，甚至使種子全部喪失。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),染噬菌體表現(xiàn)為：

13、 （1）鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴(yán)重時(shí)完全看不到菌體，且是在短時(shí)間內(nèi)菌體自溶。 （2）發(fā)酵pH值逐漸上升，48小時(shí)之內(nèi)可達(dá)8.0以上，不再下降。 （3）發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味，粘度大，泡沫多?（4）生產(chǎn)量甚少或增長(zhǎng)緩慢或停止 有無(wú)染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗(yàn),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（二）產(chǎn)生噬菌體的原因,主要是由于生產(chǎn)和試驗(yàn)過(guò)程中不斷不加注意地把許多活菌體排放到環(huán)境中去，造成了自然界中噬菌體增殖的好機(jī)會(huì)。 這些噬菌體有可能潛入生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是通過(guò)空氣系統(tǒng)進(jìn)入種子室、種子罐、發(fā)酵罐,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（三）噬菌體的防治,1、建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度，定期檢查、定期清掃

14、，車間四周有嚴(yán)重污染噬菌體的地方應(yīng)及時(shí)撒石灰或漂白粉。 2、車間地面和通往車間的道路盡量采取水泥地面。 3、種子和發(fā)酵工段的操作人員要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作規(guī)程，不使用本身帶有噬菌體的菌種。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（ 4）認(rèn)真進(jìn)行發(fā)酵罐、補(bǔ)料系統(tǒng)的滅菌。 （5）選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種。 （ 6）發(fā)現(xiàn)噬菌體停攪拌、小通風(fēng)，將發(fā)酵液加熱到70800C殺死噬菌體，才可排放。發(fā)酵罐周圍的管道也必須徹底滅菌。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù)滅菌方法,干熱滅菌法 濕熱滅菌法 射線滅菌法 化學(xué)藥劑滅菌法 過(guò)濾除菌法 火焰滅菌法,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),第三節(jié) 培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌,一、濕熱滅菌原理

15、 二、分批滅菌（實(shí)罐滅菌） 三、連續(xù)滅菌（連消） 四、分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),1. 熱阻 2. 微生物熱死定律：對(duì)數(shù)殘留定律 3.滅菌溫度和時(shí)間的選擇 4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素,一、濕熱滅菌原理,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),1. 熱阻,定義：微生物對(duì)熱的抵抗力稱為熱阻，可用比死亡速率常數(shù)k的倒數(shù)來(lái)表示 。 k，熱阻, t,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),當(dāng)溫度T一定時(shí)，k隨微生物不同而不同，具體計(jì)算時(shí)，可取細(xì)菌芽孢的k值為標(biāo)準(zhǔn)。 當(dāng) T 變化時(shí)，k有很大變化，其變化遵從阿累尼烏斯定律 k=Aexp(- E/RT) k與微生物活化能及T有關(guān),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),大腸桿菌在不同溫度下 的殘

16、留曲線,嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2.對(duì)數(shù)殘留定律,在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比，即 當(dāng)Nt=0時(shí)， t=， 無(wú)意義，也不可能。 一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),非對(duì)數(shù)殘留定律,某些微生物受熱死亡的速率不符合對(duì)數(shù)殘留定律：如一些微生物芽孢。 kR ks NR Ns ND dNR/dt=-kR NR Nt/N0=KR/(kR-kS) ekst-ks/kR e-kRt dNs/dt =kR NR -ks Ns 式中NR：耐熱性活芽

17、孢數(shù)；Ns：敏感性活芽孢數(shù) ND：死亡的芽孢數(shù)；kR：耐熱性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢數(shù)。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),在T相同時(shí)，對(duì)數(shù)與非對(duì)數(shù)定律的滅菌時(shí)間t不同。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),3. 滅菌溫度和時(shí)間的選擇,培養(yǎng)物質(zhì)受熱破壞也可看作一級(jí)反應(yīng)： 式中C：對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度；k：分解速度常數(shù)； k的變化也遵循阿累尼烏斯方程：,都與相應(yīng)的活化能及T有關(guān),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),當(dāng)T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE) 隨著T上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故一般選擇高溫快速滅菌 。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),4. 影響

18、培養(yǎng)基滅菌的其它因素,（1）培養(yǎng)基成分 油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機(jī)物等增加微生物的耐熱性 低濃度（1%-2%）NaCl對(duì)微生物有保護(hù)作用，隨著濃度增加，保護(hù)作用減弱，當(dāng)濃度達(dá)8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),（4）泡沫：泡沫中的空氣形成隔熱層，對(duì)滅菌極為不利，可加入少量消泡劑 。,（2）pH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH6.0，H+易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促使其死亡。培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時(shí)間愈短。,（5）培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量,（3）培養(yǎng)基的物理狀態(tài),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),分空氣過(guò)濾器滅菌 并用空氣吹干,夾套或蛇管排冷水，開(kāi)啟排

19、氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內(nèi)通蒸汽,達(dá)70左右,取樣管,放料管,通蒸汽,120，1105pa,保溫,保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定,罐壓接近空氣壓力,向罐內(nèi)通無(wú)菌空氣,保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門,夾套或蛇管中通冷水 培養(yǎng)基降溫到所需溫度,二、分批滅菌（實(shí)罐滅菌） 1.滅菌工藝過(guò)程,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮到滅菌的可靠性主要在保溫階段進(jìn)行，故可以簡(jiǎn)單地利用式 (N/N0) =-kt 來(lái)粗略估算滅菌所需時(shí)間。,2. 滅菌時(shí)間的估算,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，

20、在1210C溫度下實(shí)罐滅菌，原污染程度為每1ml有2105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，已知1210C時(shí)滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機(jī)率為0.001時(shí)所需時(shí)間。,解：N0=401062105=81012(個(gè)) Nt=0.001(個(gè)) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min),由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培養(yǎng)基加熱至100C以上，這個(gè)作用較為顯著， 故實(shí)際保溫階段時(shí)間比計(jì)算值要短。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),三、連續(xù)滅菌（連消）,工藝流程 噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程 噴射加熱連續(xù)滅菌流程

21、薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),例2某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每1ml含有2105個(gè)雜菌，已知1310C時(shí)滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時(shí)間。,解：C0=2105(個(gè)/ml) Ct=0.001/(40106)=2.510-11(個(gè)/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11) =2.37 min,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)：（適用于大型罐） 可采用高溫短時(shí)滅菌，營(yíng)養(yǎng)

22、成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率； 發(fā)酵罐利用率高； 蒸汽負(fù)荷均衡； 采用板式換熱器時(shí)，可節(jié)約大量能量； 適宜采用自動(dòng)控制，勞動(dòng)強(qiáng)度?。?可實(shí)現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同溫度下分開(kāi)滅菌，減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),缺點(diǎn)： 對(duì)小型罐無(wú)優(yōu)勢(shì)，不方便，對(duì)設(shè)備要求高； 蒸汽波動(dòng)時(shí)滅菌不徹底； 當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆?；蛴休^多泡沫時(shí)，以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。,分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),第四節(jié) 空氣除菌,概述：無(wú)菌空氣 空氣中微生物的分布 發(fā)酵工業(yè)對(duì)空氣無(wú)菌程度的要求 空氣除菌的方法 介質(zhì)過(guò)濾除菌的機(jī)理 介質(zhì)過(guò)濾除菌的工藝,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用的“無(wú)菌

23、空氣”是指通過(guò)除菌處理使空氣中含菌量降低在一個(gè)極低的百分?jǐn)?shù)，從而能控制發(fā)酵污染至極小機(jī)會(huì)。此種空氣稱為“無(wú)菌空氣”。,無(wú)菌空氣的概念,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),各地空氣中所懸浮的微生物種類及比例各不相同，數(shù)量也隨條件的變化而異，一般設(shè)計(jì)時(shí)以含量為103-104個(gè)m3進(jìn)行計(jì)算。,空氣中微生物的分布,空氣中的含菌量隨環(huán)境不同而有很大差異：,一般干燥寒冷的北方空氣中的含菌量較少，而潮濕溫暖的南方則含菌量較多； 人口稠密的城市比人口少的農(nóng)村含菌量多； 地面又比高空的空氣含菌量多。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),以一個(gè)50m3的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為0.7，要求每立方米發(fā)酵液每分鐘通氣0.8m3，培養(yǎng)周期170h，那

24、么每個(gè)周期需通氣量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每立方米大氣中約有103-104個(gè)微生物。,空氣除菌的必要性,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),一般按染菌機(jī)率為10-3。來(lái)計(jì)算，即1000次發(fā)酵周期所用的無(wú)菌空氣只允許12次染菌。,發(fā)酵對(duì)空氣無(wú)菌程度的要求,各種不同的發(fā)酵過(guò)程，對(duì)空氣無(wú)菌程度的要求也不同。影響因素是比較復(fù)雜的，需要根據(jù)具體情況而訂出具體的工藝要求。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),培養(yǎng)法：微生物學(xué)中已介紹過(guò),空氣含菌量的測(cè)定,光學(xué)法 ：用粒子計(jì)數(shù)器通過(guò)微粒對(duì)光線的散射作用來(lái)測(cè)量粒子的大小和含量。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),空氣除菌的方法,輻射滅菌 加熱滅菌 靜電除菌 介質(zhì)過(guò)濾,發(fā)

25、酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),射線、X射線、射線、射線、紫外線、超聲波等從理論上講都能破壞蛋白質(zhì)，破壞生物活性物質(zhì)，從而起到殺菌作用。,輻射滅菌,原理,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),應(yīng)用范圍: 通常用于無(wú)菌室和醫(yī)院手術(shù)室。,缺點(diǎn) 殺菌效率較低，殺菌時(shí)間較長(zhǎng)。一般要結(jié)合甲醛蒸汽等來(lái)保證無(wú)菌室的無(wú)菌程度。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),加熱滅菌 利用壓縮熱進(jìn)行空氣滅菌的流程圖 空氣進(jìn)口21C，出口187198C，壓力為0.7MPa。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),阻力小， 除水、除油的效果好 耗電少,靜電除菌,原理,利用靜電引力來(lái)吸附帶電粒子而達(dá)到除塵、除菌的目的。,優(yōu)點(diǎn),設(shè)備龐大 、一次性投資較大 、捕集率尚嫌不夠，需要采取其它措施。,

26、常用于潔凈工作臺(tái)、潔凈工作室所需無(wú)菌無(wú)塵空氣的第一次除塵，配合高效過(guò)濾器使用。,缺點(diǎn),適用范圍,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),過(guò)濾除菌,采用定期滅菌的介質(zhì)來(lái)阻截流過(guò)的空氣所含的微生物而取得無(wú)菌空氣。,常用的過(guò)濾介質(zhì)有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機(jī)合成纖維、超細(xì)玻璃纖維紙、燒結(jié)材料過(guò)濾介質(zhì) 、有機(jī)和無(wú)機(jī)燒結(jié)材料、新型過(guò)濾介質(zhì)等等。,絕對(duì)過(guò)濾、深層過(guò)濾,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),濾材,孔,利用有孔介質(zhì)從氣體中除去微生物,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),深層過(guò)濾機(jī)理,慣性撞擊截留作用 布朗擴(kuò)散攔截作用 （直接攔截作用） 攔截截留作用 重力沉降 靜電吸引,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),慣性撞擊,尺寸小于濾材孔徑的顆粒的輔助攔截方式 流體攜帶

27、的顆粒由于質(zhì)量和線速度而具有直線 運(yùn)動(dòng)的慣性 顆粒離開(kāi)流體主流而撞擊到濾材上,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),慣性撞擊,當(dāng)流體改變運(yùn)動(dòng)方向時(shí)，慣性使顆粒撞擊到濾材表面并由于吸附力而停留,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),慣性撞擊,顆粒被機(jī)械攔截或被吸附攔截 在氣體中比在液體中更有效. 對(duì)大于 0.5 - 1.0 微米的顆粒很有效.,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),布朗擴(kuò)散攔截,氣體過(guò)濾器能夠去除尺寸遠(yuǎn)小于液體精度 的污染物。 對(duì)小-細(xì)顆粒 (0.1 - 0.3微米)非常有效。 如果一個(gè)氣體過(guò)濾器在濕潤(rùn)環(huán)境中運(yùn)行， 它的去除能力即變?yōu)橐后w精度。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),擴(kuò)散攔截,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),空氣過(guò)濾除菌流程,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),

28、而一般的深層通氣發(fā)酵，除要求無(wú)菌空氣具有必要的無(wú)菌程度外，還要具有一定的壓力，這就需要比較復(fù)雜的空氣除菌流程。,空氣過(guò)濾除菌流程是按生產(chǎn)對(duì)無(wú)菌空氣要求具備的參數(shù)，根據(jù)空氣的性質(zhì)而制訂的，同時(shí)還要結(jié)合吸氣環(huán)境的空氣條件和所用設(shè)備的特性進(jìn)行考慮。,對(duì)于一般要求的低壓無(wú)菌空氣，可直接采用一般鼓風(fēng)機(jī)增壓后進(jìn)入過(guò)濾器，經(jīng)一、二次過(guò)濾除菌而制得。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),流程的設(shè)備： 主設(shè)備：空氣壓縮機(jī) 附屬設(shè)備：要求盡量采用新技術(shù)，提高效率，減少設(shè)備，精簡(jiǎn)設(shè)備流程，降低設(shè)備投資、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用和動(dòng)力捎耗，簡(jiǎn)便操作。 流程的制訂應(yīng)考慮：地理、氣候環(huán)境、設(shè)備條件,環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件； 在溫暖

29、潮濕的南方，要加強(qiáng)除水設(shè)施 ； 壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除油霧的污染 ，也可采用無(wú)油潤(rùn)滑的往復(fù)式壓縮機(jī)； 往復(fù)式壓縮機(jī)，要配備前置粗過(guò)濾器及空氣貯罐。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),空氣過(guò)濾除菌流程的分析,具體的空氣除菌流程，隨氣候條件及設(shè)備條件不同而差別很大。 要保持過(guò)濾器有比較高的過(guò)濾效率，應(yīng)維持一定的氣流速度和不受油、水的干擾。氣流速度可由操作來(lái)控制；要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分離、加熱的設(shè)備來(lái)保證空氣的相對(duì)濕度在5060的條件下過(guò)濾。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),流程主要設(shè)備：空氣壓縮機(jī) 、空氣過(guò)濾器 附屬設(shè)備：粗過(guò)濾器、氣液分離器、空氣貯罐、空氣冷卻器,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),除菌

30、過(guò)濾器 形式以板框式、管式、折疊式為主 過(guò)濾介質(zhì)：微過(guò)濾膜（聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚砜膜、聚酰胺膜等。） 除菌過(guò)濾應(yīng)具備的特點(diǎn)： 高的過(guò)濾精度; 大的通過(guò)量; 能耐反復(fù)的消毒操作; 強(qiáng)的親水性或疏水性; 足夠的使用強(qiáng)度。,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),消毒問(wèn)題 濾芯（器）消毒是一個(gè)日常操作工序。濾芯常見(jiàn)的消毒方法有蒸汽、熱水和化學(xué)試劑消毒三種。 蒸汽消毒要注意選擇飽和蒸汽，一則是可以可靠殺死細(xì)菌，二則是可通過(guò)控制壓力來(lái)調(diào)節(jié)溫度。蒸汽消毒對(duì)于疏水濾芯來(lái)說(shuō)相對(duì)是簡(jiǎn)單的，但對(duì)親水濾芯特別是膜材料耐溫度不高的濾芯來(lái)說(shuō)，操作方法是至關(guān)重要的,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),1，粗過(guò)濾器 作用：是捕集較大的灰塵顆粒，防止

31、壓縮機(jī)受磨損，同時(shí)也可減輕總過(guò)濾器負(fù)荷。 要求：過(guò)濾效率要高，阻力要小；否則會(huì)增加壓縮空氣的吸入負(fù)荷和降隱低壓縮空氣機(jī)的排氣量。 常用的粗過(guò)濾器有： 布袋過(guò)濾 填料過(guò)濾 油浴洗滌 水霧除塵,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),2，空氣貯罐 作用：是消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈動(dòng)，維持穩(wěn)定的空氣壓力，同時(shí)也可以利用重力沉降作用分離部分油霧。 貯罐的大小可按下面的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),3，氣液分離器 旋風(fēng)式 填料式,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),4，空氣冷卻器 立式列管式熱交換器 沉浸式熱交換器 噴淋式熱交換器,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),空氣除菌流程的分析,幾種典型的設(shè)備流程 兩級(jí)冷卻、加熱除菌流程 冷熱空氣直接混合式

32、空氣除菌流程 高效前置過(guò)濾空氣除菌流程,空氣除菌系統(tǒng)包括：冷卻、分離油水、加熱、 過(guò)濾,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),空氣預(yù)處理,1. 原理： 除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過(guò)濾效率和濾器壽命； 降溫：防燒傷介質(zhì)及水分蒸發(fā)嚴(yán)重，對(duì)發(fā)酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過(guò)濾器長(zhǎng)菌堵塞（因水滴） 加熱：保持相對(duì)濕度 穩(wěn)壓：防止壓力波動(dòng)，貯罐 2. 預(yù)處理流程設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)繁關(guān)鍵：去濕問(wèn)題,措施：建吸風(fēng)塔、粗過(guò)濾器（布袋過(guò)濾器、,填料過(guò)濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置等）、高效前置過(guò)濾器,發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),空氣預(yù)處理流程設(shè)計(jì),發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù),兩級(jí)冷卻、加熱除菌流程圖 1-粗過(guò)濾器；2-空壓機(jī)；3-貯罐；4，6-冷卻器；5-旋風(fēng)分離器；7-絲網(wǎng)分離器； 8-加熱器；9-過(guò)濾器,能有效控制壓縮空