1、生 物 工 程 譚 樹 華 博士、教授 ,中國藥科大學生物制藥學院,參考書目錄,BOOKS Molecular Biology And Biotechnology (Edited by J.M.Walker and E.B. Gingold) Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA (Edited by Bernard R.Glick and Jack J. Pasternak) Pharmaceutical Biotechnology (Edited by Daan J A Crommeli

2、n and Robert D Sindelar) 現(xiàn)代生物工程 焦炳華、孫樹漢主編 現(xiàn)代生物技術導論 瞿禮嘉、顧紅雅、胡蘋 編著 生物技術藥物 馬大龍主編 基因工程原理與方法 孫樹漢主編,JOURNALS NATURE BIOTECHNOLOGY TRENDS IN BIOTECHNOLOGY MOLECULAR BIOTECHNOLOGY,藥物分類,第一章 緒論 第一節(jié) 生物工程的概念 生物工程（技術）：就是利用生物有機體（這些生物有機體包括從微生物至高等動、植物）或其組成部分（包括器官、組織、細胞或細胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術體系。,現(xiàn)代生物工程被列為當今世界公認的七大高新技術之

3、首（現(xiàn)代生物工程技術、航天工程技術、信息工程技術、激光工程技術、自動化工程技術、新能源工程技術和新材料工程技術。生物工程之所以受到世界各國的如此重視，是因為它在解決人類所面臨的諸如食物短缺、人類健康、環(huán)境污染和資源匱乏等重大問題上有著無可比擬的優(yōu)勢和巨大潛力。它已廣泛應用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工、食品、化工和能源等領域，并以對人類社會生活產(chǎn)生了深遠的革命性影響。,第二節(jié) 生物工程主要研究內(nèi)容 1、基因工程 2、動物細胞工程 3、酶工程 4、微生物工程,生物技術發(fā)展史上的里程碑,第三節(jié) 生物技術制藥的誕生與發(fā)展,生物技術藥物 （biopharmaceutics,Biotech drug): 利

4、用生物體、生物組織、細胞或其成分，綜合應用生物學與醫(yī)學、生物化學與分子生物學、微生物學與免疫學、物理化學與工程學和藥學的原理與方法加工制造而成的一大類用于預防、診斷、治療和康復保健的制品。,其發(fā)展要追溯到1980年十月十五號，紐約股票交易所開盤后20分鐘內(nèi)，生物制藥公司Genentech的股票價格從$35到$89,成為當時歷史上上漲最快的股票。當時Genentech的年齡才4歲，其原因是在這之前兩年1978年Genentech成功地分離了人胰島素的兩條鏈的基因，并轉(zhuǎn)入了大腸桿菌宿主細胞，這樣就有可能利用大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素，從而解決某些糖尿病患者對豬胰島素過敏的問題。,1982年世界上第一個

5、基因工程藥物藥物誕生了，由美國Lilly公司率先研制的重組人胰島素經(jīng)美國FDA批準投放市場，這標志著生物制藥技術進入了一個新紀元，也給廣大的制藥企業(yè)帶來了無限的商機。同時也向世人展示，以基因工程技術為核心的現(xiàn)代生物技術藥物具有無限的發(fā)展應用前景和生命力。,據(jù)統(tǒng)計，全球生物工程制藥產(chǎn)業(yè)的年銷售額1998年為149億美元，到2007年已增長到840億美元，年增長速度連續(xù)10年保持在15%-33%，其中，銷售額超過10億美元的“重磅炸彈”就有29種。由此可見，雖然生物技術制藥的發(fā)展只有短短20幾年，但已成為發(fā)展最快的高新技術產(chǎn)業(yè)之一。,我國的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)也發(fā)展勢頭良好，截止至2006年4月，我國食品

6、藥品監(jiān)督管理局(SFDA)已批準了35種重組蛋白藥物、治療性抗體或基因治療產(chǎn)品上市，至2006年底，約有50余種生物技術藥物處于臨床或臨床試驗中。,生物技術藥物在臨床上的應用,生物技術藥物(biotech drugs，biopharmaceuticals）己廣泛用于治療癌癥、艾滋病、冠心病、多發(fā)性硬化癥、貧血、發(fā)育不良、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纖維變性和一些罕見的遺傳疾病。,生物技術藥物的類別,主要有三大類： 1、重組治療蛋白質(zhì)（酶、細胞因子、激素） 2、重組疫苗 3、診斷或治療用的單克隆抗體或基因工程抗體。,2008年美國處于臨床試驗的生物技術藥物的分布圖（按產(chǎn)品類型分）中國醫(yī)藥生物技

7、術 2009，4（2）：89,2007 年銷售額最高的6大類生物技術藥物 中國醫(yī)藥生物技術 2009，4（2）：89,2008年美國處于臨床試驗的生物技術藥物的分布圖（按適應癥分） 中國醫(yī)藥生物技術 2009，4（2）：89,第四節(jié) 美國及歐洲主要的生物技術藥物公司,Genetics Institute Bayer Centeon Genentech Gentocor Boehringer Mannheim Galenus Mannheim Eli Lilly Ortho Biotech Hoechst AG,Aventis Pharmaceuticals Genzyme Schwartz P

8、harma Pharmacia and Upjohn Biotechnology General Serono Organon Amgen Dompe Biotec,Schering Plough Hoffman-la-Roche Chiron Biogen Pasteur Merieux MSD Immunomedics Novartis Abbott Wyeth Unigene,Immunex Bedex Laboratories Merk SmithKline Beecham Medeva Pharma Cytogen Med Immune Roche Isis Pharmaceutic

9、als Sanofi-Sythelabo,（安進） 創(chuàng)建于1980年，位于美國加洲Thousand Oaks，靠近加州大學和加洲理工學院。起初由于無產(chǎn)品上市，于1983，1986，1987通過公開發(fā)行股票募集資金維持公司生存。美國Nasdaq股票市場代號為AMGN。 20世紀后10年是生物技術飛速發(fā)展的10年，1989年6月該公司第一個產(chǎn)品重組人紅細胞生成素(erythropoietin，簡稱EPO)獲得美國FDA批準，用于治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和HIV感染治療的貧血1991年2月公司第二個產(chǎn)品重組粒細胞集落刺激因子(filgrastim，G-CSF)獲得美國FDA批準，其適應證為腫瘤化

10、療引起的嗜中性白細胞減少癥。1992年安進公司首次躋身財富500強。此外,還有白細胞介素1受體拮抗劑Kineret和抗類風濕性關節(jié)炎融合蛋白Enbrel等。 公司致力于研發(fā)新的蛋白藥物，應用于腫瘤、炎癥、骨疾病、神經(jīng)疾病、代謝性疾病和腎臟疾病的治療。,三個先驅(qū)生物制藥公司 Amgen,Biogen和Gennentech,Biogen是全球老牌生物技術公司之一，始建于1978年，并于2003年與制藥公司Idec合并組建成Biogen Idec公司。 總部位于美國麻省，在歐洲，加拿大，澳大利亞和日本有分支機構(gòu)。主要研發(fā)癌癥，精神病，皮膚病和風濕病相關藥物。 主要品種是老藥Avonex（野生型干擾素

11、，適應癥為多發(fā)性硬化癥）和Rituxan（與Genentech共同研發(fā)的瞄準癌細胞蛋白質(zhì)的單克隆抗體藥物，它可以挑選出癌細胞，交給免疫系統(tǒng)摧毀，適應癥為腫瘤。 ）。 2005年，新藥Tysabri（人源化單抗，適應癥為多發(fā)性硬化癥）因安全問題撤市使股價受重大打擊，從70美元下跌至35美元/股左右。2006年，Tysabri因療效確實，在嚴格限制下重返市場，現(xiàn)有17000名患者使用該藥，沒有再發(fā)現(xiàn)致命和嚴重副作用。,Genentech(基因技術公司）美國歷史最久的生物技術公司，規(guī)模和實力僅次于安進。它成立于1976年。創(chuàng)始人是風險投資家羅伯特. 斯萬森(Robert A swanson)和生物化

12、學家赫伯特玻意爾博土(DrHerbert Boyer)。 70年代早期，玻意爾(Boyer)和遺傳學家史丹尼科恩(Stanley Cohen)開創(chuàng)了個名為DNA重組技術的科學新領域。斯萬森(Swanson)為這一突破激動不已，他打電話給玻意爾請求會晤。玻意爾同意給這位年輕的創(chuàng)業(yè)者十分鐘的時間。斯萬森對這一技術的熱心和對其商用前景的堅定信念是富有感染力的，會晤由10分鐘延長到了3個小時：其結(jié)果是，基因工程技術公司宣布誕生。,1980年，基因技術公司上市，一個小時內(nèi)每股從35美元劇漲至88美元，公司的身價因此激增至3500萬美無。這一事件是美國股市漲幅最大的案例之一 。 上市有10個基因工程藥物，

13、其中包括:人生長激素“Nutropin”,抗體藥物“Herceptin”和“Rituxan”,溶栓藥物“Activase”和“TNKase”.該公司目前處于臨床試驗階段的還有20個左右的產(chǎn)品 基因工程公司作為美國最早和最大的生物技術類風險投資支持的企業(yè)，代表著美國生物醫(yī)學產(chǎn)業(yè)未來的發(fā)展的方向，同時也為世界風險投資事業(yè)的發(fā)展提供了新的思路,人類終于有了第一個轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物上市用于臨床。該藥品從經(jīng)過基因修飾奶山羊分泌出的羊奶中提取純化，是用于治療一種被稱為遺傳性抗凝血酶缺乏癥的疾病。這種藥物的上市標志著轉(zhuǎn)基因動物藥物真正邁入產(chǎn)業(yè)化時代。,2009年2月6號美國FDA批準了首個利用轉(zhuǎn)基因山羊生

14、產(chǎn)的重組藥物Atryn（由美國麻省生物技術公司 GTC Biotherapeutics生物技術公司）上市。,第五節(jié) 發(fā)展前景 醫(yī)藥生物工程一直是生物工程技術中發(fā)展最快、最活躍的領域，也是各國生物工程研究開發(fā)的重中之重，是生物工程產(chǎn)業(yè)最為成熟，競爭最為激烈的領域。近年來，基因組學、蛋白質(zhì)組學、生物信息學、轉(zhuǎn)基因技術、干細胞和克隆技術、生物芯片技術等一系列新興技術的發(fā)展，為促進醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的途徑和思路，醫(yī)藥生物工程技術正在成為整個醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要的技術推動力。所以生物工程醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)依舊是朝陽產(chǎn)業(yè)。,第二章 基因工程與蛋白質(zhì)工程,基因工程是指在分子水平上按照人們的設計方案將DNA片段（目的

15、基因）插入載體DNA分子（如質(zhì)粒、病毒等），從而實現(xiàn)DNA分子體外重組，產(chǎn)生新的自然界從未有過的重組DNA分子，然后再將之引入特定的宿主細胞進行擴增和表達，使宿主細胞獲得新的遺傳性狀的技術?；蚬こ逃袝r也稱為重組DNA技術或分子克隆技術。,Genetic Codon,一、基因工程的概念及其基本過程,典型的主要步驟有： 1、 目的基因(靶基因)的制備； 2、 載體的選擇與制備； 3、 目的基因與載體的連接； 4、 將重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞，并 在其中進行復制、擴增； 5、 重組子的篩選與鑒定； 6、 表達產(chǎn)物的鑒定； 7、 工程菌（細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)； 8、 表達產(chǎn)物的分離與純化。,Clon

16、ing into a plasmid,基因工程必備的四個工具,工具酶 載體 目的基因(靶基因) 宿主細胞,二、工具酶,1. 限制性內(nèi)切酶（restriction endonucleases） ：是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。這類酶的發(fā)現(xiàn)和應用促進了DNA序列測定和基因工程技術的發(fā)展。它們已成為分子生物學研究和基因工程技術中不可或缺的工具酶。 1968年，科學家E.Smith首次從大腸桿菌K12和K13中提取出了限制性內(nèi)切酶。由于它們能夠在DNA上尋找特定的切點，然后進行交錯或平齊切割，因此又稱作“分子剪刀”，迄今已發(fā)現(xiàn)400多種?，F(xiàn)在基因工程技術中所使用的限制性內(nèi)切

17、酶幾乎都已商品化，在各生物技術公司（如國內(nèi)的華美、美國的Promega等公司）都能購買到。,限制型內(nèi)切酶的命名 為了對這些酶進行合理地命名，H.O.Smith和D.Nathans于1973年提出了限制性內(nèi)切酶的命名規(guī)則：（1）取該酶的產(chǎn)生菌的屬名的第一個大寫字母和種名的第一、二個小寫字母組成酶基本名稱；（2）若具有不同株，取其株系的第一個字母加于酶名稱之后，需大寫；（3）若同一株中發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)切酶則用大寫羅馬字碼I、II、III、IV表示分離次序先后。以下是幾種常見內(nèi)切酶的命名情況,限制型內(nèi)切酶的性質(zhì) 基因工程技術中使用的酶屬于II型限制性內(nèi)切酶，它一般具有以下特性： 識別序列：大多數(shù)酶的識別序

18、列為4-6個雙重對稱（回文結(jié)構(gòu)）的核苷酸，少數(shù)酶識別更長的序列。 切割方式： （1）在對稱軸兩側(cè)相對的位點上，交錯切割，形成帶有1到4個核苷酸長度的5，端突出或3，端突出的粘性末端。所謂粘性末端是指含有幾個核苷酸單鏈的末端，可通過粘性末端堿基互補，使不同的DNA片段發(fā)生退火，有利于連接酶的連接。 （2）在識別序列雙重對稱軸上同時切割雙鏈，產(chǎn)生平齊末端或鈍端。以下是幾種典型的限制性酶的識別序列與切割方式。,5端突出,3端突出,平齊末端,反應條件： （1）一般限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度為37,但也有例外，如Sma則為25。 （2）不同限制性內(nèi)切酶反應所需的離子強度也不一樣，一般分高、中、低三種。在

19、進行操作時可供應商所提供的反應體系與反應溫度進行。,同裂酶與同尾酶 同裂酶（isoschizomer）：又稱異源同工酶，指不同來源但識別和切割序列完全相同的限制性內(nèi)切酶。如HpaII和MspI(CCGG)； 不完全同裂酶：指識別序列相同，但切割位點不同的酶，如SmaI（CCCGGG）和Xma I（CCCGGG）； 同尾酶：來源及識別序列均不相同，但切割后行成的限制性片段具有相同粘性末端的，當它們消化后產(chǎn)生的片段互相連接后，這兩種酶的識別序列一并消失。如：Sal I（GTCGAC）和Xho I(CTCGAG) Sal I片段 Xho I片段 5，G， + TCGAG 3， 3，CAGCT C 5

20、， 5， GTCGAG 3， 3， CAGCTC 5，,星號活力（第二活力） 迄今所發(fā)表的第II型限制性內(nèi)切酶的識別序列都是在一定消化條件下測出的，當條件改變時，酶的專一性可能會降低，以至同一種酶可識別和切割更多的位點。 如EcoR I通常只識別GAATTC，但是在低鹽（50nM），高pH（8）和甘油存在的條件下，EcoR I識別序列與原來不同，產(chǎn)生EcoR I星號酶活，除中間四個堿基A不能變成T、T不能變成A外，識別序列的6個堿基位置上僅在一處與原來序列不同的任何一個堿基的替代，EcoR I照舊能識別此序列（如GAATTA，AAATTC，GAGTTC等）。因而EcoR I的識別序列在DNA上

21、出現(xiàn)的頻率要比EcoR I識別序列的出現(xiàn)頻率高15倍。此外，BamH I也有類似情況。 因此，為了獲得一種限制性內(nèi)切酶的最適反應速度和理想的消化專一性，必須堅持應用推薦的反應條件 。,酶的儲存 純化后的限制性內(nèi)切酶酶制劑，通常儲存在含有50%甘油的緩沖液中，保存于-20，不會冰凍，一般可儲存一年以上。儲存酶的溫度不能過低，若低于-20，可使50%甘油冰凍，而反復凍融會導致酶嚴重失活。保存酶液的緩沖體系，不同的酶略有差異,但不外呼是50-100mMKCl即100mM Tris-HCl pH7.5,0.1mM EDTA,1mM DTT，同時加入BSA濃度至100-200g/ml,以保護酶蛋白不失活

22、。所用BSA質(zhì)量要求很高，一定不能含有核酸酶類的活性。,酶活力單位的定義 在50l緩沖液中，于最適反應條件和溫度下保溫1小時，能將1gDNA完全降解所需的酶量即為1個酶活單位。 需要說明的是，所謂一個酶單位降解1gDNA是指在測活時所用的特定反應體系和DNA種類下完成的，若鹽濃度、pH等因素，尤其是DNA的種類改變后，并不一定一個酶單位還能完全消化1gDNA。如，降解1g的pBR322所用的酶量要大于水解1gDNA所用的酶量。,2 T4DNA連接酶 基因工程最常用的連接酶是T4DNA連接酶（T4 DNA ligase）, 它可將兩段乃至數(shù)段DNA片段拼連起來，起到分子“縫合”的作用。該酶是從T

23、4噬菌體感染的E.coli 中分離得到的分子量為68KDa的單鏈多肽酶，它可催化一個DNA片段的3羥基和另一個DNA片斷的5磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵，連接時需要ATP為輔助因子。該酶既可連接粘性末端，也可連接齊平末端，是應用最廣泛的連接酶。 T4DNA連接酶最適反應溫度為37，但為了增強兩段DNA片段粘性末端互補堿基之間形成氫鍵的穩(wěn)定性，實際反應溫度一般為415。,其它常用修飾酶 DNA聚合酶 分子克隆中 經(jīng)常會使用各種DNA 聚合酶，從而在有模板存在時催化合成與模板序列互補的DNA產(chǎn)物。常用的DNA聚合酶有大腸桿菌聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Klenow 片斷）、T4DNA聚合酶，

24、T7DNA聚合酶，耐高溫的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）,反轉(zhuǎn)錄酶等等。不同種類的DNA聚合酶來源不同，酶學特性及用途也各異，其應用涉及到DNA分子的體外合成，定點突變，DNA探針的標記，DNA序列測定，基因文庫的構(gòu)建，聚合酶鏈反應（PCR）等等諸多方面。,T4多核苷酸激酶 該酶可催化ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5一OH上?？煞譃檎蚍磻敖粨Q反應。該酶的一個用途是用同位素標記DNA片段的5末端，反應底物包括化學合成的寡核苷酸片段的5一OH和DNA酶切所得的5粘端或平端，后者必須先用堿性磷酸酯酶去除5一P，再加上P，這種方法不適用于3粘端。另一用途是在化學合成的寡核苷酸片段的

25、5一OH上加上磷酸基團，以便進行化學合成基因的拼連。 堿性磷酸酶 包括細菌堿性磷酸酶(BAP)和牛小腸堿性磷酸酶(CIP)，其作用是去除DNA、RNA、NTP和dNTP的5磷酸根。在基因克隆時可用于去除載體DNA片斷的5P，以防載體自身環(huán)化；此外，在用32PATP對基因探針進行5進行標記前，可用該酶去除其5磷酸基團。,基因工程載體 目的基因（靶基因）必須與載體DNA重組后才能導入宿主細胞并進行擴增和表達，從而獲得大量的目的基因克隆以及表達產(chǎn)物。這種可將外源DNA載入宿主細胞的工具便稱為載體（vector）。 一般作為基因工程載體需要滿足以下條件：1、能在宿主細胞中獨立復制繁殖；2、有一定的選擇

26、標記，易于識別和篩選；3、可插入一段較大的外源DNA，而不影響其自身的復制；4、有合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便進行DNA重組與克隆。 目前基因工程載體主要有三類： 質(zhì)粒：各種質(zhì)粒，用于基因克隆與表達； 噬菌體：噬菌體、粘粒、M13噬菌體等； 病毒：SV40等。,質(zhì)粒 質(zhì)粒DNA是微生物細胞中分子量比染色體DNA小得多的共價、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子（個別除外，如酵母自殺質(zhì)粒是RNA），是一種存在于染色體外的能自主復制的遺傳因子，質(zhì)粒通常帶有與細胞的主要代謝活動無關的一些基因，例如抗生素抗性基因，產(chǎn)生細菌素的基因，碳水化合物分解代謝的基因和誘發(fā)腫瘤的基因等等。由于質(zhì)粒的存在，宿主細胞往往被賦

27、予新的表型，當把一個含抗藥性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞之后，原來無抗藥能力的細菌則表現(xiàn)出抗藥新表型。,質(zhì)粒的生物學性質(zhì) (1) 質(zhì)粒的復制 具備復制起點（原點）是DNA分子在宿主細胞中進行復制的一個必要條件。根據(jù)復制控制類型的不同質(zhì)粒分為嚴緊型質(zhì)粒與松弛型質(zhì)粒，前者受宿主細胞復制作用的嚴格控制，因此，每個細胞中只含有一至幾個拷貝；而后者則受宿主細胞的控制不嚴，它們在每個細胞中的數(shù)目可達10-500個拷貝，當用氯霉素抑制細胞蛋白質(zhì)合成時，質(zhì)?？截悢?shù)可擴增至數(shù)千個?，F(xiàn)在使用的質(zhì)粒載體絕大多數(shù)都是松弛型質(zhì)粒。,（2）質(zhì)粒不相容性（incompatibility) 指在沒有選擇壓力的條件下，兩種親源關系密切的

28、質(zhì)粒不能共存于同一宿主細胞中的現(xiàn)象。原因是它們的復制子相同，所用的復制系統(tǒng)也相同，故在復制和分配到字細胞的過程中互相競爭。細菌生長幾個世代后，量少的質(zhì)粒就完全消失。至今已發(fā)現(xiàn)30個以上的不相容組，只有屬于不同不相容組中的質(zhì)粒才能共同存在于同一個宿主細胞中。 （3）選擇標記 當質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞時，只有極少部分宿主細胞接受了DNA，所以需要利用質(zhì)粒編碼的選擇標記將轉(zhuǎn)化成功的宿主細胞（陽性克?。拇罅康乃拗骷毎泻Y選出來。 質(zhì)粒最常用的選擇標記是抗生素抗性基因，這些抗性主要包括氨芐青霉素（Amp或Ap）、四環(huán)素(Tet)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan或Km)和新霉素（Neo）等。例如，對氨

29、芐青霉素有抗性的質(zhì)粒，一般寫作Apr；而對該藥敏感的質(zhì)粒則寫作Aps。,常見質(zhì)粒載體 由于野生質(zhì)粒往往存在許多不足，因此現(xiàn)在使用的質(zhì)粒載體一般都是人工構(gòu)建的，從而使其滿足以下條件：1、其分子結(jié)構(gòu)中帶有多個單一限制酶切位點，2、構(gòu)建后的重組質(zhì)粒必須易于轉(zhuǎn)化；3、帶有一個以上強選擇性標記；4、分子量較小，屬松弛型復制控制，便于操作；5、宿主范圍小，無感染性。 pUC 系列載體是目前應用較廣的一組可用于克隆、測序和表達外源基因的非常有用的載體系列。這類載體具有以下特征：（1）、高拷貝數(shù)，每個宿主細胞中拷貝數(shù)可達500-700個；（2）、在相應的宿主中可出現(xiàn)互補，便于進行藍、白斑篩選；（3）、pUC

30、系列載體是成對出現(xiàn)的，它們之間除多克隆位點排列方向相反外，其它并無區(qū)別。,2007/10/10,噬菌體 結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 噬菌體分頭部和尾部，其DNA存在于頭部，當其尾部附著在大腸桿菌宿主表面時，其DNA通過尾部注入宿主菌。噬菌體基因組是一線性雙鏈DNA分子，長48502bp，含61個基因，其兩端各有長為12個堿基的互補單鏈。進入宿主后，粘性末端相連（此處稱COS位點）形成環(huán)狀DNA分子，根據(jù)噬菌體三個編碼基因（cI、cII、cro）產(chǎn)物間的平衡情況進入溶菌或溶源生活周期。 在溶菌方式中，環(huán)狀DNA分子被復制許多倍，噬菌體基因產(chǎn)物大量合成，并組裝成子代噬菌體顆粒，最終宿主細胞裂解，釋放出許多成熟的噬

31、菌體顆粒。 在溶源方式中，噬菌體DNA通過專一位點重組整合入宿主DNA分子中，隨宿主菌DNA一起復制并轉(zhuǎn)入子代細胞中。,噬菌體DNA克隆載體 噬菌體DNA可分為三個部分：左臂、右臂及中央?yún)^(qū)。溶菌生長所需的基因位于基因組的左、右臂，而溶源化生長所需的基因都集中在中央?yún)^(qū)，若用外源DNA置換這個區(qū)域的基因，并不影響噬菌體顆粒的形成。這便是噬菌體DNA可作為載體攜帶外源基因的基礎。 野生型噬菌體DNA上有許多常用限制性酶切位點（如EcoRI、HindIII等），不能直接作為載體，需要經(jīng)過人工改建才能成為有價值的克隆載體，改建工作包括：1、消除或改變DNA必需區(qū)的不必要的限制性酶切位點；2、在可替代區(qū)構(gòu)

32、建所需的酶切位點；3、其它結(jié)構(gòu)上的改建，以提高載體效用，如插入一個外源啟動子，使載體具有表達外源基因的功能等等。,載體的種類 載體可分為插入型和置換型兩大類，前者具有單一酶切位點可供外源DNA插入，后者有成對的酶切位點，兩酶切位點間的DNA片段可被外源DNA片段置換。常見的載體有gt系列（置換型載體），常用于cDNA文庫構(gòu)建；Charon系列（分插入和置換兩種類型）, 可容納0-24Kb大小的外源基因。 載體的特點 載體具有以下優(yōu)點：1、可攜帶較長的外源DNA片段，最長達18-22Kb; 2、重組DNA分子包裝成噬菌體顆粒后具有更高的轉(zhuǎn)染能力；3、重組的噬菌體容易篩選和儲存。 此外，為獲得較高

33、的感染宿主能力，DNA構(gòu)建的重組DNA分子必須包裝成完整的噬菌體顆粒，這對于保證基因文庫的完整性非常重要。體外包裝是指人為地將重組DNA分子與高濃度噬菌體頭部前體、包裝蛋白和尾部蛋白混合，自動包裝成完整的噬菌體顆粒。包裝蛋白可以自己制備也可以從商家購買。,粘粒（Cosmid） 粘粒又稱柯氏質(zhì)粒，是構(gòu)建真核生物基因文庫的的重要載體。載體所克隆的外源片段通常不超過15-20Kb,然而有些真核基因含有多個內(nèi)含子，長度超過20Kb，為滿足克隆大片段的需要，于是構(gòu)建出粘粒載體。粘粒大小為4-6Kb,而插入片段則可大至29-45Kb。 粘粒是由質(zhì)粒和噬菌體DNA的粘性末端構(gòu)建而成的載體。重組的粘?？蛇M行體

34、外包裝，包裝好的顆粒可有效地感染大腸桿菌，這樣就避開了大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的困難，同時它在宿主菌內(nèi)也可象質(zhì)粒一樣復制增殖。 粘粒是包含cos序列的質(zhì)粒，不能裂解宿主菌形成噬菌斑。在篩選重組子時，菌落篩選比嗜菌斑篩選所需實驗步驟多，一次篩選的菌落數(shù)也遠不及嗜菌斑多。因此，在構(gòu)建基因文庫時，首選噬菌體載體，只有在克隆大片段基因時才選用粘粒構(gòu)建基因文庫。,粘粒在使用方法上與噬菌體載體有所區(qū)別。以粘粒pJB8DNA為例，首先建立兩個酶切反應，分別用HindIII和SalI進行消化。由于這兩個限制酶切位點分別位于cos位點的兩側(cè)，所以切割后便形成了“右邊” cos片段和“左邊” cos片段。用堿性磷酸酶進行處理以

35、去除cos片段的5-末端磷酸基團，以防止載體自連或載體與載體之間的連接。然后對上述去磷酸基團的cos片段反應物再用BamHI進行消化，這樣便可以得到具有BamHI粘性末端的cos片段（一個為大片段，另一個為小片段）。將這兩個大小大片段與MboI或Sau3A部分消化并作了脫磷處理的真核生物DNA（3247Kb）進行混合連接。結(jié)果便會形成一種由“左邊” cos片段、一條長度為3247Kb的插入片段和“右邊” cos片段組成的可包裝的重組DNA分子。轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌后便可以像質(zhì)粒一樣進行復制，并賦予宿主細胞氨芐抗性。,用粘粒載體進行克隆（方法之一）,M13噬菌體載體 M13是一種絲狀的大腸桿菌噬菌

36、體，只感染具有F因子的雄性E.coli，其基因組是一單鏈環(huán)狀DNA分子，全長6407個核苷酸。噬菌體單鏈DNA（+）鏈進入細胞后，便復制出與之互補的（-）鏈DNA，形成復制型雙鏈DNA（RFDNA），RFDNA通過滾環(huán)復制可積累100-200個RF拷貝，與此同時，（+）鏈積累，并被組裝成成熟的噬菌體顆粒，釋放至培養(yǎng)基中，但并不引起細菌裂解。被M13噬菌體感染的細菌生長緩慢，在平板培養(yǎng)基上形成渾濁的 “嗜菌斑”。 不僅M13噬菌體可以侵染細菌，而且其單鏈或RFDNA無需包裝也可直接轉(zhuǎn)化雄性E.coli，這為M13用作基因工程載體提供了極大的方便。,M13 噬菌體載體M13mp18/19圖譜,M1

37、3 噬菌體載體M13mp18/19多克隆位點序列,mp載體系列皆由M13噬菌體改造而來，在M13基因II和基因IV之間的非編碼區(qū)插入LacZ的調(diào)控序列及其N端146個氨基酸編碼序列，以便利用互補對重組子進行藍白斑篩選。在LacZ基因內(nèi)引入一多克隆位點（MCS）以便進行外源基因的克隆。如，M13mp18和M13mp19是一對常用載體，它們的唯一區(qū)別在于LacZ基因內(nèi)的多酶切位點順序正好相反。 由于重組絲狀噬菌體的基因組趨于不穩(wěn)定，因此絲狀噬菌體載體并不用于外源DNA片段的常規(guī)克隆和增殖，主要用來制備已經(jīng)克隆于另一類載體（質(zhì)?；蚴染＃┲械腄NA片段的單鏈拷貝。RF型DNA可以象質(zhì)粒那樣進行分子操

38、作，而單鏈DNA（ssDNA）分子則可以在下列工作中用作摸板：（1）雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定；（2）進行單鏈DNA探針的標記；（3）寡核苷酸定點誘變。,動物病毒載體 病毒載體在昆蟲細胞及哺乳動物細胞的基因工程中應用較多，常見的哺乳動物細胞病毒載體有SV40（猿猴病毒）、BPV（牛乳頭瘤病毒）、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒等；昆蟲病毒載體有桿狀病毒等。 SV40病毒基因組為共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），長5243bp，基因組分早期和晚期兩個功能區(qū)，兩功能區(qū)間含DNA復制起始位點。早期區(qū)在整個裂解周期都被轉(zhuǎn)錄，并通過不同剪切方式產(chǎn)生大T和小t抗原的兩種mRNA；晚期區(qū)僅在DNA復制后才進行轉(zhuǎn)錄

39、，編碼病毒外殼蛋白VP1、VP2、VP3。,完整的SV40病毒粒子不需要改造便可作為克隆載體。一般以早期區(qū)取代與晚期區(qū)取代兩種取代方式構(gòu)建重組子。若晚期區(qū)被取代，則需用早期區(qū)域缺失的SV40突變種作為輔助病毒與之混合感染宿主，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒產(chǎn)生的早期基因產(chǎn)物一起形成完整的病毒顆粒，反之亦然。 直接用SV40作為載體有以下缺點：（1）、容量小，外源片段不大于2.5Kb；（2）、感染宿主范圍有限，只能在猴細胞中復制；（3）、用輔助病毒進行混合感染時，有可能發(fā)生重組產(chǎn)生野生型的SV40帶來危險。 因此，目前絕大多數(shù)實驗室所使用的SV40載體都是經(jīng)過改造的病毒載體質(zhì)粒。如pSV就

40、是由SV40衍生出來的載體系列，同時將tk、dhfr、neo、cat等標記基因與pSV40質(zhì)粒重組，構(gòu)建出適用于不同目的的表達載體(pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr)，這類載體適合在哺乳動物細胞中瞬時表達克隆的外源基因。,目的基因的制備 要實現(xiàn)某一目的基因（靶基因）的表達，首先就必須克隆得到該基因。基因克隆的方法很多，即使是同一類的方法也有可能在技術路線或細節(jié)技巧上有所差異。 目前應用較多的基本方法主要有： 1 基因文庫的建立與篩選； 2 通過聚合酶鏈反應（PCR）方法得到； 3 人工化學合成方法制備。,基因文庫的建立與靶基因的分離 基因文庫（gene library 或

41、 gene bank）主要分兩類：基因組文庫和cDNA文庫，兩者獲取核酸的來源不同。 基因組文庫是通過機械剪切或限制性酶消化將某種生物的基因組切成一定大小的片段，然后與合適的載體（噬菌體載體或粘粒）連接，并導入宿主細胞中進行擴增，從而獲得一群重組DNA克隆的混合物，其中包含了該生物的各種基因或基因組。原核生物和低等真核生物，由于基因結(jié)構(gòu)簡單，基因組文庫可以作為直接提供目的基因的來源。,在高等生物中由于結(jié)構(gòu)基因是由外顯子（exon，蛋白質(zhì)編碼序列）與內(nèi)含子（intron,非蛋白質(zhì)編碼的間隔序列）排列組成的，其轉(zhuǎn)錄物需要經(jīng)過剪接（splicing）去除內(nèi)含子，使外顯子連接加工產(chǎn)生成熟的mRNA，為

42、獲得完整的能直接進行表達的真核生物編碼目的基因，就必須構(gòu)建cDNA（complementary DNA）文庫。 所謂cDNA是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的互補DNA，它是成熟mRNA的拷貝，不含有任何內(nèi)含子序列，可以在任何一種生物體中進行表達。將細胞總mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并獲得克隆，由此得到的cDNA克隆群體便稱為cDNA文庫，它代表了某種生物的全部mRNA序列，即蛋白質(zhì)編碼信息。,構(gòu)建cDNA文庫主要包括以下幾個步驟： （1）、mRNA的分離。真核細胞mRNA分子是單順反子，具5端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3多聚腺苷酸(poly A)尾巴，這為mRNA的提取提供了極大的方便。目前

43、，以利用寡聚脫氧胸苷酸（oligo dT）-纖維素柱層析法提取最為常用，其原理是oligo dT與poly A之間可形成氫鍵，從而將mRNA分子有效吸附。值得注意的是，提取的mRNA愈完整，構(gòu)建的cDNA文庫質(zhì)量也就愈高；其次是，提取的mRNA不能有DNA污染。 （2）、cDNA第一條鏈的合成。利用Oligo-dT或610個核苷酸長的寡核苷酸隨機引物與poly(A)mRNA雜交，形成引物，在反轉(zhuǎn)錄酶AMV或MLV作用下，以mRNA為模板，利用4種脫氧核苷三磷酸（4dNTPS），從引物3端OH基開始合成sscDNA。 （3）、cDNA第二條鏈的合成。堿處理去除DNA/RNA中的mRNA, ssc

44、DNA3 末端自身環(huán)化，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此為引物在E.coliDNA聚合酶I或Klenow片段和反轉(zhuǎn)錄酶的共同作用下，利用4dNTPs完成cDNA第二條鏈的合成。在核酸酶S1作用下，將發(fā)夾結(jié)構(gòu)和另一端的單鏈切除。,（4）、cDNA與載體的連接。最常用的載體有gt10和gt11兩種。它們都具有供外源cDNA片段插入的EcoRI位點。由于合成的cDNA為平頭末端，需在其兩端加上EcoRI連接子，再經(jīng)EcoRI甲基化酶甲基化，以免在酶切產(chǎn)生粘性末端時cDNA內(nèi)部的EcoRI位點被切開。 （5）、噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。若用質(zhì)粒作載體，cDNA與載體連接后可直接轉(zhuǎn)化宿主細胞；若采用噬菌體作載體

45、，必須體外包裝成噬菌體顆粒感染宿主菌。,從cDNA文庫中篩選目的克隆主要有以下方法： （1）、核酸雜交。這是從cDNA文庫中篩選目的克隆的最常用、最可靠的方法。根據(jù)靶蛋白純品的氨基酸序列，合成一組所有可能的簡并寡核苷酸序列，其中至少有一條會與目的cDNA克隆完全配對。用它作為探針可篩選出目的cDNA克隆。 （2）、免疫法。在構(gòu)建cDNA文庫時，選用可使外源DNA表達的載體（如gt10和gt11等），文庫構(gòu)建后，可用靶蛋白的特異性抗體篩選目的cDNA克隆。 除構(gòu)建cDNA文庫外，對于一些高豐度表達、容易純化的蛋白質(zhì)，可以直接通過該蛋白質(zhì)的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再洗脫下編碼該蛋白的特異mR

46、NA，直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行基因克隆，從而直接獲得該特定基因的克隆。,聚合酶鏈反應技術（Polymerase chain reaction，簡稱PCR）,PCR技術由Mullis于1985年創(chuàng)立，1987年獲得專利，1989年被美國著名Science雜志列為十項重大科技發(fā)明之首，1993年獲諾貝爾化學獎。如今，PCR技術已成為分子克隆工作中必備的基本技術之一，并廣泛滲透到醫(yī)學分子基因診斷、法醫(yī)、考古學等諸多領域?？梢哉fPCR技術發(fā)明給整個生命科學都帶來了一場革命，同時也為目的基因的快速克隆提供了一種有效的手段。,PCR基本原理 PCR技術可在短時間內(nèi)于試管中獲得數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝

47、。它實際上是在欲擴增的目的DNA的兩側(cè)設計一對正向和反向引物，在模板DNA以及四種脫氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的條件下由TaqDNA聚合酶所引導催化的DNA擴增酶促反應。 PCR由三個基本反應組成： （1）高溫變性（denaturation）:通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA； （2）低溫退火（annealling）:使溫度下降，引物與模板DNA中所要擴增的目的序列的兩側(cè)互補序列進行配對結(jié)合； （3）適溫延伸（extension）：在TaqDNA聚合酶、4dNTP s及Mg2+存在下，引物3端向前延伸,合成與模板堿基序列完全互補的DNA鏈。以上變性、退火和延伸便

48、構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，數(shù)小時之后（約25-30次循環(huán)），介于兩引物間的目的DNA片段便可擴增105-107拷貝。,由此可知，我們可以利用目的基因兩側(cè)的核昔酸序列，設計一對和模板互補的引物，十分便捷地以基因組、或己克隆在某一載體中的基因為模板擴增出所需的目的基因片段。如以真核生物總為模板則可獲得無內(nèi)含子及不帶調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)基因。此外，通過在引物的端添加額外的與模板不互補的所需序列，如限制性酶切位點、起始密碼子、核糖體結(jié)合位點、啟動子、終止密碼及終止子等，便可以將其引入目的基因中，從而方便進行目的基因的克隆、表達與調(diào)控研究。,PCR反應的影響因素 影響PCR反應的因素

49、很多，概括起來主要有以下幾種： （1） 引物。它在整個PCR擴增體系中占有十分重要的地位，為了提高擴增效率和特異性，一般遵循下列原則：A、引物長度以15-30核苷酸為宜，過短會使特異性降低，過長則成本增加，且也會降低特異性；B、堿基應盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量應在45-55%左右；C、引物內(nèi)部無發(fā)夾結(jié)構(gòu)（發(fā)夾是指發(fā)夾柄至少有4個堿基，而發(fā)夾環(huán)至少有3個堿基）這種結(jié)構(gòu)尤其應避免在引物3端出現(xiàn)。D、兩引物間應避免出現(xiàn)二聚體，因為一旦出現(xiàn)二聚體，引物就不能很好地與模板結(jié)合（二聚體是指引物序列之間至少有5個以上的堿基互補配對），尤其在引物3端不應有2個以上堿基互補；E、

50、引物3端最好選A，其次選G、C，而不要選T；F、引物5端可加上限制性酶切位點及保護堿基，以便擴增產(chǎn)物進行酶切和克隆。,（2） 模板。單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）以及由RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA均可作為PCR模板。模板DNA可是線性分子也可是環(huán)狀分子，然而前者略優(yōu)于后者。PCR對模板純度要求不嚴，樣品可以是粗提物，但不可混有任何DNA聚合酶抑制劑、核酸酶、蛋白酶及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。尿素、SDS、甲酰胺等也會嚴重影響PCR反應效率。此外應避免交叉污染。 （3） Mg2+濃度。TaqDNA聚合酶是一種Mg2+依賴酶，因此，反應體系中必須有Mg2+存在，然而保持適當?shù)腗g2+濃

51、度十分重要，因為Mg2+濃度過高或過低均會影響引物與模板的結(jié)合、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的形成以及酶的活性與精確性。 （4） TaqDNA聚合酶。Taq酶的添加量必須適當,如過高會增加非特異性產(chǎn)物擴增，而酶量過低則又會降低產(chǎn)物量。此外，為了保證產(chǎn)物的正確率，可以采用高保真酶如Pfu酶、High-fidelity Taq酶等。,（5） 溫度循環(huán)參數(shù)。 PCR涉及變性、退火、延伸三個不同溫度和時間，每步反應時間不宜過長，以免降低TaqDNA聚合酶活性。 變性溫度和時間一般為94和1分鐘,溫度過高、時間過長會降低TaqDNA聚合酶活性，破壞dNTP分子； 退火的溫度和時間取決于引物的堿

52、基組成、長度、引物與模板的匹配程度以及引物的濃度, 典型的退火溫度和時間為50和1-1.5分鐘。 延伸的溫度一般為72，接近TaqDNA聚合酶的最適反應溫度75。延伸時間與待擴增片段長度有關，一般1Kb以內(nèi)的片段，延伸時間為一分鐘，如擴增片段更長，則可適當延長時間。最后一次循環(huán)的延伸時間一般都再適當延長（7-10分鐘），以便所有PCR擴增產(chǎn)物合成完全。 以上參數(shù)確定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA濃度。一般循環(huán)25-35次為宜，循環(huán)次數(shù)過多會使PCR產(chǎn)物嚴重出錯，非特異性產(chǎn)物大大增加。,人工合成基因 自從1983年美國ABI公司研制的DNA自動合成儀投放市場以來，通過化學合成寡核苷酸鏈獲

53、得某些真核生物小分子蛋白或多肽的編碼基因已成為一種重要的基因克隆手段。然而，由于DNA自動合成儀只能合成單鏈的寡核苷酸鏈，如何才能獲得雙鏈的目的基因DNA呢？最簡單的辦法就是首先利用化學合成法分別合成兩條互補的寡核苷酸鏈，然后讓這兩條鏈在適當條件下退火，形成雙鏈。但是這種方法僅限于合成組裝較短的基因(60一80bp)，這是由于隨著寡核苷酸鏈合成長度的增加，出錯率也會增加，同時產(chǎn)物的得率也會下降。為了獲得較長的雙鏈DNA，人們嘗試采用了多種人工基因組裝方法,一種方法是先將設計好目的基因進行分段, 每一片段間設計成4-6個bp互補的粘性末端, 寡核苷酸鏈合成后先以T4多聚核苷酸激酶對其5端進行磷酸

54、化, 彼此對應互補的寡核苷酸鏈退火后再以T4DNA連接酶連接,另一種方法是合成一套包括一系列具有重疊區(qū)域的短的(約40一100bp) 寡核苷酸鏈，在適當條件下退火，這樣就得到了包括全長基因、但每條單鏈上都有缺失的雙鏈DNA，然后再用E.coliDNA聚合酶補足缺失的片斷，并用T4DNA連接酶將它們之間的切口連接起來就得到了完整的目的基因。,重組子的構(gòu)建 目的基因必須與載體連接形成一種重組DNA分子，并轉(zhuǎn)入相應的宿主細胞后才能實現(xiàn)目的基因的克隆與表達。根據(jù)目的基因片段的來源與類型不同，可以采取不同的連接策略，目前應用較多的連接方式大致分為三種：粘端連接，平端連接和T-A克隆。,粘端連接 粘端連接

55、是指目的基因與載體之間具有彼此互補的粘性末端，在較低的溫度下可以形成氫鍵，再通過T4DNA連接酶便可以連接成完整的重組DNA分子。 為了讓基因連接入載體之后保持正確的方向，因此連接時一般采取定向克隆的策略，即對基因和載體分別采用不同的限制性酶進行切割，這樣載體就無法自連，且外源基因只能按照正確的方向插入載體才能形成重組DNA分子。 有時限于條件如果只能用一種限制酶對基因和載體進行切割，為了防止載體自連酶切后可以先對載體進行脫磷處理，即用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）或細菌堿性磷酸酶（BAP）對其進行處理，脫除其5磷酸基團，這樣并不影響其與目的基因的連接。 為了方便重組子的篩選，有時將外源基因插入載

56、體的某個選擇性標記基因使其失活，這種策略稱為插入滅活法。,平端連接 有時為了滿足實驗設計的需要，必須進行DNA的平齊末端之間進行連接。這種連接方式的優(yōu)點是給不同分子之間的連接帶來了極大的方便，因為除內(nèi)切酶酶切直接產(chǎn)生的平齊末端分子外，粘性末端通過一定的修飾也能產(chǎn)生平齊末端。然而，與粘性末端相比，平齊末端的連接效率較低。因此，在進行平齊末端連接時一般需加入更多的T4連接酶（一股為粘端連接的10-100倍）,同時適當提高底物濃度。,TA克隆 TA克隆是一種直接將PCR基因產(chǎn)物進行快速克隆的方法，這一方法省略了諸如用 Klenow 酶或T4多聚激酶對PCR產(chǎn)物進行修飾的酶法修飾過程，大大提高了克隆效

57、率。其原理是，在PCR反應過程中熱穩(wěn)定聚合酶（即Taq聚合酶）可以向PCR產(chǎn)物的3 末端加上一個不依賴于模板的腺苷酸（A）。利用這些末端突出的3 A，即可將PCR產(chǎn)物直接插入到插入位點只有一個3 T突出的線性T載體分子。這種方法只限于PCR產(chǎn)物的克隆，且必須采用3 T突出的T-載體（如 Promega公司的pGEM-T載體等）。,pMD18-T 由pUC18 載體改建而成，它消除了pUC18 載體上的多克隆酶切位點，再在pUC18 載體的多克隆酶切位點處導入了EcoRV 酶切位點，使用EcoR V 進行酶切反應后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA 聚合酶進行PCR 反應時都有

58、在PCR 產(chǎn)物的3末端添加一個“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR 產(chǎn)物的連接、克隆效率。 本載體盡管消除了LacZ基因上的多克隆酶切位點，但不影響 -半乳糖苷酶的正常表達，因此，PCR 產(chǎn)物克隆后仍可以利用 -互補性進行藍白菌落的篩選，挑選陽性克隆。 由于本載體上消除了多克隆酶切位點，克隆后的PCR 產(chǎn)物將無法使用載體上的限制酶切下，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。此時如果使用PCR 擴增引物導入的酶切位點進行DNA 酶切時，酶切反應將不會受到T 載體上其它多克隆酶切位點上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。 由于本載體以pUC18 載體為基礎構(gòu)建而成，

59、所以它具有同pUC18 載體相同的功能。,基因?qū)爰夹g 重組分子必須導入合適的宿主細胞中才能進行復制、增殖和表達。根據(jù)不同的轉(zhuǎn)移對象與宿主類型，目前已發(fā)展出許多種轉(zhuǎn)移方法，下面主要介紹一些常見的和有代表性的方法。,基因?qū)胛⑸锛毎?轉(zhuǎn)化(transformation）是指微生物細胞直接吸收外源的過程，而通過轉(zhuǎn)化接受了外源DNA的細胞稱為轉(zhuǎn)化子。在分子克隆中，宿主細胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感細胞才能用于轉(zhuǎn)化，這時的細胞稱為人工感受態(tài)細胞。Cohn（1972）證實，將細菌處于0的CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球型（感受態(tài)），經(jīng)短時間熱沖擊后，細胞可吸收外源DNA，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原，并分裂增殖。在選擇性平板上即可選出轉(zhuǎn)化子。Ca2處理的感受態(tài)細胞，般每微克DNA可獲得107-108個轉(zhuǎn)化子。此外，還發(fā)展出氯化鈣氯化蜘法、氯化鈣氯化錳法、氯化鎂法等。 除化學法轉(zhuǎn)化細菌外，還可采用高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預先誘導細菌的感受態(tài)，