1、第四章 DNA損傷、修復(fù)與重組 DNA damage、repair and recombination,DNA通過半保留復(fù)制的機(jī)制保證代謝上的穩(wěn)定性。但穩(wěn)定是相對的，從進(jìn)化的角度上看，DNA是處于不斷的變異和發(fā)展之中。 造成DNA變異的因素主要有： 突變（ mutation ） 基因重組（ gene recombination ） 染色體畸變,第一節(jié) 突變,突變(mutation):DNA堿基序列水平上發(fā)生的永久性的、可遺傳的變異。 一、突變的類型 根據(jù)突變發(fā)生的原因： 自發(fā)突變（spontaneous ）：由于外界環(huán)境的自然作用或生物體內(nèi)生理生化變化而誘發(fā)的突變（堿基錯配（復(fù)制）、堿基之間的

2、互變異構(gòu)、堿基脫氨基、脫嘌呤或脫嘧啶、活性氧引起的誘變） 人工誘變（Induced mutations） ：由于人工特設(shè)的誘發(fā)因素而引起的突變。,根據(jù)突變的機(jī)理： 堿基對的置換（substitution）或點突變（point mutation）：一個單一堿基的改變。 轉(zhuǎn)換（transition）：DNA分子中的嘌呤為另一種 嘌呤或嘧啶被另一種嘧啶取代而引起的突變； 顛換（transversion）：DNA分子中嘌呤被嘧啶所取代或嘧啶被嘌呤所取代而引起的突變；,點突變的效應(yīng)：,無義突變（nonsense ）：使氨基酸密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子（UGA、UAG、UAA）的突變. 錯義突變（missen

3、se ）：三聯(lián)體密碼子發(fā)生突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)中原來的氨基酸被另一氨基酸取代 同義突變（samesense ）：雖然三聯(lián)體密碼子發(fā)生突變，但仍然編碼同一種AA。,插入或缺失突變（insertions/deletions）：DNA分子中插入或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸 突變效應(yīng)： 插入或缺失幾個氨基酸： 移碼突變（frameshift ）：DNA分子中插入或缺失非3n個核苷酸，使整個閱讀框改變而引起的突變。,1.2 physical and chemical mutagens,1.2.1 physical mutagens 包括X-、-、-、- 、UV 1.2.1.1 direct functions

4、： ionizing radiation（電離射線）：使DNA失去電子，引起DNA發(fā)生廣泛的化學(xué)變化； nonionizing radiation （非電離射線）:引起原子振動或促使電子進(jìn)入較高能級，導(dǎo)致形成新的化學(xué)鍵。 如UV可使DNA形成胸腺嘧啶二聚體。,二、導(dǎo)致誘變的理化因素及其作用機(jī)制,（一）物理誘變劑（physical mutagens） 包括X-、-、-、- 、UV 1、直接作用： 電離射線（ionizing radiation ）使DNA失去電子，引起DNA發(fā)生廣泛的化學(xué)變化； 非電離射線（non）引起原子振動或促使電子進(jìn)入較高能級，導(dǎo)致形成新的化學(xué)鍵。 如UV可使DNA形成胸腺

5、嘧啶二聚體,2、間接作用：輻射首先作用于遺傳物質(zhì)以外的物質(zhì)，使這些物質(zhì)發(fā)生變化，然后由這些變化的物質(zhì)再作用于遺傳物質(zhì)，引起一系列的遺傳學(xué)效應(yīng)。,Deamination-oxidation,U.V.,C,U A,U.V.,C C A,（二）化學(xué)誘變因素（chemical ）,堿基類似物（base analog） 堿基修飾劑（base modifier ） 嵌入染料（intercalating dye）,堿基類似物（base analogs）,5-BrU： T 類似物,轉(zhuǎn)換,5BrU的酮式和烯醇式具有不同的配對特性,5-BrU(k),G,5-BrU(e),C,mispairing,mispairi

6、ng,T,A,5-BrU(k),5-BrU(e),Replication error,Incorporation error,5-BrU(k),5-BrU(e),2氨基嘌呤的不同配對特性,亞硝酸（Nitrous acid，NA）：脫氨基作用；,A C G,I C U =A X =C,羥胺（NH2OH，HA）：特殊的點突變誘變劑， 使C HC(4羥胺胞嘧啶)A，結(jié)果誘發(fā)GCAT的轉(zhuǎn)換,堿基修飾劑（ base modifier ）,ATGC GCAT,烷化劑（alkylating agents）：一類帶有單/多個不穩(wěn)定的烷基，可將烷基加入到核酸上各種位點的親電化學(xué)試劑。,MMS （methylme

7、thane sulfonate） 甲烷磺酸甲酯,-ATTTTTCG - -TAAAAAGC-,-AT EB TTTTCG- -TA,分子插入,X,AAAAGC-,吖啶染料：美國癌癥研究所以吖啶分子為基礎(chǔ)，人工合成的一類誘變劑。,嵌入染料（intercalating dye）,5-BrU(k),G,5-BrU(e),C,5-BrU(k),定向誘變（targetted mutagenesis）：堿基類似物/堿基衍化物代替正常堿基配對后，未被修復(fù)機(jī)制糾正，導(dǎo)致子代將錯就錯地復(fù)制下去。,三、定向誘變和不定向誘變,不定向誘變（untargetted mutagenesis）：大部分突變都可以作為DNA修

8、復(fù)機(jī)制的底物，進(jìn)行精確修復(fù)。但有時不能用這些精確的修復(fù)系統(tǒng)時，就會采用轉(zhuǎn)移損傷DNA合成（transition DNA synthesis），這是一類會帶來差錯的修復(fù)。,遺傳信息發(fā)生錯誤的原因：,一些理化因子作用于DNA，改變堿基結(jié)構(gòu)； DNA在復(fù)制過程中發(fā)生錯配； DNA重組； 外源基因的整合。,保證遺傳穩(wěn)定的機(jī)制-DNA修復(fù),第二節(jié). DNA修復(fù)（ DNA repairing ）,DNA的修復(fù)（DNA repairing）：是細(xì)胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細(xì)胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續(xù)生

9、存。,DNA的改變包括兩類： 單個堿基的改變Single base changes ： 雙螺旋結(jié)構(gòu)的異常扭曲Structural distortion,1、直接修復(fù)（direct repair） 光復(fù)活修復(fù)（photo reactivation）,-TT- -AA-,光復(fù)活修復(fù)只能修復(fù)嘧啶二聚體.,The pyrimidine dimer blocks DNA replication 高等哺乳動物該功能退化了。 例：對細(xì)菌紫外誘變或殺滅時盡量保持暗環(huán)境,切口的重接：DNA連接酶（ligase）修復(fù)。 烷基的轉(zhuǎn)移： O6甲基-G-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT)， 單加氧酶(依賴于-酮戊二酸和Fe2+)(

10、AlkB),2、切除修復(fù)（excision repair）,堿基切除修復(fù)（Base excision repair ）,U和烷基化的堿基可被糖苷酶( glycosylases）并直接從DNA上切除,Before Replication，暗修復(fù),核苷酸的切除修復(fù) (Nucleotide excision repair systems ),切除包括損傷堿基的一段序列,Enzymes: 核酸內(nèi)切酶 核酸外切酶 DNA聚合酶 DNA連接酶,The Uvr system,3-6,522,3（3-4） 5-7,3、重組修復(fù)（recombination repair）,實質(zhì)：并非修復(fù)，而是“稀釋”。,4、錯

11、配修復(fù)（mismatch repair）,應(yīng)急反應(yīng)（SOS）：由DNA損傷或抑制復(fù)制的處理所引起的一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)。 SOS誘導(dǎo)的修復(fù)作用： A. error free repair（避免差錯修復(fù)）：修復(fù)過程中錯配堿基通常被切除，修復(fù)后DNA恢復(fù)正常。 B. error-prone repair（易錯修復(fù)）：DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù).,5、誘導(dǎo)修復(fù)和應(yīng)急反應(yīng),Jean Weagle,alive 80 10 Mut. 90% 10%,Damaged DNA of

12、 -phage be repaired more in E.coli A SOS repair in E. coli have to be induced by U.V.（A） High frequency mutation by SOS repair（Error-prone）,LexA 可抑制許多基因的表達(dá)，包括修復(fù)、recA和 lexA。 RecA激活啟動了 LexA的降解，進(jìn)而誘導(dǎo)了許多基因的表達(dá),300 X,機(jī)制,RecA的功能：,當(dāng)DNA正常復(fù)制時,（無復(fù)制受阻，無DNA損傷，無TT dimer）,RecA不表現(xiàn)proteinase活性,當(dāng)DNA復(fù)制受阻/ DNA damaged,能

13、量大量消耗,當(dāng)DNA復(fù)制度過難關(guān)后,SOS repair 是一種error-prone 極強的修復(fù)機(jī)制是進(jìn)化中形成的“ 竭盡全力，治病救人” 的措施（正常狀態(tài)下，SOS是關(guān)閉的）,6、 DNA損傷修復(fù)的重要性,人類遺傳性疾病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4000多種，其中不少與DNA修復(fù)缺陷有關(guān)，這些DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞表現(xiàn)為對輻射和致癌劑的敏感性增加； 著色性干皮?。▁eroderma pigmentosum）：第一個被發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)缺陷遺傳病，患者皮膚和眼睛對陽光特別是UV十分敏感，暴光部位皮膚干燥脫屑、色素沉著、容易潰瘍、皮膚癌發(fā)病率高，常伴有神經(jīng)系統(tǒng)障礙，智力低下等。病人的細(xì)胞對嘧啶二聚體和烷基化的清除能力

14、降低。,遺傳性非息肉結(jié)腸癌（HNPCC）是由于DNA錯配修復(fù)有缺陷而造成的（其中一種錯配修復(fù)酶突變丟失）。該遺傳病表現(xiàn)為：家族成員是癌癥高發(fā)群，許多成員患結(jié)腸癌、胃癌或子宮癌。,總結(jié)：變異的形成,DNA,未經(jīng)修復(fù),經(jīng)過修復(fù) / 校正,變異是在修復(fù)過程中形成的不準(zhǔn)確的修復(fù),The example of how damage results mutation.,第三節(jié)重組（Recombination）,突變是進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ) 突變（+重組） 可遺傳的變異 遺傳漂變（genetic drift）、 自然選擇（natural selection）進(jìn)化,重組是進(jìn)化的必要條件,迅速增加群體的遺傳多樣性； 使

15、有利突變與不利突變分開； 通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息。,一 同源重組 (Homologous Recombination),1、定義：兩條同源區(qū)的DNA分子，通過配對、鏈的斷裂和再連接，而產(chǎn)生片段交換的過程。 2、特點： 發(fā)生在同源染色體/同源序列（75bp）之間； 較大片段的交換； 交換位點可以在同源區(qū)的任何位置上； 十分精確，無核苷酸的缺失、獲得和改變。,3、holliday模型,兩個同源染色體DNA排列整齊； 一個DNA的一條鏈斷裂并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成連接分子，即holliday中間體； 通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA； holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈

16、重組體DNA。,拼接重組體。,片段重組體,如切開的鏈與原來斷裂的是同一鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA，稱為片段重組體。 如切開的鏈非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA，稱為拼接重組體。,問題： 難以設(shè)想模型認(rèn)為的兩個DNA能在同一位置發(fā)生斷裂。,Moselson提出修正，認(rèn)為同源DNA分子中只有一個分子發(fā)生單鏈斷裂，隨后單鏈入侵另一個DNA分子的同源區(qū)，造成鏈的置換，被置換的鏈再切斷并與最初斷鏈連接，即形成Holliday中間體。,相應(yīng)的遷移形成雙個交叉,4 雙鏈斷裂啟動重組,在兩個交叉之間，由交換和分支遷移產(chǎn)生的是異源雙鏈，由修復(fù)合成產(chǎn)生的是同源雙

17、鏈。,雙鏈斷裂；,產(chǎn)生3末端的單鏈；,單鏈攻擊；,修復(fù)合成與鏈置換,被置換的鏈遷移到另一雙螺旋；,修復(fù)合成，缺口被供體序列置換,5 E.coli中與DNA同源重組有關(guān)的酶,chi 位點,可被幾 kb 處的雙鏈斷裂所激活 引起重組 chi 位點是 RecBCD 蛋白的靶標(biāo),5 - GCTGGTGG -3 3 - CGACCACC- 5 ,5.1 RecBCD產(chǎn)生具有自由3末 端的單鏈 DNA。,ATP依賴的核酸外切酶活性； 被ATP增強的核酸內(nèi)切酶活性； ATP依賴的解螺旋酶活性。,3.1.5.2 Strand-transfer proteins catalyze single-strand a

18、ssimilation,Single-strand assimilation: Strand-transfer proteins (RecA )enables a single strand to displace its homologue in a duplex RecA forms filaments with single-stranded or duplex DNA and catalyzes the ability of a single-stranded DNA with a free 3 to displace its counterpart in a DNA duplex.,

19、2、RecA蛋白： 可誘發(fā)SOS反應(yīng)和促進(jìn)DNA單鏈的同化。 單鏈同化：指單鏈與同源雙鏈分子發(fā)生鏈的交換，單鏈同化是在螺旋狀纖絲中進(jìn)行的。,RecA蛋白介導(dǎo)的DNA 鏈交換過程為： RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合形成螺旋狀纖絲； 螺旋狀纖絲與同源雙鏈DNA結(jié)合； 單鏈DNA與雙鏈中的互補鏈配對，同源鏈被置換出來。,RuvA：識別Holliday聯(lián)結(jié)體的交叉點 RuvB：六聚體解旋酶，有ATP酶活性，促進(jìn)分支遷移.,5.3 RuvAB促進(jìn)分支遷移,10-20 bp/sec.,不對稱的ATTC是RuvC的識別位點和切割熱點， 并決定結(jié)果是片段重組還是拼接重組。,5.4RuvC特異性識別并切開Holl

20、iday聯(lián)結(jié)體,2特異位點重組(site-specific recombination),Specialized recombination involves reaction between specific sites that are not necessarily homologous 特點：,發(fā)生在特定的短（20200bp）DNA序列內(nèi)（重組位點） 有特異的酶（重組酶）和輔助因子。,位點特異重組的結(jié)果依賴于重組位點的位置和方向。 如重組位點反方向存在于同一DNA鏈上，重組結(jié)果發(fā)生倒位。 如重組位點相同方向存在于同一DNA鏈上，重組結(jié)果發(fā)生切除。 如重組位點存在于不同的DNA鏈上，重組

21、結(jié)果發(fā)生整合。,兩個倒轉(zhuǎn)重復(fù)的交互重組將二者之間的序列反向排列,兩個正向重復(fù)的交互重組會把二者之間的序列刪除掉,O,噬菌體DNA的整合(Integration)與切除(excision),3轉(zhuǎn)座重組(transpositional recombination),3.1轉(zhuǎn)座子(transposon,transposable element ): 可以由染色體的一個位置轉(zhuǎn)移到另外一個位置的一段DNA。,Barbara McClintock (86y),1983. The Nobel Prize,是基因組的一個物理實體； 有限制其在基因組內(nèi)無限轉(zhuǎn)座的機(jī)制； 其末端有反向重復(fù)序列 IR(inverte

22、d repeats ) 轉(zhuǎn)座后在其插入位點產(chǎn)生正向重復(fù)序列DR(directs repeats ),3.2 轉(zhuǎn)座子的特點,3.3轉(zhuǎn)座（transposition）,轉(zhuǎn)座子從基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一位置的過程。.,非復(fù)制型轉(zhuǎn)座(nonreplicative transposition) the transpons moves as a physical entity directly from one site to another.,轉(zhuǎn)座的類型,復(fù)制型轉(zhuǎn)座(replicative transposition): transposons is duplicated during the rea

23、ction, so that the transposing entity is a copy of the original element,非復(fù)制性轉(zhuǎn)座要經(jīng)過鏈的斷裂與重連,非復(fù)制轉(zhuǎn)座中轉(zhuǎn)座子僅從供體位點向受體位點做物理性移動，從而在供體位點造成鏈的斷裂，若斷裂不被修復(fù)，后果將是致命的。,復(fù)制性轉(zhuǎn)座產(chǎn)生轉(zhuǎn)座子的一個拷貝，由該拷貝插入到受體位點，供體位點序列不變，因此供體和受體位點都有一個拷貝的轉(zhuǎn)座子。,復(fù)制型轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座可將供體和受體融合成一個共整合體，在共整合體中，兩個轉(zhuǎn)座子以正向重復(fù)形式存在。共整合體以位點特異性重組方式進(jìn)行拆分，拆分后每個DNA分子含有一個拷貝的轉(zhuǎn)座子。,非同源重組過程

24、； 轉(zhuǎn)座插入的靶位點并非完全隨機(jī)(插入專一型); 轉(zhuǎn)座子兩側(cè)常有IR； 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會形成DR,轉(zhuǎn)座的特點,引起插入突變； 在插入位置染色體重排； 影響插入位置鄰近基因的表達(dá)； 染色體畸變。 插入位置上出現(xiàn)新的基因 調(diào)節(jié)基因活動的開關(guān) 產(chǎn)生新的變異，有利于進(jìn)化,轉(zhuǎn)座引起的遺傳效應(yīng),3.4、細(xì)菌轉(zhuǎn)座子,3.4.1插入序列(Insertion Sequence,IS),插入序列的存在只能借助于插入位點有關(guān)基因的失活來判檢測，或通過分子雜交和測序來檢測。,最小的轉(zhuǎn)座因子,除轉(zhuǎn)座酶基因外不攜帶任何標(biāo)記基因; Is的兩端都有IR，IR為轉(zhuǎn)座酶識別所需，長度1525bp。 當(dāng)Is轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位

25、雙鏈被交錯切開，經(jīng)修復(fù)后Is兩側(cè)形成短的DR； 靶序列通常是任意的，但交錯切開的長度是固定的，一般為5bp9bp。,大小2.5 kb20 kb； 具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因、選擇標(biāo)記基因；,Tn1（AmpR） Tn2（AmpR） Tn3（AmpR） Tn4（AmpR StrR）Tn5（KanR） Tn6（kanR） Tn7（StrR TmpR） Tn9（CamR） Tn10（TetR）,3.4.2復(fù)合轉(zhuǎn)座子（Tn，Complex transposons or Transposon）,自主序列元件(Autonomous controlling elements): code for proteins that enable th